低分子肝素的功效在子痫前期通过抑制细胞凋亡的滋养层通过p38MAPK信号通路

文摘

客观的。探讨低分子肝素的功效在子痫前期通过抑制细胞凋亡的滋养层通过p38MAPK信号通路。方法。子痫前期大鼠模型建立,低分子肝素对子痫前期的影响通过p38MAPK信号通路分析基于干预大鼠的不同组合的低分子肝素和p38MAPK信号通路激活。此外,滋养层的缺氧/复氧模型建立了体外探讨低分子肝素对滋养层的影响通过p38MAPK信号通路。结果。与低分子肝素治疗后,怀孕的大鼠肝素组显著降低血压,24小时蛋白尿,p38MAPK蛋白质含量在胎盘组织和胎盘组织细胞(所有的细胞凋亡率下降 )和显示胎儿老鼠和降低重量(包括 )但显示胎盘的重量无显著变化(所有 )。怀孕的老鼠用低分子肝素治疗和p38MAPK激活显示血压显著升高,24小时蛋白尿,p38MAPK蛋白质含量在胎盘组织和胎盘组织细胞的凋亡率比怀孕的大鼠的肝素组(所有 )轻,少还显示胎儿老鼠和胎儿比肝素组(老鼠 )但没有显示在胎盘的重量差异( )。进一步分析表明,低分子肝素可以保护的生存和迁移滋养层在缺氧/复氧的条件下,减少细胞凋亡(所有 )。结论。低分子肝素能缓解子痫前期通过抑制p38MAPK信号通路和滋养层可以抑制细胞凋亡,促进增殖和迁移。

1。介绍

子痫前期的主要原因是早产的婴儿和产妇和婴儿死亡率。其临床表现包括高血压和胎盘,其发生率约为2% - -5% [1]。目前,一些学者认为,子痫前期与母亲生育年龄和胎盘,和人们普遍认为,子痫前期是由胎盘缺血后再灌注损伤,引起氧化应激,和不平衡的血管生成/抗血管新生因子,并容易导致女性终身心血管和肾脏疾病的并发症,增加6倍的女性患中风的风险(2,3]。

经常使用低分子肝素预防子痫前期,这可以降低子痫前期的发生和减少胎儿死亡4,5]。然而,正如许多研究只关注分析的低分子肝素的功效,它在预防子痫前期的机理尚未完全研究。胎盘滋养层细胞是主要的形式,一个重要的角色在子痫前期的开发和发展6]。有研究表明,低分子肝素可以保护滋养层和维持其功能(7,8]。有趣的是,p38MAPK信号通路的影响类似于低分子肝素(9,10),这表明低分子肝素可能影响子痫前期p38MAPK信号通路。据报道,激活MAPK信号通路是低分子肝素的作用机制在促进滋养层的迁移11]。

本研究分析了低分子肝素对滋养层的影响,探索其治疗机制。

2。材料和方法

2.1。研究对象

六十特定无菌(SPF) Wistar鼠从南方医科大学动物中心,购买与动物许可SCXK(曰)2016 - 0041年,其中包括30名女老鼠8 - 10周大,体重200 - 220 g和30雄性老鼠9至11周大,体重300 - 330克。老鼠在30笼子里长大的雄性老鼠和雌性老鼠在每个笼子在室温20 - 25°C下40%的相对湿度-70%,光/暗周期为12小时,他们被允许自由地喝水。然后,每个女性的阴道栓剂老鼠在第二天进行了分析。所有动物实验进行了以下动物保健和使用委员会批准我们的医院和指导原则的国际医学科学组织理事会(帮助)。

2.2。子痫前期模型的建立

在13^th天在雌性大鼠阴道栓剂的形成后,每一个雌性大鼠的血压测量和记录。然后,30名女老鼠被随机数字表法选择,每个选择雌性大鼠皮下注射200毫克/(公斤·d) L-nitroarginine甲酯(σ公司,美国)连续4天。如果所选的老鼠的血压增加了超过30毫米汞柱,老鼠被认为是成功的建模。使用动物血压计是购自上海Yuyan科学仪器有限公司有限公司

2.3。老鼠的分组和治疗

24的30名女老鼠成功地模仿,他们被分配到一个模型组,低分子肝素干预组(以下简称肝素组)和低分子肝素结合p38MAPK活化剂干预组(以下简称联合治疗组),每组8老鼠。其余10雌性大鼠作为对照组。雌性大鼠肝素组和40静脉注射μL /(公斤d)低分子肝素在15^th天阴道栓剂成立后,在联合治疗组大鼠静脉注射了0.5毫克/公斤p38MAPK活化剂的基础上通过尾静脉治疗的肝素组。老鼠在对照组和模型组与同样体积的生理盐水注入皮下注射低分子肝素。在21日^圣每个老鼠的前一天,怀孕,怀孕的老鼠与3%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉老鼠胎儿和胎盘,胎鼠的数量和重量,胎盘组织细胞的凋亡率记录。低分子肝素钠从葛兰素史克(天津,中国),购买和p38MAPK活化剂(氯化Dehydrocorydaline)从多国评价公司在中国。此外,戊巴比妥钠是购自上海Kefeng化学试剂有限公司,有限公司,和电子天平从北京Jinda阳光科技有限公司有限公司

2.4。高血压和蛋白尿检测

怀孕的大鼠的血压和24小时蛋白尿记录在建模之前,经过15天的怀孕,怀孕和21天,分别和24小时蛋白尿分析使用一个自动生物化学分析仪(SYSMEX bx - 4000全自动生化分析仪)SYSMEX医疗电子(上海)有限公司,有限公司

2.5。检测p38MAPK信号Pathway-Related蛋白质

进行了免疫印迹试验检测p38MAPK水平,以及组织和细胞的蛋白质是采用冻融法提取。蛋白质的浓度决定使用bicinchoninic酸(BCA)方法和调整到4μ克/μl .蛋白质是通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的。最初的电压是90 V, V的电压增加到120年的样品搬到一个适当的位置分离胶。电泳后,蛋白质被转移到膜在100 V 100分钟的恒压,并封锁了60分钟的37°C。随后,细胞膜被5%的脱脂奶粉为未来的免疫反应。膜是孵化主要抗体(1:1000)在4°C的一个晚上,然后用温暖的磷酸缓冲盐(PBS)三次,每次5分钟。洗后,膜与二次孵化抗体(1:1000)在室温下1 h。孵化后,发达国家和固定化蛋白质与电化学发光(ECL)代理。扫描蛋白乐队进行了分析使用一个软件的数量,和相对蛋白质表达水平记录作为乐队/灰度值的灰度值参考。BCA蛋白质工具包、ECL工具包和胰蛋白酶项数为23250,35055年和90058年都购自热科学™,和兔子anti-p38MAPK bcl - 2、bax单克隆抗体,和山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体ab170099项数字,ab185002 ab32503, ab6721都购自Abcam公司在美国。

2.6。Tunel细胞凋亡实验的方法

胎盘组织细胞的凋亡率和绒毛细胞测定使用Tunel方法如下:凋亡细胞的数量和总数量五选定字段在光学显微镜下的细胞数,和细胞凋亡率计算。

2.7。细胞来源

人类绒毛膜绒毛细胞(HTR-8 / Svneo)数量的crl - 3271从美国购买类型文化集合(写明ATCC)培养rpmi - 1640中5%胎牛血清在95%的空气和5%的二氧化碳37°C。

2.8。细胞分组和干预

细胞被分配到一个空白组,缺氧组,肝素组和联合治疗组。除空白组的细胞,细胞治疗的其他组织都与缺氧/复氧(缺氧复氧2小时,4小时)。细胞在肝素组中添加5%肝素和细胞结合组添加5%肝素和5% p38MAPK活化剂。之后,细胞的凋亡和迁移被检测到。

2.9。通过细胞计数细胞增殖测定Kit-8 (CCK8)

总共 细胞被常规播种到96孔板,和10μL CCK8解决方案添加到细胞在24 h, 48 h, h, 72和96 h后培养,分别。每个在450纳米的光密度测量使用标(生物Rad,大力神,加利福尼亚,美国)在每次添加CCK8解决方案。

2.10。测定细胞的迁移和入侵

总共 细胞转移到上层舱,低舱与l - 15中添加10%的边后卫。24小时后,固定化细胞在微孔膜为75%甲醇和结晶紫染色。随后,细胞渗透膜的数量在五选定字段在光学显微镜下观察计算,和三个平行实验。Transwell插入及相关试剂购买从康宁公司(美国纽约)。

2.11。统计分析

在这项研究中,对数据进行统计分析和可视化数据使用Graphpad棱镜8,和测量数据被表示为 。比较在多个团体使用单向方差分析进行,并使用LSD进行回溯测试。此外,皮尔森分析用于相关性分析。 表示一个重要的区别。

3所示。结果

3.1。功效不同的干预措施在子痫前期怀孕的老鼠

与怀孕的大鼠对照组相比,怀孕的大鼠模型组显示明显高于血压和24小时蛋白尿水平(包括 ),大大减少胎儿老鼠,轻老鼠胎儿和胎盘(所有 ),这表明建模是成功的。此外,与低分子肝素治疗后,怀孕的大鼠肝素组显示显著降低血压和24小时蛋白尿水平(包括 )并显示胎儿老鼠的数量和重量的增加但显示胎盘的重量无显著变化( )。在联合治疗组大鼠显示明显高于血压和24小时蛋白尿,减少胎鼠,轻胎儿比肝素组(所有的老鼠 )但没有显示在胎盘的重量差异( )(图1)。

3.2。不同的干预措施对p38MAPK怀孕的大鼠的胎盘组织中蛋白水平

p38MAPK蛋白质水平组胎盘组织的模型,结合组,肝素组和对照组(所有从高到低 )(图2)。

3.3。不同的干预措施对细胞凋亡的影响怀孕的大鼠的胎盘组织细胞

胎盘组织细胞的凋亡和apoptosis-related蛋白质水平(伯灵顿)都是在模型组,结合组,肝素组和对照组(所有从高到低 ),和apoptosis-related蛋白质水平(bcl - 2)中看到他们从低到高(所有 )。相关分析表明,p38MAPK蛋白质的水平与细胞凋亡率显著线性相关,伯灵顿,bcl - 2水平的胎盘组织细胞(所有 )(图3)。

3.4。不同的干预措施对p38MAPK绒毛细胞的蛋白质水平

p38MAPK蛋白质水平绒毛细胞被认为在空白组,肝素组、联合治疗组,缺氧组从低到高(所有 )(图4)。

3.5。不同的干预措施对绒毛细胞的细胞凋亡的影响

绒毛细胞的凋亡率和apoptosis-related蛋白质水平(伯灵顿)都是在缺氧组,结合组,肝素组和对照组(所有从高到低 ),和apoptosis-related蛋白质水平(bcl - 2)中看到他们从低到高(所有 )(图5)。

3.6。不同干预措施的影响绒毛细胞的增殖和迁移

绒毛细胞的增殖和迁移能力的缺氧组、联合治疗组,肝素组和对照组(从低到高 )(图6)。

4所示。讨论

子痫前期的围产期发病率和死亡率的主要原因是孕妇和产妇提供世界各地。胎盘细胞过度死亡与子痫前期的一个重要临床表现女性,导致产妇胎盘功能障碍和诱发血栓形成,流产等。12,13]。低分子肝素可以改善胎盘功能通过增加着床部位的血流量,减少血栓形成(14]。研究表明,低分子肝素能促进血管生成和抑制细胞凋亡的滋养层(15,16]。然而,低分子肝素的的作用机制仍不清楚。本研究发现,低分子肝素能抑制滋养层细胞凋亡和促进增殖和迁移通过抑制p38MAPK信号通路。

在这项研究中,我们构建了子痫前期大鼠模型通过L-nitroarginine甲酯(17),发现老鼠的血压和24小时蛋白尿水平显著增加,胎鼠的数量和重量和胎盘的重量显著降低。此外,我们还发现,大鼠的胎盘组织细胞的细胞凋亡率显著增加,而低分子肝素干预后,这些症状改善。结果与之前的研究结果一致。低分子肝素可以在子痫前期(积极行动18,19]。p38MAPK信号通路被报道与滋养层的生长和迁移。例如,周等人的研究。20.)显示,转化生长因子-β1可以抑制滋养层细胞凋亡引起的汞氯化物通过抑制p38MAPK信号通路,和另一个研究Ebegboni et al。21)也报告说,类黄酮促进了球形干细胞的自我更新和侵犯的滋养层通过抑制p38MAPK信号通路。此外,一项研究由格瓦拉et al。22]还发现heparanase基因的敲除抑制入侵人滋养层通过激活p38MAPK信号通路。肝素也被报道抑制过度流通和猪肺动脉重构通过p38MAPK信号通路,从而缓解肺动脉高压(23]。低分子肝素、肝素的衍生物,也可能通过调节p38MAPK信号通路发挥作用,但到目前为止还没有研究报道。在这项研究中,我们发现,低分子肝素可以抑制p38MAPK信号通路。根据救援实验的设计理念,我们p38MAPK信号通路的激活在低分子肝素的干预下,发现低分子肝素的功效是强烈抑制和胎盘组织细胞的凋亡也显著降低。因此,我们可以得出结论,低分子肝素能缓解子痫前期通过抑制p38MAPK信号通路,可以降低胎盘组织细胞的凋亡。为了进一步验证了低分子肝素对滋养层的影响通过p38MAPK信号通路,我们使用了一个体外hypoxia-reoxygenation模型来模拟滋养层的生活环境在子痫前期患者中,发现低分子肝素可以保护滋养层通过p38MAPK信号通路。

有一些缺陷在这个研究。例如,低分子肝素在抑制的影响只在老鼠p38MAPK信号通路已经被证实,但子痫前期的发病是复杂的,如病情和预后的显著差异之间早发型子痫前期患者和那些晚发性子痫前期。此外,一项研究由Bolnick et al。7)发现,低分子肝素诱发的滋养层细胞外分化表皮生长因子生长因子信号,减少细胞凋亡在氧化应激,这意味着有更多的机制对滋养层低分子肝素的影响,所以需要大量的研究机制的探索。

总之,低分子肝素能缓解子痫前期通过抑制p38MAPK信号通路和滋养层可以抑制细胞凋亡,促进增殖和迁移。

数据可用性

所有的原始数据可以通过联系访问相应的作者是否合格的研究员需要。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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