超表达PIK3R1促进骨形成的调节分化成骨细胞和破骨细胞的形成

文摘

为了提高我们理解上下文中的调节骨形成骨质疏松症,我们筛选差异表达基因在骨质疏松症患者的高、低骨密度的生物信息学分析。PIK3R1越来越被提名是一个关键的中介在成骨细胞和破骨细胞的分化与骨形成密切相关。然而,具体机制PIK3R1影响骨代谢的方式还没有完全阐明。我们打算研究的潜在机制PIK3R1调节成骨细胞分化。因此富集分析进行了差异表达基因。我们注意到,雌激素信号通路,肿瘤坏死因子信号通路,与成骨和破骨细胞分化明显相关,他们在PIK3R1显示浓缩。基于免疫印迹、存在和差异分析在体外,我们发现upregulation PIK3R1增强成骨细胞的分化,就是明证调查osteoblast-related基因水平上升以及活动的高山和ARS,虽然明显降低水平的调查osteoclast-related基因。的差别恰恰相反,对这些PIK3R1 osteoblast-related基因的水平降低,增加osteoclast-related基因的水平。除此之外,在体外实验表明,PIK3R1促进成骨细胞增殖和抑制细胞凋亡,但相反的对破骨细胞的影响。总之,PIK3R1展品osteoprotective通过调节成骨细胞分化的影响,它可以表示为一个有前途的治疗骨质疏松症的目标。

1。介绍

骨质疏松症是由低骨密度(BMD)。不断升级的全球流行的骨质疏松症,全身骨骼疾病,由于其与严重的骨组织结构恶化与(脆弱性)骨折的风险1在老年人中,2,3]。的模式在骨质疏松症的病理结果是破骨细胞分化失衡、骨吸收的破骨细胞激活(4]。到目前为止,没有有效的途径可用于预防和治疗骨质疏松症(5]。

破骨细胞是专门细胞骨再吸收,从而对骨骼的正常发展和重塑至关重要6]。与淋巴细胞和巨噬细胞,旨在消除外国材料,破骨细胞参与破坏宿主组织。这个活动被认为是骨重建生理自体免疫反应。破骨细胞分化是一个复杂、多步骤的过程(7),被多种细胞因子调制(csf, RANKL)、生长因子和激素(8,9]。先前的研究已经发现了一些osteoclast-related转录因子,如MafB NFATc1, MitF [10- - - - - -12]。尽管如此,破骨细胞分化的具体分子机制还有待充分阐明。成骨细胞在骨修复相关部分,这可能是一个有效的骨形成的关键(13]。成骨细胞和破骨细胞之间的通信是在每个阶段观察到的骨重塑。因此调节其相互作用的分子机制是必不可少的在骨细胞生物学以及骨形成和骨内稳态的关键过程(14,15]。

PI3K异质二聚体,由调节亚基(p85)和催化亚基(p110),他们都表达了在多个亚型(16]。p85的形式α,PIK3R1占65 - 75%的细胞内调控子单元(17]。PIK3R1一直被认为是一个关键的中介的分化成骨细胞和破骨细胞与骨形成密切相关(18]。目前,全基因组关联研究表明PIK3R1只是浓缩在骨形成,但小说基因还有待开发。此外,PIK3R1调节骨形成的确切机制还有待阐明。因此,我们解开PIK3R1影响水平的检查osteoblast-related基因和osteoclast-related基因在成骨细胞和破骨细胞分化。我们体现PIK3R1促进成骨细胞的分化,而不是破骨细胞。此外,我们发现PIK3R1抑制细胞凋亡和促进成骨细胞的增殖,但对破骨细胞产生相反的影响。总之,PIK3R1骨形成的监管机构,这可能是一个治疗骨内稳态目标候选人。

2。材料和方法

2.1。数据采集和预处理

人类基因组GSE2208 (Affymetrix U133A数组)从基因表达综合下载(地理,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。GSE2208包括19名妇女(高BMD: 10;低BMD: 9)(临床信息,请参见补充表1)。芯片注释后,调查ID映射到基因符号,探测器没有相应的基因符号被排除在外。进行数据预处理, - - - - - -最近邻(资讯)是用来填补缺失的表达数据,其次是logbase2伸缩。最后,limma包(归一化值< 0.05)。关于一些探针只匹配一个基因符号,探针的平均表达价值计算,视为结论性的基因表达值。为后续分析,差异表达基因(度)。

2.2。富集分析

通过使用clusterProfiler包,功能度的预测的基因本体论(去)基因和基因组的注释和京都百科全书(KEGG)富集分析。阈值明显富集值< 0.05和 。结果绘制了“ggplot2”,只有全球大大丰富条款描述。

2.3。细胞培养

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞,获得来自美国文化集合类型(写明ATCC,美国)。文化条件DMEM(美国生活技术)与10%胎牛血清(美国的边后卫,生活技术),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(生活技术,美国)。264.7 osteoclastogenesis,原始细胞被接受- csf (50 ng / ml)和RANKL (50 ng / ml) 7 d。中全新的3倍(不到48 h)。在一个标准的环境中细胞培养。

小鼠preosteoblast MC3T3-E1细胞从细胞库的访问中国科学院(中国上海)和维护αmem(美国Gibco)。所有媒体都加上10%的边后卫和1%青霉素和链霉素(美国表达载体)。在常规条件下细胞被孵化。诱导成骨细胞分化,MC3T3-E1细胞被凌乱的成骨诱导介质包含标准的生长介质,补充了50 mg / l抗坏血酸,10更易/ lβ甘油磷酸盐,10 nmol / l地塞米松(美国Sigma-Aldrich)。

2.4。碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S (ARS)染色

高山染色,福尔马林固定后(10%)和PBS (pH值7.4)冲洗两次,成骨细胞与高山衬底维护解决方案,萘酚AS-MX(美国Sigma-Aldrich 0.1毫克/毫升),和快速的紫色B盐(美国Sigma-Aldrich 0.6毫克/毫升)在0.1 M Tris-HCl (pH值8.5)。此外,高山活动由LabAssay化验高山工具包(Wako、日本)和PBS和成骨细胞两次冲洗后在哺乳动物细胞溶解蛋白质提取试剂(美国皮尔斯)规范。除此之外,蛋白质用BCA量化分析工具(美国皮尔斯)是根据制造商的协议实现。

ARS染色,细胞与PBS冲洗两次,然后固定在10分钟2%甲醛,紧随其后的是30分钟的细胞染色ARS 0.2%解决方案在37°C。每一个好与蒸馏水冲洗3次,如图所示。ARS红染色表明钙沉积。

2.5。RNA隔离和存在

RNeasy迷你包(试剂盒、德国)是用于RNA隔离。互补DNA(互补)是由相对地抄录在上标三世第一链RNA合成系统(生活技术,日本)。存在进行第一步+实时PCR系统(美国生活技术)和快速SYBR绿色主人混合(美国生活技术),β肌动蛋白作为内部参考。引物序列表中列出1。

2.6。西方墨点法

蛋白质提取来自成骨细胞和破骨细胞的老鼠。匀浆提取在radioimmunoprecipitation分析缓冲区(美国皮尔斯);然后,超声仪器被用来完成细胞溶菌作用。溶菌产物受到在4°C 12000转离心5分钟。随后50。μg总蛋白质在每个样本解决10% sds - page,其后被electrotransferred到PVDF膜半干的记事簿(美国Bio-Rad)。然后,膜密封1 h和5%脱脂奶粉,然后一夜之间孵化主要抗体在4°C,其次是孵化二级抗体。表列出了抗体用于免疫印迹2。

2.7。细胞转染

稳定击倒(pLKO.1) PIK3R1向量获得Vigene生物科学(美国罗克维尔市)。Lipofectamine 2000(美国加州英杰公司)实施中转染短hairpin-PIK3R1 (sh-PIK3R1)。24小时后,细胞被收获,受到中存在和免疫印迹,以评价转染效果。生成overexpression-PIK3R1 (oe-PIK3R1)慢病毒,Lipofectamine 2000被用来使转染3.6μg信封质粒,9μg包装质粒,12μg目标质粒进入细胞。48小时后,获得了慢病毒和过滤。sh-NC和oe-NC控制sh-PIK3R1 oe-PIK3R1,分别。

2.8。分析细胞增殖的

转染后, 细胞被播种到96孔板和10μl细胞计数kit-8 (CCK-8)试剂(Dojindo实验室、日本)添加在24日,48岁,72年、96年和120年h。标仪(美国热费希尔科学)是用于量化为450 nm。

转染后细胞放入48-well板块。EdU试剂(美国Sigma-Aldrich)被添加到每个在24小时。2 h后,细胞受到15分钟解决4%的甲醛和特里同x - 100处理0.5%透化作用。接下来,阿波罗反应混合物是下降到每个好,赫斯特33258年用于细胞染色。

2.9。细胞凋亡的检测

首先, 转染后细胞在PBS冲洗两次,随后在100年再悬浮μl绑定缓冲。接下来,5μl膜联蛋白V-FITC和10μlπ被用于染色的15分钟50μg / ml核糖核酸酶(美国Sigma-Aldrich),其次是1 h的细胞在黑暗孵化器的孵化。流式细胞分析仪(Becton, Dickinson和公司、美国)被用于细胞检测。FlowJo软件(美国亚什兰)是用于数据分析。可行的凋亡细胞的数量被计算的百分比计算膜联蛋白V + /π-细胞。的数量不能存活的凋亡细胞被计算的比率计算膜联蛋白V + / PI +细胞。坏死细胞的数量计算,计算膜联蛋白V - / PI +细胞的比例。膜联蛋白V /π-细胞视为可行的细胞(19]。

2.10。数据处理

所有数据都表示为 和加工软件v.8.0 GraphPad棱镜(美国)。所有的独立实验重复3次,包括生物复制和3技术复制。学生 - - - - - -测试或单向方差分析(方差分析)与图基的事后测试相应的执行。考虑显著性差异 。

3所示。结果

3.1。骨质疏松症患者的筛选度高和低BMD

为了探测度在高/低BMD患者骨质疏松症,我们分析了GSE2208数据集的数据。GSE2208包括19名妇女(高BMD: 10;低BMD: 9)。通过微阵列数据处理,确定了756度高、低BMD组(图1)。

3.2。浓缩度分析和选择目标基因

随后,度受到富集分析。注释在756度的结果中描述数据2(一个)- - - - - -2 (c)。度主要显示浓缩过程相关的细胞组件(CC)等的监管RNA拼接,mRNA加工、组蛋白修饰、SMAD蛋白信号转导(图2(一个))。关于生物过程(BP),他们主要富集在转移卤组、核斑点和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复杂(图2 (b))。分子功能(MF)、度主要是富含蛋白质糖基绑定,磷酸酶绑定,SMAD绑定(图2 (c))。

度被受到KEGG信号为这些度富集分析来揭示通路。提出了图2 (d)度主要富集在细胞凋亡,雌激素信号通路,破骨细胞分化和肿瘤坏死因子信号通路。接下来,基因与上述途径是分割的,和安全系数,小君,PIK3R1获得(图2 (e))。其中,安全系数和小君已经被广泛研究骨质疏松症。PIK3R1编码PI3k调节亚基α,被提名为关键的中介在成骨细胞和破骨细胞的分化18]。然而,精确的信号机制PIK3R1调节骨化仍不清楚。因此,PIK3R1被认为是进行进一步的研究。

3.3。PIK3R1对成骨细胞分化的影响

sh-PIK3R1转染成成骨细胞减少PIK3R1级别(数字3(一个)和3 (b))。高山和ARS染色法检测成骨细胞的分化水平在转染7 d和14 d,分别。如图3 (c)、高山和ARS染色以及高山活性测定表明,击倒PIK3R1尤其是抑制成骨细胞分化。此外,沉默PIK3R1克制osteoblast-related基因的mRNA和蛋白水平(COL1A1、高山、RUNX2 SP7, OCN,和OPN)(数据3 (d)和3 (e))。通过增殖和凋亡化验,是体现击倒的PIK3R1阻碍了成骨细胞的增殖,促进细胞凋亡(数字3 (f)- - - - - -3 (h))。

此外,使用一个特定的慢病毒上调PIK3R1在成骨细胞,以验证它在成骨细胞分化中的作用。存在和西方墨点法进行评估慢病毒的功效(数字4(一)和4 (b))。高山和ARS染色和高山活动进行了分析评估成骨细胞的分化能力。oe-PIK3R1组表现出更重要比oe-NC组织染色,表明一个增强成骨细胞分化的能力移植PIK3R1(图4 (c))。此外,upregulation PIK3R1 osteoblast-related基因的mRNA和蛋白水平增加(COL1A1、高山、RUNX2 SP7, OCN,和OPN)(数据4 (d)和4 (e))。增殖和凋亡化验透露类似的发现,upregulation PIK3R1促进成骨细胞的增殖而抑制细胞凋亡(数字4 (f)- - - - - -4 (h))。

总的来说,PIK3R1刺激osteoblast-related基因的表达,促进对成骨细胞增殖和分化的影响。

3.4。PIK3R1对破骨细胞分化的影响

因此,PIK3R1表达沉默调查其角色在破骨细胞分化(数据5(一个)和5 (b))。osteoclast-related基因的mRNA和蛋白表达(TRAF6、c-Fos NFATc1,陷阱,组织蛋白酶K)都增加了沉默PIK3R1(数字5 (c)和5 (d))。结果透露,击倒PIK3R1促进增殖和抑制破骨细胞的凋亡(数字5 (e)- - - - - -5 (g))。

此外,PIK3R1表达调节来验证它在破骨细胞分化中的作用。西方墨点法和存在分析研究慢病毒功效(数字6(一)和6 (b))。图中所描绘的一样6 (c)和6 (d)osteoclast-related基因的mRNA和蛋白水平(TRAF6、c-Fos NFATc1,陷阱,和组织蛋白酶K)妨碍了移植PIK3R1。增殖和凋亡化验显示,upregulation PIK3R1抑制增殖而促进破骨细胞的凋亡(数字6 (e)- - - - - -6 (g))。总之,PIK3R1约束osteoclast-related基因的表达和显示一个压抑对破骨细胞增殖和分化的影响。

4所示。讨论

骨代谢活跃,不断经历重塑通过重复周期的骨形成和骨吸收20.,21]。功能障碍的骨重建和骨形成和吸收之间的任何失衡可以减少导致骨化或骨内稳态失衡,从而导致骨代谢相关疾病如骨质疏松症(22,23]。因此,关键是理解分子机制调制的骨重塑,在分化成骨细胞和破骨细胞的形成,提供了可能的目标管理骨质疏松症和其它疾病和骨代谢相关。

目前,现代高通量技术确定了新的候选基因表达谱与骨质疏松和骨形成4,24,25]。在骨质疏松症的遗传研究,古普塔et al。18]确定几个候选基因,即PIK3R1 PRKCH, SCNN1B,潜在疾病的全基因组关联研究,符合我们采用的方法。首先,756度的确定是通过比较女性在19度。接下来,浓缩度分析进行了探讨相关功能通路,显示多个通路的浓缩,包括雌激素信号通路,肿瘤坏死因子信号通路,破骨细胞分化。除此之外,许多研究体现hsa04915之间的关联(雌激素信号通路),hsa04668(肿瘤坏死因子信号通路)和hsa04380破骨细胞分化和骨质疏松症启动。例如,雌激素调节骨代谢通过诱导破骨细胞凋亡和成骨细胞水平osteoprotegerin [26]。肿瘤坏死因子-α抑制成骨细胞分化的间充质干细胞和骨化estrogen-deficiency-induced骨质疏松症(27,28]。ApoE施加一个关键的角色在骨量维护通过ERK1/2通过促进成骨细胞分化途径(29日]。TNF家族一直与多个骨代谢疾病如骨质疏松症的发病机理(30.]。肿瘤坏死因子-α可以诱导成骨细胞的凋亡31日)和协同促进RANKL-induced破骨细胞的形成,随后导致绝经后妇女的骨质疏松症(32]。最后,基因参与了感兴趣的途径是分割的,和安全系数,得到了小君,PIK3R1。PIK3R1被确认为一个基因与骨代谢有关,但具体机制PIK3R1调节骨代谢仍未开发。PIK3R1因此选择进行进一步的研究。

PIK3R1表达成骨细胞和破骨细胞是探索,高山和ARS化验证明进行了成骨细胞的分化。PIK3R1的差别结果表明,对这些基因的成骨细胞明显减少高山和ARS活动而增加osteoclast-related蛋白质水平。这些发现表明PIK3R1促进分化成骨细胞和破骨细胞的形成,阻碍与先前的研究一致。例如,朱et al。33CRYAB表达差别)建议对这些抑制BMSC成骨细胞分化减少高山活动,这是符合PIK3R1的角色。此外,风扇等。34)透露,PIK3R1 mir - 155的目标,mir - 155促进软骨细胞凋亡和异化的活动通过针对PIK3R1-mediated PI3K / Akt途径。Mi et al。35)显示,mir - 7223 - 5 - p通过针对PIK3R1抑制成骨细胞的增殖,促进细胞凋亡。帅et al。36]显示PIK3R1可能Eucommiae皮层为骨质疏松症的一个关键目标网络药理学。的差别,我们的研究结果显示,对这些PIK3R1与扩散和增强成骨细胞的凋亡减少,而其upregulation有相反的效果。虽然upregulation PIK3R1影响了破骨细胞的形成就是能抑制其增殖,促进细胞凋亡,表现出差别,但其对这些相反的效果。综上所述,PIK3R1能够调节成骨细胞和破骨细胞的增殖和凋亡。

总的来说,PIK3R1充当调节器通过调节成骨细胞分化和骨形成破骨细胞的形成,维持骨内稳态,可以表示为一个令人鼓舞的骨质疏松症的治疗目标。尽管如此,这项研究没有调查PIK3R1促进骨形成的机制。目前正在进一步的调查。

数据可用性

由于隐私数据没有公开的或道德的限制。

伦理批准

道德的声明是不需要为这项研究没有人类或动物对象或材料使用。

的利益冲突

任何潜在的利益冲突声明的所有作者的研究,本文的作者,和/或出版。

作者的贡献

海涛朱和华陈了同样的工作。

补充材料

补充表1:19岁女性的临床信息包含在GSE2208芯片。(补充材料)

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