文摘

背景。mir - 139 - 5 - p是低表达在不同的人类癌症通过不同的分子机制,并发挥其抗肿瘤效应的分子机制mir - 139 - 5 - p在肺腺癌(LUAD)还有待进一步阐明。这项研究的目的是调查的角色和监管机制mir - 139 - 5 - p LUAD进展。方法。微分分析TCGA-LUAD microrna的表达数据的数据集。存在是用来检测的转录水平mir - 139 - 5 - p和MAD2L1 LUAD细胞,在免疫印迹进行MAD2L1蛋白表达的检测。CCK-8和Transwell化验实施评估LUAD细胞增殖,迁移和入侵。dual-luciferase记者基因进行分析来验证直接针对mir - 139 - 5 - p之间的关系和MAD2L1。结果。mir - 139 - 5 - p明显下调LUAD细胞相比,在人类正常支气管上皮细胞。Overexpressing mir - 139 - 5 - p抑制LUAD细胞增殖,迁移和入侵,而相反的结果可以观察到当mir - 139 - 5 - p被抑制。MAD2L1被认定为直接目标LUAD mir - 139 - 5 - p。此外,mir - 139 - 5 - p的抑制作用过度LUAD细胞增殖,迁移和入侵被overexpressing减毒MAD2L1。结论。我们的研究表明,mir - 139 - 5 - p是低表达LUAD细胞和抑制LUAD细胞增殖,迁移和入侵目标抑制MAD2L1表达式。这是潜在的LUAD预后和治疗的意义。

1。介绍

肺腺癌(LUAD),最常见的一种nonsmall细胞性肺癌(NSCLC),特点是密集的淋巴细胞浸润和很容易在早期阶段转移(1]。不同的医疗干预,如化疗、手术切除,LUAD和放疗是常规治疗。然而,这些治疗方法缺乏特异性,也会损害相邻正常细胞(2),使细胞毒性化疗的治疗LUAD发展个性化治疗基于分子改变(3]。近年来,致癌基因的识别和免疫疗法的使用已经改变了LUAD的治疗策略,但生存率仍然低(4]。因此,它是至关重要的,找到一个新的治疗目标改善LUAD治疗。

非编码rna在癌症领域一直是一个热门话题多年来,特别是小分子核糖核酸(microrna)。的原因是,它们在调节不同的分子过程和关键球员他们参与肿瘤发生更多蛋白质编码基因(5]。microrna参与几个癌症相关的控制流程,如增殖、凋亡、迁移和入侵。此外,microrna也与许多其它的疾病,如代谢紊乱(6]。mir - 197 - 3 - p,报道,作为癌基因LUAD促进LUAD细胞增殖和抑制细胞凋亡的表达下调赖氨酸63 deubiquitinase (CYLD) [7]。mir - 938发挥其促进作用LUAD通过瞄准RBM5 [8]。作为一个肿瘤抑制,mir - 144 - 3 - p抑制LUAD细胞增殖和入侵通过增加EZH2表达式(9]。这些发现表明,microrna有巨大潜力LUAD的诊断和靶向治疗。

据报道,mir - 139 - 5 - p在各种癌症表达下调,由不同的分子机制发挥其抗肿瘤作用。例如,mir - 139 - 5 - p在宫颈癌具有抗肿瘤作用,抑制Wnt /β连环蛋白信号转导目标转录因子4 (TCF4) [10]。在口腔鳞状细胞癌,mir - 139 - 5 - p抑制细胞增殖和转移抑制HOXA9表达式(11]。此外,mir - 139 - 5 - p作为一个肿瘤抑制通过调节SOX5在前列腺癌细胞12]。然而,mir - 139 - 5 - p的机制基本LUAD细胞增殖,迁移和入侵还有待改进和补充。

在这项研究中,我们试图探索中的表达和作用mir - 139 - 5 - p LUAD和底层mir - 139 - 5 - p的分子机制在调节LUAD细胞增殖,迁移和入侵。我们的研究可能会带来额外的洞察LUAD发展背后的分子机制,并提供潜在LUAD的诊断和预后的指标。

2。材料和方法

2.1。生物信息学分析

microrna表达数据和mrna TCGA TCGA-LUAD数据集被下载的数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/),其中microrna的表达数据得到来自46个正常组织样本和521年肿瘤组织样本,和mRNA表达数据从59获得正常组织样本和535年肿瘤组织样本。表达式分析了mir - 139 - 5 - p根据获得的数据。微分分析进行了使用“刨边机”包与阈值集 , ,然后差异表达mrna (DEmRNAs)。三个数据库miRDB (http://mirdb.org/),miDIP (http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp r),母星(http://starbase.sysu.edu.cn/)是用来预测的目标基因mir - 139 - 5 - p。候选基因获得的交集DEmRNAs并预测目标基因mir - 139 - 5 - p受到皮尔逊相关分析,和负相关系数最高的信使rna被选为研究的对象。

2.2。细胞培养

LUAD细胞系A549 (BNCC337696),中冲(BNCC340767) H1975 (BNCC340345) H1650 (BNCC100260),和人类正常支气管上皮细胞系BEAS-2B (BNCC338205)都从希伯来文名字购买文化集合(中国,北京)。所有细胞系培养100 U rpmi - 1640年媒介补充10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素(美国纽约表达载体,大岛),和100年μg / ml链霉素(美国纽约表达载体,大岛),并保持在一个孵化器有限公司为5%₂在37°C。

2.3。细胞转染

mir - 139 - 5 - p模仿,mir - 139 - 5 - p抑制剂,oe-MAD2L1,及其对应的负控制(数控)从RiboBio访问(广州)。细胞生长在不使用完整的媒介转染前24小时。Lipofectamine 2000(热费希尔科学,Inc .)是用来使转染细胞的浓度50 nM根据制造商的协议。

2.4。中存在

转染48 h后,从LUAD细胞总RNA提取使用试剂盒工具包(美国生活表达载体技术,卡尔斯巴德,CA)。microrna的信使rna是反向转录成互补脱氧核糖核酸的PrimeScript RT工具包(豆类、日本)。存在是由SYBR预混料Taq交货(豆类)在应用生物系统公司ABI 7500实时PCR系统(热费希尔科学,Inc .)。引物见表1。U6和GAPDH内生引用的microrna的信使rna,分别。2相对表达进行了分析^{- - - - - -ΔΔCt}方法。

2.5。免疫印迹

转染细胞被洗两次与磷酸盐(PBS)然后细胞溶解在冰里帕加载缓冲区(热费希尔科学、马、美国)含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Solarbio)。蛋白质浓度由BCA化验设备(Beyotime)。蛋白质样品分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page;50μg / lane),然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(zy - 160 fp Zeye生物有限公司,有限公司,上海,中国。被屏蔽后5%的脱脂牛奶2 h在37°C和洗Tris-Buffered盐水渐变(TBST)三次,细胞膜与兔多克隆抗体anti-MAD2L1孵化(1:1000年,ab97777 Abcam,剑桥,英国)在一夜之间在4°C。兔单克隆抗体anti-GAPDH(1: 2500年,ab9485 Abcam,剑桥,英国)被控制。与TBST清洗后,膜与山羊孵化anti-rabbit免疫球蛋白g h和l(1: 2000年,ab205718 Abcam,剑桥,英国)2 h。最后,蛋白质乐队可视化使用电化学发光工具包(发射极耦合逻辑;皮尔斯生物技术),分析了成像系统(美国ZG11SCIBRIGHTCL Bio-Rad, CA)。

2.6。CCK-8

细胞计数kit-8 (CCK-8)试验用于检测在不同转染组细胞增殖。细胞( )被播种到96孔板(康宁合演,康宁,纽约),然后10μl CCK-8解决方案(Beyotime、南京、江苏、中国)被添加到盘子在0 h, 24 h, 48 h,分别和72 h 2 h的孵化。由enzyme-labeled 450海里的吸光度测量仪器(美国BioTek公司Winooski VT)对细胞生存能力进行评估。

2.7。集落形成实验

转染24小时后,A549细胞接种到6-well板 细胞/好,每个治疗组是一式三份。细胞在完全培养基培养一周直到殖民地形成。细胞殖民地固定为70%为5分钟,沾0.5%甲醇结晶紫(美国热费希尔)。每一个好与无菌水清洗去除残余结晶紫。殖民地与50多个细胞,和殖民地的数量计算。

2.8。Transwell迁移和入侵检测

Transwell分析应用于评估细胞迁移和入侵。使胰蛋白酶化细胞转染48 h后收集。细胞入侵检测,88年μ米孔隙大小插入(Transwell;配角、威、英国)放入24-well板块分离室上部腔体的低。总共有200μ包含(3 - 5)×10 l细胞悬液⁴细胞与基底膜基质添加到上层钱伯斯预镀(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。500年μl rpmi - 1640中补充20%加入一定量的边后卫降低室。细胞入侵下室被固定为70%甲醇和治疗24小时后0.5%结晶紫。在倒置显微镜下入侵细胞数(奥林巴斯IX83;奥林巴斯公司(日本东京)。细胞迁移试验的过程类似于入侵检测,除了上面的房间没有涂层与基底膜基质。

2.9。Dual-Luciferase报告基因分析

放大野生型(WT)和突变(傻瓜)MAD2L1 3UTR访问上海GenePharma有限公司和向量PmirGLO插入荧光素酶。PmirGLO-MAD2L1-Wt / PmirGLO-MAD2L1-Mut和mir - 139 - 5 - p模仿/数控模拟cotransfected进LUAD细胞系利用Lipofectamine™2000工具包(表达载体)。转染48 h后,荧光素酶的相对活动被dual-luciferase化验报告基因系统(Promega公司)根据制造商的指示。

2.10。统计分析

所有数据分析GraphPad Prism 6.0(拉霍亚,CA)。每个实验重复三次。结果了 (SD)。学生的 - - - - - -测试是用于比较两组。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。mir - 139 - 5 - p是LUAD细胞中表达下调

mir - 139 - 5 - p表达式TCGA-LUAD搜索的数据集,并发现mir - 139 - 5 - p LUAD组织(图中明显表达下调1(一))。存在是用来检测mir - 139 - 5 - p的表达在LUAD细胞系A549,中冲,H1975, H1650,和人类正常支气管上皮细胞系BEAS-2B,展示,mir - 139 - 5 - p的表达显著下调在LUAD细胞系相对于人类正常支气管上皮细胞系(图1 (b))。A549细胞株表达水平最低的mir - 139 - 5 - p被选为后续实验。

3.2。mir - 139 - 5 - p抑制LUAD细胞增殖,迁移和入侵

验证的生物功能在LUAD mir - 139 - 5 - p, mir - 139 - 5 - p模仿或mir - 139 - 5 - p抑制剂及其相应的数控转染到A549细胞评价细胞增殖,迁移和入侵。首先,存在被用来检测mir - 139 - 5 - p的表达水平在不同的组,结果显示,mir - 139 - 5 - p的表达转染后会见了需求(图2(一个)),成功转染细胞可用于后续实验。在每组细胞生物学行为顺序化验。CCK-8所揭示,我们发现A549细胞转染的可行性和mir - 139 - 5 - p模拟具有明显低于A549细胞的转染数控模拟,而细胞增殖能力明显增加mir - 139 - 5 - p抑制剂比数控抑制剂组(图2 (b))。集落形成试验的结果表明,mir - 139 - 5的集落形成能力- p过表达细胞明显抑制,而LUAD细胞后显著改善mir - 139 - 5 - p是抑制(图2 (c))。接下来,Transwell试验表明A549细胞的迁移和入侵转染mir - 139 - 5 - p模仿被明显抑制,而那些A549细胞转染和mir - 139 - 5 - p抑制剂增加(数据2 (d)和2 (e))。总的来说,这些发现表明,mir - 139 - 5 - p抑制A549细胞增殖,迁移和入侵LUAD肿瘤抑制。

3.3。MAD2L1直接mir - 139 - 5 - p的目标

然后我们的潜在的分子机制进行了探讨LUAD mir - 139 - 5 - p。数据库包括miRDB、miDIP和母星首先实现了目标预测mir - 139 - 5 - p,和五个候选基因(NPTX1, ELAVL2, FBN2、GPR37 MAD2L1)获得的交集预测基因和调节DEmRNAs受到皮尔逊相关分析和mir - 139 - 5 - p。结果表明,MAD2L1负相关系数最高,mir - 139 - 5 - p(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。表达分析在MAD2L1 TCGA-LUAD数据集,从而发现MAD2L1明显LUAD组织中高度表达,和LUAD MAD2L1高表达患者总生存期(OS)相对较低(数字3 (d)和3 (e))。我们推测MAD2L1可能的直接目标mir - 139 - 5 - p基于生物信息学分析的结果。

来验证我们的猜测,mir - 139 - 5 - p模仿或mir - 139 - 5 - p抑制剂及其相应的数控首先转染到A549细胞,然后存在免疫印迹进行确定MAD2L1的转录水平和蛋白质表达水平。结果表明,MAD2L1的mRNA和蛋白表达水平显著下调后mir - 139 - 5 - p是过表达,而相反的结果观察到当mir - 139 - 5 - p是抑制(数据3 (f)和3 (g))。此外,结合位点mir - 139 - 5 - p MAD2L1 3UTR被母星预测数据库(图3 (h)),然后通过dual-luciferase试验来验证。我们发现A549细胞的荧光素酶活性转染mir - 139 - 5 - p模仿和MAD2L1-Wt减少,而A549细胞cotransfected mir - 139 - 5 - p模仿和MAD2L1-Mut表现出无显著变化(图3(我))。综上所述,这些研究结果阐明,MAD2L1 mir - 139 - 5的直接目标- p和消极受mir - 139 - 5 - p。

3.4。MAD2L1介导的影响mir - 139 - 5 - p LUAD细胞

调查是否mir - 139 - 5 - p抑制LUAD细胞增殖,迁移,并通过调节MAD2L1入侵,我们设计了三组:数控模拟+ oe-NC, mir - 139 - 5 p模仿+ oe-NC和mir - 139 - 5 - p模仿+ oe-MAD2L1。我们发现mir - 139 - 5的抑制作用——p过度MAD2L1表达式可以逆转overexpressing MAD2L1(数字4(一)和4 (b))。CCK-8和集落形成试验表明,mir - 139 - 5 - p的超表达显著地抑制LUAD细胞的增殖,虽然MAD2L1逆转的超表达的抑制作用mir - 139 - 5 - p细胞增殖(数字4 (c)和4 (d))。Transwell试验进行测试细胞迁移和入侵。结果表明overexpressing mir - 139 - 5 - p明显抑制细胞迁移和入侵,而overexpressing MAD2L1逆转的抑制作用mir - 139 - 5 - p细胞行为(数字4 (e)和4 (f))。因此,mir - 139 - 5 - p抑制LUAD细胞增殖,迁移,并通过调节MAD2L1入侵。

4所示。讨论

microrna能干扰转录信号转导和调节细胞的关键过程,因此扮演重要的角色在癌症的发生和发展13]。据报道,microrna的微分表达式之间正常的肺和肺癌症导致新型生物标志物的出现,这有利于高危人群的筛查和有助于肺癌的诊断和治疗14]。到目前为止,潜在的microrna调节LUAD尚未完全识别的进展。

在这项研究中,mir - 139 - 5 - p表达式是TCGA-LUAD数据集的搜索,发现mir - 139 - 5 - p在LUAD组织表达下调。mir - 139 - 5 - p是低表达LUAD细胞系中存在,就证明了这一点,结果符合mir - 139 - 5 - p的表达在肝细胞癌(HCC) (15),子宫内膜癌(16,胆囊癌(17]。在骨肉瘤,overexpressing mir - 139 - 5 - p抑制细胞增殖,迁移和入侵,而失去mir - 139 - 5 - p促进细胞增殖,迁移和入侵18,可以观察到类似的趋势LUAD在这项研究中。这些发现表明,mir - 139 - 5 - p在LUAD作为一个肿瘤抑制。

因为microrna可以通过各种调节肿瘤的生长和转移的分子机制(19),我们进行了生物信息学分析预测的目标基因mir - 139 - 5 - p,和MAD2L1被确认为一个潜在的目标mir - 139 - 5 - p。dual-luciferase记者目标基因进行了分析,证实了这两个基因之间的关系。此外,MAD2L1 LUAD组织中高度表达,发现和LUAD MAD2L1高表达患者有相对较低的操作系统,这是符合研究结果由李等人关于MAD2L1表达在肝细胞癌(20.]。MAD2L1报道是关键球员在维护纺锤体组装检查点的功能。MAD2L1超表达的纺锤体组装检查点会导致染色体的不稳定和非整倍性,和MAD2L1的遗传变异可导致肺癌易感性(21,22]。因此,我们进一步确认是否mir - 139 - 5 - p在LUAD抑制MAD2L1发挥其抗肿瘤作用。mir - 139 - 5 - p和MAD2L1同时LUAD细胞中过表达,我们发现mir - 139 - 5的抑制效应- p超表达在细胞增殖,迁移和入侵被MAD2L1逆转过度。因此,我们认为,mir - 139 - 5 - p规范LUAD细胞增殖,迁移和入侵目标MAD2L1。

一般来说,我们阐明,mir - 139 - 5 - p在LUAD低表达,抑制LUAD细胞增殖,迁移和入侵。此外,MAD2L1被认定为直接目标,mir - 139 - 5 - p在LUAD, mir - 139 - 5 - p对其抗肿瘤作用通过抑制MAD2L1表达式。我们的发现不仅奠定了分子基础机制的探索mir - 139 - 5 - p LUAD但也提供了一个潜在的目标治疗LUAD。

数据可用性

数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称他们没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

剑锋李为研究设计做出了贡献。习他进行文献检索和执行数据分析。吴答获得数据并写了这篇文章。晓惠刘起草。将尝试锣修订文章的最终批准,并提交的版本。所有作者阅读和批准最终的手稿。