文摘
圆形的rna (circRNAs)发挥极其重要的监管作用的发生和发展各种恶性肿瘤包括乳头状甲状腺癌(PTC)。circFAT1 (e2)是一种新型的circRNA源自FAT1基因外显子2,分布在细胞质和细胞核的PTC细胞。然而,到目前为止,circFAT1的角色(e2) PTC尚不清楚。在这项研究中,circFAT1 (e2)被发现PTC细胞系和组织中高度表达。circFAT1 (e2)击倒抑制PTC细胞生长、迁移和入侵。同时,circFAT1海绵(e2)作为一个潜在的小分子核糖核酸(microrna)调节癌症进展。一个潜在的microrna的目标被发现mir - 873由circFAT1目标在PTC (e2)。dual-luciferase试验进行了后来也证实确实有之间的直接交互circFAT1 (e2)和mir - 873。本研究也证实,circFAT1 (e2)抑制mir - 873表达,从而促进了ZEB1表达式,从而影响扩散、转移和PTC细胞的入侵。总之,这项研究的结果表明,circFAT1 (e2)发挥了致癌作用通过瞄准mir - 873 / ZEB1轴促进PTC入侵和转移,这可能成为一个潜在的治疗PTC的新目标。
1。介绍
环状RNA (circRNA)是一种特殊类型的可变剪接(称为反向拼接)产生一个特别和共价闭环结构RNA (1]。最近,一些研究已经表明,circRNAs差异表达在各种疾病2),包括癌症、动脉粥样硬化血管疾病和神经系统疾病。这可能表明circRNA可以发挥潜在的监管作用在某些疾病的恶化3]。例如,circRNAs可以绑定到RNA聚合酶II以多种方式形成复合物,可以调节RNA聚合酶II的活动,然后影响父母的基因转录从而[4]。根据研究Abdelmohsen et al .,圆形PABPN1 (polyadenylate-binding核蛋白质1)户珥(R)人工抗原可以广泛地绑定到表单HuR-circRNA复杂,竞争性抑制户珥的绑定和PABPN1 mRNA,导致减少PABPN1翻译,从而干扰细胞的正常代谢5]。研究也表明,绑定circRNA UBAP2 mir - 143可以废除bcl - 2和半胱天冬酶的抑制细胞凋亡通路(6]。
乳头状甲状腺癌(PTC)是最受欢迎的女性的癌症(7]。PTC的全球发病率排名9日所有癌症(8]。PTC的恶化的因素尚不清楚。尽管一些证据表明,肥胖,吸烟,激素暴露,和某些环境污染可能与PTC (9- - - - - -12),唯一的风险因素验证PTC是电离辐射(13]。因此,迫切需要确定新的分子机制的理解监管机构和生物标记物对癌症的预后(14]。在甲状腺癌circRNA扮演着重要角色。例如,circRNA circZFR促进C8orf4的表达式作为一个依赖mir - 1261和促进PTC细胞的生长15]。circRNA circRNA_102171调节CTNNBIP1-dependent激活通过β连环蛋白通路促进PTC进展(16]。circRNA circ-ITCH抑制的发展通过miR-22-3p / CBL / PTC(列车自动控制系统)β连环蛋白通路。
circFAT1 (e2)是一种circRNA来源于FAT1基因外显子2和胃癌细胞主要存在于细胞质中。研究表明,circFAT1 (e2)是减少在胃癌组织和细胞系(GC)。此外,机理分析表明过表达circFAT1 (e2)可能会阻碍GC细胞的扩散和转移(17]。在这项研究中,我们关注的角色circFAT1 PTC (e2),这一发现可能促进PTC的预后和治疗。
2。材料和方法
2.1。细胞系,细胞培养
人类甲状腺正常细胞系Nthy-ori 3:1和PTC细胞系cal - 62, TPC-1, K1都写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。所有的细胞都被安置在一个孵化器在37°C包含5%的股份有限公司2并使用DMEM培养(BI、以色列)补充10%的边后卫(表达载体)。
2.2。细胞分离试验
细胞分离鉴定是根据以前的报告(18]。约 细胞生长在10厘米菜(康宁)trypsinised,洗冷1 x PBS,离心机(1200 rpm, 5分钟)。颗粒细胞溶解在1毫升低渗的裂解缓冲(10毫米消息灵通的pH值7.9,氯化钾10毫米,1.5毫米MgCl2, 1毫米β巯基乙醇,0.075% NP-40, 1 x鼠核糖核酸酶抑制剂,1 x蛋白酶/磷酸酶抑制剂鸡尾酒,罗氏公司)和孵化15分钟在4°C旋转。原子核是由离心颗粒状(1200 rpm, 4°C),持续15分钟。从上层的细胞质中收集。800年核清洗三次μL PBS和收集颗粒状核分数。分离细胞质和核溶解产物经本地化GAPDH和组蛋白3.1,分别。
2.3。Dual-Luciferase记者分析
为了构建荧光素酶记者向量,整个circFAT1 (e2)或3UTR片段的ZEB1包含预期的潜在的结合位点被克隆到pmiR-RB-REPORT™荧光素酶记者向量(RiboBio,广州,中国)Xhol Notl网站;也是同样的情况构建突变序列circFAT1 (e2)或ZEB1 3UTR。
dual-luciferase活动分析,我们应用Lipofectamine 2000(表达载体)cotransfect每个构造标志microrna在PTC (RiboBio)细胞48 h。Dual-Luciferase记者分析系统(美国WI Promega)是根据制造商的指示执行。此外,BioTek协同HTX多模读者被用来获得发光信号,并根据显示的荧光素酶活动相对hRluc / hluc比率。
2.4。中存在
总RNA提取试剂盒的试剂(美国表达载体)。circRNA信使RNA,反转录的总RNA互补脱氧核糖核酸是由逆转录酶(Vazyme,南京,中国)。然后,我们进行qPCR SYBR绿色PCR设备(Vazyme,南京,中国)。荧光定量PCR仪是QuantStudio™6 Flex由热费希尔科学(美国)。此外,Sangon(上海,中国)是用于构造所有的引物序列。circRNA GAPDH被选为参考基因mRNA, microrna的内部控制设置为U6。我们也使用了2- - - - - -ΔΔCt方法量化基因表达。
2.5。CCK-8化验
根据制造商的指示(Dojindo实验室、熊本、日本),PTC细胞的增殖能力评估CCK-8化验。接下来,我们镀cal - 62和TPC-1细胞( cell /)在96 -孔板,治疗10μL CCK-8解的两个小时,然后分析spectrophotometrically在自动标450海里。
2.6。Transwell迁移和入侵检测
transwell室(美国纽约康宁)被用来进行化验的细胞迁移和入侵。它可以直接用于迁移试验,或基底膜基质混合(美国BD生物科学,圣何塞,CA)的入侵检测。培养48 h后,我们使用棉签刮细胞定居的上层transwell钱伯斯和固定细胞定居在较低的表面。接下来,我们观察到细胞的数量在transwell钱伯斯荧光倒置显微镜和拍照。
2.7。统计分析
我们使用了平均形式 一个连续变量。我们用单向方差分析(19和学生的 - - - - - -测试(20.)为多个比较。所有的分析软件GraphPad棱镜,v5.0(美国GraphPad拉霍亚,CA)。在本文中,一个显著差异是确定的值< 0.05。
3所示。结果
3.1。circFAT1 (e2)增加了PTC样品和细胞系的异常
的表达水平与Nthy-ori 3 - 1细胞circFAT1 (e2) K1, TPC-1,和卡尔- 62细胞增加了单一、双重的,和四倍(图1(一))。此外,circFAT1 (e2)表达水平在12对PTC组织也发现使用中存在。结果表明,circFAT1 (e2)表达在PTC组织明显高于正常组织,在匹配(图1 (b))。
(一)
(b)
3.2。沉默circFAT1 (e2)抑制PTC细胞增殖
确定生物角色circFAT1 TC (e2),我们首先发现其亚细胞位置在卡尔- 62和TPC-1细胞。我们的研究结果表明,circFAT1 (e2)主要位于TC细胞的细胞质(图2 (c))。与此同时,nuclear-located U6和cytoplasm-located GAPDH也发现积极的控制数据2(一个)和2 (b))。接下来,我们撞倒的表达水平circFAT1 (e2) TC细胞使用特定的核目标的circRNA(数字2 (d)和2 (f))。为了搜索的功能circFAT1 (e2)击倒在TC细胞,细胞增殖CCK-8化验进行。我们的研究结果表明,细胞的增殖率si-circFAT1 (e2)显著表达下调与对照组相比在卡尔- 62(图2 (e)(图)和TPC-1细胞2 (g))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.3。circFAT1 (e2)抑制PTC击倒后体外细胞转移
此外,我们测试是否circFAT1 (e2)会影响PTC细胞的转移能力。迁移试验结果表明,circFAT1 (e2)击倒显著削弱卡尔- 62(数据的迁移能力3(一个)和3 (b)(数据)和TPC-1细胞3 (c)和3 (d))。此外,我们检测到的入侵能力PTC细胞评估细胞的渗透通过基底膜基质transwell室。如图4,我们发现circFAT1 (e2)击倒抑制细胞入侵。入侵细胞的数量分别下降了80%和85%,卡尔- 62(数据4(一)和4 (b))和TPC-1(数字4 (c)和4 (d))细胞转染si-circFAT1 (e2)与阴性对照组相比。总之,这些结果表明,circFAT1 (e2)是一个积极监管机构TC转移。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。circFAT1海绵(e2)作为促进ZEB1 mir - 873
以前的研究已经表明circRNA可以作为microrna的海绵。在这项研究中,我们建议circFAT1 (e2)也可能作为一种microrna在TC海绵。circFAT1 (e2)主要位于TC细胞的细胞质中。circFAT1 (e2)可能在转录后的调控目标蛋白质的表达水平,这表明circFAT1 (e2)可能是microrna的龙头。为了验证这个假设,我们使用米兰达(https://www.microrna.org/microrna/home.do)来预测潜在的microrna之间的交互和circFAT1 (e2) 1。我们发现circFAT1 (e2)和mir - 873结合位点。使用HumanTargetScan ZEB1被生物信息学预测的潜在目标mir - 873 (http://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_71/)。先前的研究已经发现mir - 873由针对ZEB1参与疾病的进展(21,22]。ZEB1据报道是一个癌基因在人类癌症。存在分析表明circFAT1 (e2)击倒的表达水平显著抑制ZEB1 TPC-1和卡尔- 62(数据5(一个)和5 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
为了进一步验证这些发现,我们检测到的表达水平circFAT1 (e2)和ZEB1在PTC overexpressing mir - 873细胞,发现mir - 873的超表达显著抑制RNA水平circFAT1 (e2)和ZEB1 TC细胞(数字5 (c)- - - - - -5 (f))。Dual-luciferase化验进行验证mir - 873是否可以直与circFAT1 (e2)和ZEB1。荧光素酶记者cotransfected mir - 873为PTC细胞。包含3 pmiR-RB-Report向量 - - - - - -UTR区域ZEB1或circFAT1 (e2) cotransfected mir - 873模拟显著降低Renilla /萤火虫比率与控制向量(数字5 (g)和5(我))。然而,mir - 873的超表达的荧光素酶活性没有显著影响pmiR-RB-Report向量,含有3 - - - - - -ZEB1 UTR-mut地区或circFAT1 (e2)狗(数字5 (h)和5 (j))。这些结果表明,mir - 873可以直接目标circFAT1 (e2)和ZEB1。
4所示。讨论
在这项研究中,circFAT1 (e2)被发现比这更高的在乳头状甲状腺肿瘤和细胞系在正常甲状腺组织和细胞。的差别有趣的是,对这些circFAT1 (e2)调制microrna - 873 / ZEB1信号通路。更重要的是,circFAT1 (e2)击倒抑制一些PTC细胞的生理功能。
许多研究也表明,circRNA起到了至关重要的作用在多种人类癌症,如乳腺癌,肝癌,胃癌,甲状腺癌。例如,在魏等人的研究中,这是表明circZFR有助于PTC细胞的生长由mir - 1261 / C8orf4轴(15]。通过使用微阵列分析circRNA在甲状腺癌,98 circRNAs特异表达。也发现circrna - 100395有一个显著的潜力与癌症相关的microrna互动(23]。王等人发现circ-ITCH可以抑制PTC的进展通过调节miR-22-3p / CBL /β连环蛋白级联(24]。尽管尚不清楚如何circFAT1 PTC (e2)函数。本研究显示高浓度的circFAT1 PTC (e2)。这显示circFAT1 (e2)通过影响细胞增殖,促进了PTC的发展细胞入侵和迁移。在我们的研究结果也表明circFAT1 (e2)在甲状腺癌中,发挥了致癌作用表明circFAT1 (e2)可能是一个潜在的治疗目标。
在胃癌(GC),小说circRNA circFAT1 (e2)已被确定。circFAT1 (e2)显著下调GC组织和GC患者的总体生存率相关。circFAT1 (e2)是分布在GC细胞的细胞质和细胞核。circFAT1 (e2)的原子核可以直接与Y-box-binding蛋白1 (YBX1)和抑制其功能。circFAT1 (e2)细胞质对肿瘤抑制效应,调节mir - 548 g / RUNX1轴。此外,本研究还表明,过表达circFAT1 (e2)诱导扩散、迁移,和GC细胞的入侵,它扮演了一个在GC[肿瘤抑制作用17]。通过我们的研究,circFAT1在PTC (e2)是调节细胞和组织,可能参与细胞增殖,细胞转移、细胞入侵和其他生物过程。同时,我们证明的可拆卸的circFAT1 (e2)可以抑制ZEB1的表达。mir - 873超表达强烈抑制ZEB1的表达水平和circFAT1 (e2)。荧光素酶检测表明,mir - 873可以减少pmiR-RB-Report向量的活动包含3 - - - - - -UTR区域ZEB1或circFAT1 (e2)。这些结果表明,ZEB1和circFAT1 (e2)的直接mir - 873的目标。
它已经表明,mir - 873扮演不同的角色在不同的癌症(25]。它已经被确认为一种致癌基因在肺腺癌26),然而,抑制乳腺癌,卵巢癌,和胶质母细胞瘤27]。在神经胶质瘤细胞,mir - 873的超表达导致bcl - 2减少,从而抑制细胞增殖,细胞转移,和细胞入侵(28,29日]。在乳腺癌细胞中,mir - 873不仅降低了乳腺癌细胞增殖,还增强了三苯氧胺耐药性(30.]。同样,mir - 873已被证明与IGF2BP1胶质母细胞瘤细胞和抑制胶质母细胞瘤细胞的生长和转移31日]。mir - 873的功能在不同癌症类型可以不同依赖于特定的细胞环境。一致,据透露,mir - 873在PTC表达下调细胞根据我们存在的结果。ZEB1是一个转录因子诱导EMT致癌作用的能力,而闻名的中扮演重要角色在细胞通过各种机制包括Wnt, NF -κB, microrna [32]。在乳腺癌细胞的转染mir - 873模拟减少ZEB1表达式。ZEB1可以作为激活YAP1目标基因的转录激活因子,包括妳的表达,CTGF, CYR61,也作为一个转录抑制因子抑制目标基因的表达(上皮)一致33]。本研究也证实,circFAT1 (e2)抑制mir - 873表达,从而促进了ZEB1表达式,从而影响扩散、转移和PTC细胞的入侵。
总之,我们已经证明circFAT1 (e2)促进肿瘤发生和PTC的侵袭性。它参与监管的PTC竞争力绑定mir - 873和移植ZEB1目标基因的表达。这些发现表明,circFAT1 (e2) mir - 873 - zeb1轴可能是一个有前途的PTC的预后和治疗的目标。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
高峰锅和毛Anwei概念化设计研究。Chuanchao魏发达的方法。Junbin丁收集样本。陆Jingfeng分析和解释数据。宏昌Jiazhe刘和李写道,审查和修订后的手稿。宏昌Jiazhe刘和李的贡献同样这项工作。