文摘
目的。心房颤动(房颤)是临床最常见的心律失常。房颤的发病机制还不清楚。因此,探讨房颤的分子信息显示房颤治疗的重要性。方法。GSE2240数据获得的基因表达数据库综合(GEO)。R limma软件包被用来屏幕度。基于基因本体论(去),京都基因和基因组的百科全书(KEGG)和基因集富集分析(GSEA)数据库,我们进行了功能和通路富集分析。然后,字符串和Cytoscape软件被用来构建蛋白质相互作用(PPI)网络和屏幕中心的基因。最后,我们利用细胞计数Kit-8 (CCK-8)实验探索中心的影响基因击倒在房颤的增殖细胞。结果。906个差异表达基因(度),包括542年显著调节基因和364年大幅下调基因,筛选在房颤。AF的基因主要富集在血管内皮生长factor-activated受体活性,丙氨酸,组蛋白脱乙酰酶的活动,调节和HCM。PPI网络的显著调节度包含404个节点和514个边缘。五个中心基因,ASPM,迪泰,STAT3 ANLN,和CDCA5 PPI网络来确定的。PPI网络由显著表达下调的基因包含327个节点和301个边缘。四个中心的基因,CDC42 CREB1,基于“增大化现实”技术,和SP1 PPI网络来确定的。CCK-8实验的结果证明,推倒CDCA5基因的表达可以抑制H9C2细胞的增殖。结论。生物信息学分析显示中心基因和房颤的主要途径。这些基因和通路为研究发病机制提供信息,治疗和预后的房颤和有潜力成为房颤治疗的生物标志物。
1。背景
心房颤动(房颤)是最常见的心律失常;其发病率继续上升,达到10%(75年1]。房颤的心房激活频率是300 - 600次/分钟(2]。房颤患者的心跳频率通常比正常人更快、更不规则,有时多达100 - 160次/分钟。房颤的患病率也伴有其他疾病,如冠心病、高血压和心力衰竭(3]。房颤患者主要是老年人,常见的诱发因素包括风湿性心脏病、冠心病、甲状腺机能亢进、中风、血栓栓塞、心脏衰竭(4]。中风是房颤的最大危险之一。在非瓣膜性房颤患者的中风发病率是普通人的5.6倍,瓣膜房颤患者的17.6倍,和大脑造成房颤是17.6倍。中风的后果更严重的(5]。房颤的早期症状包括心悸、疲劳、头晕、胸部不适,气短6]。房颤也可以引起严重的发病率和死亡率。2017年,全球有3757万例房颤患者,房颤305万例新病例,287000人死亡。目前,医学仍然是主要治疗房颤患者,可恢复窦性心律,减少心室率,预防血栓栓塞并发症(7]。非药物治疗房颤的方法包括电转换(窦性心律的转换),迷宫射频消融术治疗和外科手术(完全彻底治疗房颤)[8]。
房颤的没有统一的分类。根据其持续时间,它包括阵发性、持续性和永久性房颤(9]。人们普遍认为,阵发性房颤是指那些可以self-convert 7日内窦性心律,通常只持续不到48小时。持续性房颤是指那些持续超过7天,需要药物或电击转化为窦性心律。永久性房颤是指那些不能转为窦性心律或复发后24小时内转换。根据潜在的心脏疾病的存在与否,它分为病理和特发性房颤(临床检查没有潜在的心脏疾病)。特发性房颤,有时被称为孤独的房颤,通常发生在低于50岁(10]。房颤的病因是多因素疾病,其发病机制尚不完全明确。近年来,许多研究人员试图找到房颤中心基因通过微阵列技术和关键途径。中心基因和信号通路在房颤的发展仍然知之甚少。
微阵列数据的结果的逐步应用人类基因组计划(HGP)和分子生物学的快速发展,导致基因组研究的发展,如基因组、转录组和蛋白质组(11,12]。其优点是它节省了艰苦的实验和昂贵的试剂。然而,当前的微阵列技术仍有发展的空间。新兴的愿望之一是多个步骤的操作和反应能力。生物信息学是一个多学科研究方法的生物问题,除了传统的生物学和化学方法通常用来解决生物问题[13]。它是描述的技术收集和分析大量的生物数据使用计算机系统。生物信息学分析的许多核心技术依赖于统计和收集大量的数据通常来自不同实验和实验室。生物信息学的应用包括DNA序列分析、基因表达和调控,比较不同生物基因组生物信息学(14]。通过染色体微阵列分析(CMA) DVL1,滑雪,STIM1, CTNNA3,和PLN被确认为相关候选基因表型的先天性心脏病(CHD),这提高了诊断冠心病的孩子。基于circRNA微阵列分析,发现circPDS5B和circCDC14A可以用作生物标记物诊断和预测急性缺血性中风的预后。
本研究采用生物信息学分析,获得中心基因和关键路径与房颤相关。微阵列配置文件数据集GSE2240从基因表达综合下载(GEO)数据库为研究对象。最后获得中心基因和通路对房颤具有重要意义,基于细胞计数Kit-8 (CCK-8)实验中,我们证实了基因和AF细胞增殖中心之间的关系。这个策略有利于以前被忽视的基因的发现,这些发现可能为优化房颤的治疗提供新的视角。
2。材料和方法
2.1。微阵列数据
基因表达综合(GEO) (http://www.ncbi.nlm。http://nih.gov/geo)是一种最常用的排序(芯片)数据库的国家生物技术信息中心(NCBI) (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)[15]。公共存储库,可以自由归档和分发提交的完整的一套微阵列科学界,下一代测序,和其他形式的高通量功能基因组学数据。我们下载基因表达谱GSE2240从地理数据库。这个平台我们用于GSE2240 GPL97 [HG-U133B] Affymetrix人类基因组U133B数组。房颤患者的样本GSE2240包含10和20人窦性节律。
2.2。数据处理
下载后基因表达谱GSE2240,我们使用R语言软件来分析和处理数据库。当基因的阈值值< 0.01,他们选为差异表达基因(度)。同时,当日志2(褶皱变化)大于0,度被选为显著调节基因,当日志2(FC)小于0,度被选为显著表达下调的基因。
2.3。基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)浓缩度的分析
(http://www.geneontology.org)是一种广泛使用的生物数据库,分为三个独立的本体,即生物过程(BP),分子功能(MF)和细胞组件(CC) [16]。KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)用于基因功能的综合分析基础知识(17]。基因组信息可以与高阶功能信息和保存在数据库的基因,这是基因的集合所有的目录和部分基因组的全基因组测序为新更新的注释。显著的调节和表达下调去KEGG浓缩度进行了分析,分别通过数据库进行注释,可视化和综合发现(DAVID v6.8https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)[18]。
2.4。蛋白质相互作用网络分析(PPI)度
检索的搜索工具相互作用基因(字符串v11.0,https://string-db.org/)数据库之间的交互识别蛋白质实验的基础上,数据库、文本挖掘、预测生物信息学。交互的分数超过0.4设置为标准的价值。然后,Cytoscape (v3.6.0)软件是用于分析PPI网络。分数最高的基因节点和连接性最强的是选为中心的基因。
2.5。基因集富集分析(GSEA)
GSEA使用两种类型的基因差异表达的排名学位样品测试是否预设基因集丰富等级表的顶部或底部和解释生物信息从另一个角度。的分子签名数据库(MSigDB)是利用基因集富集分析(GSEA v3.0,http://www.broadinstitute.org/gsea/)。
2.6。细胞培养
我们第一次购买AF细胞(H9C2)从美式文化集合(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),然后把细胞群10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco;热费希尔科学,Inc .)然后把湿盒里含有5%的股份有限公司2为培养和维持在37°C。
2.7。细胞转染
我们购买的核和消极的控制(si-NC)从Sangon(上海,中国),在核用于击倒CDCA5中心基因的表达。之后,H9C2细胞被注入6-well板和转染Lipofectamine 2000(加州英杰公司)根据制造商提供的操作步骤。
2.8。CCK-8化验
为了衡量基因表达对细胞增殖的影响,CCK-8试验(猫。不。HY-K0301;MedChemExpress)。我们第一次添加H9C2细胞96孔板的密度 然后倒了10μl CCK-8解决方案到每个。一段时间后,24日,48,72,和96个小时中,我们使用一个微型板块读者(BMG Labtech GmbH)来测量光密度在450 nm (OD)的解决方案。
2.9。统计分析
所有实验进行了一式三份。这个实验的结果提出了 (SD)和SPSS 17.0(美国SPSS Inc .)是用于数据分析。这是判断显著时 。
3所示。结果
3.1。的识别度
我们用R语言GSE2240软件分析和过程数据库。所包含的基因表达谱GSE2240房颤患者的心肌样本( )与窦性心律和对照组( )。我们筛选度基于值小于0.01。热量地图所示的处理结果;我们获得了906度,其中包括542调节基因和364个表达下调基因(图1)。排名前十的表达下调度和十大调节度如表所示1。
3.2。调节基因和通路富集分析
根据大卫富集分析结果在线数据库数据所示2和3。十大丰富了BP的调节有丝分裂度是退出的监管,神经节苷脂代谢过程,调节全身动脉血压的激素,细胞定位,自然杀伤细胞激活,peptidyl-lysine trimethylation,鞘糖脂分解代谢的过程中,4-hydroxyproline代谢过程,低聚糖降解过程,和interleukin-23-mediated信号通路(图2(一个))。CC,调节度主要是富含网格蛋白的外套,细胞核周围的内质网,微管minus-end,有丝分裂纺锤体,ionotropic谷氨酸受体复杂,有丝分裂纺锤体,INO80-type复杂,微管,树突膜,和-复杂(图2 (b))。MF,房颤的调节度是主要分布在二酰基甘油激酶活动方面,rac guanyl-nucleotide交换因素活动,磷脂酰肌醇磷酸磷酸酶活动,羟甲基-甲酰转移酶活动相关,alpha-N-acetylneuraminateα2,8-sialyltransferase活动,SH3域绑定,aldehyde-lyase活动,磷脂酰肌醇磷酸4-phosphatase活动,和血管内皮生长factor-activated受体活动(图2 (c))。最显著富集的通路调节度分析KEGG HIF-1信号通路分析,一个碳池的叶酸,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢尼古丁上瘾,苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成,乙醛酸和dicarboxylate新陈代谢,突触囊泡循环,肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS),霍乱弧菌感染,磷脂酰肌醇信号系统(图2 (d))。
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3.3。去表达下调的基因通路富集分析
去和KEGG分析被认为是强大的工具为揭示基因组的生物机制或功能通路或转录观测模式。十大丰富了BP的表达下调度是modification-dependent蛋白质分解代谢的过程中,蛋白质的定位不动的纤毛,肌肉细胞分化,积极的脱乙酰酶活动的监管和内皮细胞迁移,铁离子运输,调节突触大会,组蛋白脱乙酰酶的活动,调节蛋白质monoubiquitination和骨骼肌组织发展(图3(一个))。CC,表达下调度主要富集在去核异染色质,核小,内质网质量控制舱,异染色质,Cul3-RING泛素连接酶复杂,常染色质,液泡,主轴midzone、粘着斑,核体(图3 (b))。MF的表达下调度主要富集在铁离子的跨膜运输活动,ubiquitin-protein连接酶活动,ubiquitin-protein转移酶活动,methylation-dependent蛋白质绑定,草酸跨膜转运活动,ubiquitin-like蛋白连接酶活动,DNA结合转录监管区域,硫酸跨膜转运活动,甲基化组蛋白绑定,和3 ,5 - - - - - -环磷鸟苷磷酸二酯酶活性(图3 (c))。最明显的途径表达下调度分析KEGG分析矿物质的吸收,非酒精性脂肪肝病(NAFLD), AMPK信号通路,紧密连接,肥厚性心肌病(HCM), T细胞受体信号通路,昼夜节律,维生素B6新陈代谢,剪接体,促性腺激素信号通路(图3 (d))。
3.4。信号通路与曼氏金融相关的基因
我们进一步开展GSEA GSE2240数据库。这是房颤患者观察到这些基因从10与aldosterone-regulated钠重吸收(图呈正相关4(一)),嗅觉传导(图4 (b)),精氨酸和霍乱弧菌感染(图4 (c))信号通路而与窦性节律基因从一个人。
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3.5。PPI网络分析的调节基因
我们使用选定的调节度建立PPI网络,和Cytoscape软件被用于分析PPI网络。404个节点和514个蛋白质对获得的总得分> 0.4基于字符串的数据库(图5)。度越高,更紧密地与房颤相关的基因。该模型( ),迪泰( ),STAT3 ( ),ANLN ( ),和CDCA5 ( )被确定为关键的调节基因。此外,箱线图所示图,该模型的表达水平,迪泰,STAT3 ANLN, CDCA5心肌组织的AF明显高于心肌组织的窦性心律(数字6(一)- - - - - -6 (e))。我们可以总结ASPM,迪泰,STAT3 ANLN, CDCA5调节中心基因的房颤。
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3.6。PPI网络分析的表达下调的基因
同时,我们使用选定的表达下调度构建PPI网络,和Cytoscape软件被用来分析PPI网络。327个节点和301个蛋白质对获得的总得分> 0.4通过字符串数据库(图7)。CDC42 ( ),CREB1 ( ),基于“增大化现实”技术( ),和SP1 ( )被确定为关键基因表达下调。箱线图所示图,CDC42的表达水平,CREB1, AR, SP1房颤的心肌组织中显著低于在心肌组织中窦性节律(数字8(一个)- - - - - -8 (d))。我们可以总结CDC42 CREB1, AR, SP1是房颤的表达下调基因中心。
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3.7。CDCA5击倒阻止细胞增殖
的基础上探索的影响基因H9C2扩散中心,我们撞倒中心通过核基因的表达。如图9(a), CDCA5基因击倒阻止H9C2扩散比负控制(si-NC)。
4所示。讨论
房颤占约三分之一为心律失常住院,是最常见的心律失常19]。许多研究人员认为,炎症,内分泌失调,和心血管疾病,如瓣膜糖尿病、高血压、充血性心力衰竭、心肌梗死和遗传因素,“监管者”,可以诱发房颤(20.,21]。其中,遗传因素在AF瘤形成关键功能。多基因遗传的债务AF估计为0.62。生物信息学研究的重点主要体现在两个方面:基因组学和蛋白质组学(22]。它是科学的维护、检索和研究生物信息使用计算机作为工具在生命科学的研究。根据生物分子在基因调控的作用,人类疾病的诊断和治疗的内部法律描述(23]。它的研究目标是揭示基因组信息结构的复杂性和遗传语言”的基本定律,解释生命的遗传语言。生物信息学已成为整个生命科学发展的重要组成部分,已成为生命科学研究的前沿24]。
基于GSE2240数据库,906度与房颤相关过程被识别。为了进一步分析度的潜在机制,我们进行了功能性和通路富集分析。我们的研究结果发现血管内皮生长factor-activated受体活性和丙氨酸是调节度的显著富集的通路。Mezache等人指出,血管内皮生长因子对心脏的影响是多方面的。炎症,血管渗漏和相关组织水肿的常见后遗症是房颤(25]。丙氨酸组成蛋白质的基本单位,是人类蛋白质的20种氨基酸。丙氨酸的作用是产生糖膳食蛋白质。度使之抑制组蛋白脱乙酰酶活动的监管和肥厚性心肌病(HCM)是重要的强化途径。埃文斯等人的研究表明,组蛋白脱乙酰酶活性显著调节心脏重构模型,患心脏疾病的风险,如房颤、心肌梗死、心肌衰竭(26]。许等人发现房颤是最常见的持续性心律失常HCM患者。HCM患者房颤有调节因心力衰竭和中风的发病率和死亡率。HCM患者更容易出现房颤,房颤的存在是与发病率和死亡率的增加有关27]。总之,度可能影响的活动由血管内皮生长因子受体激活,丙氨酸的合成,组蛋白脱乙酰酶活动的监管,最终导致房颤的进展。
通过PPI网络分析,我们发现,与房颤相关的基因最ASPM,迪泰,STAT3, ANLN, CDCA5, CDC42, CREB1, AR, SP1。该模型的全称是纺锤体微管装配因素。ASPM-related疾病主要包括5头小畸型和常染色体隐性头小畸型(28]。去注释相关基因包括绑定和钙调蛋白绑定。这个基因的假字EHBP1是至关重要的。Szczepanek等人研究STAT3最初识别作为一个IL-6-induced急性期基因转录激活。正常的心脏功能需要STAT3的表达。STAT3的表达转录因子在心脏有保护作用,减少活性氧(29日]。SP1蛋白质编码基因是与亨廷顿氏舞蹈症和胚胎性癌30.]。toll样受体信号通路和G-beta伽马信号是它的相关途径。去注释包括DNA结合转录因子活性和sequence-specific DNA结合。的作用机制中心基因及其表达水平之间的相关性和房颤的临床参数需要进一步研究。
5。结论
本研究使用系统的生物信息学分析获得与房颤相关的关键基因和关键通路。作为一个研究对象,微阵列配置文件数据GSE2240地理数据库中获得。共有542个调节度和364度使之抑制。去,KEGG GSEA分析是用来分析度的潜在功能。基于PPI网络中心基因被确定,包括ASPM,迪泰,STAT3, ANLN, CDCA5, CDC42, CREB1, AR, SP1。这些关键基因和关键途径有助于房颤研究进展,可以作为房颤潜在生物标志物诊断,治疗和预后。不仅如此,我们还发现推倒CDCA5抑制房颤的增殖细胞的表达(H9C2)。这些研究结果将有利于诊断和治疗房颤的发展。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
没有报告的作者潜在的利益冲突。
作者的贡献
王Yanzhe和沈邱姓设计研究。Yanzhe Wang Wenjuan Cai,和雪峰进行本文研究和起草。Liya顾Yanzhe Wang Wenjuan Cai,邱姓沈进行数据采集,数据分析和解释。结果和讨论的所有作者同意负责所有方面的工作。所有作者阅读和批准最终的手稿。Yanzhe Wang Wenjuan Cai, Liya顾同样起到了推波助澜的作用。