自动识别GLUT4储存囊泡与质膜融合事件在TIRF显微镜图像序列

文摘

定量分析的动态行为对膜结合分泌囊泡在生物研究已经被证明是重要的。本文提出一种新颖的方法来自动识别VAMP2-pHluorin之间难以捉摸的融合事件标记存储GLUT4囊泡(GSVs)和等离子体膜。分化实现检测融合事件的起始修改提出减法TIRFM连续帧的图像序列。空间连接像素差分图像中亮度超过指定的自适应阈值被分组到不同的融合点。囊泡是位于intensity-weighted质心的融合点。揭示了真实的在活的有机体内自然融合事件,2 d高斯拟合的融合点用于推导intensity-weighted融合过程中质心和光斑大小。融合事件及其终止可以根据光斑尺寸的变化决定的。评估方法在真实的实验数据与地面真理注释由专家细胞生物学家。评价结果表明,它可以达到相对较高的精度比较顺利地手动分析,然而在时间的一小部分。

1。介绍

精确调控的胰岛素对葡萄糖的维护至关重要在人体体内平衡。作为蛋白家族的一员的葡萄糖转运蛋白(过剩),葡萄糖转运体类型4 (GLUT4)蛋白质初步存储在细胞内的膜结合分泌囊泡内脂肪组织和横纹肌(骨骼和心脏),也称为GLUT4储存囊泡(GSVs)。这种蛋白质的活性缺陷已经涉及某些形式的胰岛素抵抗和2型糖尿病。当一个细胞表面胰岛素受体被激活,胰岛素诱导迅速增加葡萄糖的吸收诱导的易位GSVs从质膜细胞内的隔间。长期以来对于膜贩运准确和定量解释膜结合分泌囊泡的动态行为。然而,传统的方法从分子生物学和生物化学是囊泡运动从根本上无法解决离散步骤(1]。全内反射荧光显微镜(TIRFM)可以观察到层薄100海里的盖玻片标本毗邻,使它成为广泛使用的工具,观察细胞表面附近的生物活性,如内吞作用和胞外分泌。更可以提取定量信息支持生物研究通过分析TIRFM图像数据。然而,这仍然是一个标准的做法对于大多数生物学家手工分析高吞吐量产生图像在活的有机体内观察和视觉观察囊泡的行为。这项工作不仅耗费时间,而且还容易出错,不可重现,它总是引起主观偏见。很需要开发一个有效TIRFM图像分析系统在生物医学研究中,这是一个小说bioimaging区域,也是一个子公司分公司computing-based图像处理(2]。

融合GSVs事件由一个胞外分泌行为的最后步骤,其中包括融合毛孔打开和泡扩散的过程。GSVs码头到质膜,可以观察到荧光的瞬态和适度增加TIRFM一旦融合GSV打开毛孔。囊泡停止和振动在同一个地方一段(命名过渡时间),然后扩散距离融合现场可视化为荧光吹到细胞表面或一个小爆炸在细胞膜。GLUT4然后插入并成为积分膜跨膜蛋白。葡萄糖可以运输到细胞下降这一过程被称为易化扩散的浓度梯度。囊泡融合的扩散过程包括融合的快速荧光强度下降的网站,扩大泡大小和传播的信号强度(3),这是识别融合的标志事件。突出融合事件包括融合孔开放和扩散过程在图中进行了描述1。虽然一些nonfusion囊泡不扩散后的质膜融合毛孔开放,他们驶离码头或离开细胞表面,并返回到细胞。

没有做什么对融合事件的识别GSVs和细胞膜之间TIRFM图像序列。一些当前现有的方法不完全自动化3- - - - - -5]。图像处理技术通常用于检测GSVs的位置,把他们从每一帧图像序列。相应的位置为同一泡可以与囊泡运动的轨迹。在识别融合事件之前,终止GSVs轨迹(名为死亡事件)首先应位于。随后,每个single-vesicle轨迹是筛查可能融合事件主要基于规则,它来源于手动识别融合过程的定量描述。在Vallotton et al。6),一个完全自动化的系统设计基于囊泡融合事件检测跟踪和严格的模板匹配。Vallotton的研究的基础上,Mele等人提出了一个改进,每个候选人是由一组描述小说融合领域特定描述符。真正的融合事件之间的相似性得分(原型事件,设置手动由一个专家)和融合候选人计算主成分分析(PCA)的特征融合识别(2]。融合事件的识别,它考虑了多个囊泡跟踪,提出了一个重大的障碍去克服。轨迹可能会从质膜泡时简单地驶离码头,当两个囊泡融合在一起或轨迹建立错误时,通常会导致不准确的死亡事件的位置。强烈依赖于标准融合模板让找到一个安装相关内核为不同类型的融合事件一个几乎不可能完成的任务。基于一个通常不满足假设泡保持静止前帧融合或驶离码头,提出了一种新颖的方法(7]。该方法检测融合和驶离码头事件首先寻找停靠囊泡,“似乎”和“消失”的视野,然后使用扩散模型将其分类为融合或驶离码头事件。

2。方法概述

在这篇文章中,一个完全自动化的融合事件识别系统,提出了由检测融合孔开放和融合的囊泡融合,通过高斯拟合特征融合过程,最后确定融合的融合事件根据大小变化。精确检测融合孔开放和融合,GSVs用VAMP2-pHluorin标记,这是一个pH-sensitive记者。的pH敏感性pHluorin一直利用可视化融合毛孔打开(1]。当码头泡细胞表面和融合毛孔打开,VAMP2-pHluorin表示为一个跨膜蛋白。可以观察到荧光的突然上升,由于内部和外部之间的不同pH值的单元格。根据这一明显的荧光变化,我们采用移动平均分化,而不是绝对的区分两个连续帧识别融合事件的起始。推导出融合,一种自适应阈值通常称为平均绝对偏差(疯狂)应用于减少噪声引起的饱和分小变化和其他构件在不同图像。这个阈值已经被证明是有用的生物学家相比,这个实验的视觉识别。本文给出的假设是,没有其他的融合发生在融合过程中已经存在相同的地方。因为泡不表现出运动在细胞表面的对接,与每个候选人泡一块方形的图像序列的中心是剪裁进行进一步分析。二维(2 d)高斯模型被用来推导在融合过程中融合点的大小。根据二维高斯拟合,融合点的总强度、强度在融合(融合点的强度加权质心)也可以计算。 The method is evaluated on real data with ground truth annotated by biologists. Evaluation results show that it can achieve relatively high accuracy at a low computation cost.

2.1。检测囊泡融合的候选人

在我们的实验中,由于pH-sensitive记者的好处(例如,VAMP2-pHluorin) GSVs不能观察到融合毛孔打开。瞬态的现象和突然增加荧光在细胞表面是一个强大的指示器,囊泡与细胞膜融合。这些明显的强度变化,提出差异化框架可以用来检测融合毛孔打开。考虑到荧光成像中存在的固有噪声,向前移动平均线是用来代替绝对差异化。在本文中,每个不同的形象从可以通过减去一个迭代的背景吗从每个, 在哪里TIRFM图像序列的帧数;是一个用户定义的参数根据图像的品质。在差分图像,融合候选人囊泡对应区域的强度高于当地环境。识别这些囊泡,差分图像的自适应阈值称为平均绝对偏差(疯了) 使用。已经证明疯狂可以提取区域代表真正的候选人,以及消除干扰来自荧光斑点的微妙的外观8]。有时区域对应于同一泡可以多次根据阈值在图像序列的差异。确保没有其他融合事件发生在一个地方泡融合过程已经存在,第一个候选人囊泡融合是图像的差异。

2.2。高斯拟合的融合过程

检测囊泡融合候选人后,进一步的动态行为可以被跟踪和破译融合事件的识别。根据(2],许多线索用于识别融合事件,如增加强度系数、峰值差异,最大系数增加。摘要泡的总强度、强度加权质心,融合的大小在融合过程中考虑。融合事件可以被描述为一个瞬态行为的强度和规模。在过渡期间,没有多少的变化强度和囊泡的大小。短时间内后,泡迅速扩散到的荧光背景而泡大小增加融合事件。

每个以前检测到的囊泡融合候选人,一个补丁图像序列以加权质心的程度从原始TIRFM时空上裁剪图像序列。用户定义的参数是一个整数大于单个泡的半径和小于囊泡之间最近的距离。一个图像块的范围应该包括整个泡点,确保足够的空间为荧光扩散。而不是一个广泛的分析整个图像序列,它可以大量降低计算成本。

根据显微镜系统的点扩散函数(PSF),囊泡作为对称和圆形斑点出现在图像。囊泡的强度分布是近似的二维各向同性高斯函数使用单纯形算法和最小均方误差(LMSE)估计量9]。二维高斯曲面方程的一般形式 在哪里加权质心的坐标,的强度和方差依赖于实际的泡点半径,从0到吗。每一帧的当地背景中减去所有像素强度值归一化。当地的背景一片图像近似使用货车车厢平均在一个正方形的程度在原始图像序列:

半宽度(应用)被认为是囊泡半径和除以大约是常数1.1774。终止囊泡运动的价值时,可以定义乘以1.1774大于参数,使用直接拟合二维高斯函数的结果,每个补丁图像没有当地背景减法。

消除突然干扰由于荧光动荡,综合平均泡半径在每个时间步是用来量化融合点的大小。所有的荧光被认为是种囊泡,内部的膜结构,或等离子体膜2]。泡也可以假定为各向同性球的半径当对接细胞膜扩散之前。一个球体的表面面积与半径使用以下公式确定吗。当一个完全泡与质膜融合,细胞膜的种荧光被释放。最终扩散点的半径至少两倍点扩散之前半径。根据这些,在扩散过程中融合事件可以被完全破译如果泡点半径是2倍的综合平均扩散起始。

3所示。实验和评价结果

在这个实验中,VAMP2-pHluorin + 3 t3-l1脂肪细胞成像是使用一个ix - 70倒TIRFM显微镜(奥林巴斯),这是配备氩(488海里)和氩和氪激光线(568海里)(干预)流浪,一个60×1.45附加说明油浸物镜(Plan-ApoN;奥林巴斯)和TIRFM冷凝器。TIRFM图像检测的采样频率5赫兹的背景和或iXon887 EMCCD相机(1024×1024像素间距0.18μ米,16位;和或技术)。

本文三个真正TIRFM图像序列,每一个有400个连续帧,选择对该方法的性能进行评估。所有图像序列注释由专家细胞生物学家。在候选人囊泡融合的检测,我们选择用户定义的参数为了消除背景噪声和保持泡对象无关。如图2,向前移动平均分化可以实现高信噪比(信噪比)差异图像比较绝对的分化方法。没有启动,自适应阈值疯狂就严重抑制局部不均匀背景和从差分图像中提取泡点面具。的intensity-weighted质心的囊泡融合可以计算使用掩模对原始图像。检测囊泡融合候选人的评估结果三组图像数据如表所示1。检测方法结合向前移动平均分化和自适应阈值疯狂可以达到一个相对高的准确性与查全率和查准率高达90%。由于强大的噪声图像背景,错过了一些微妙的囊泡。虽然一些构件突然出现在细胞图像通过图像误检测为囊泡分化的步骤。

根据图像数据,参数,因为最大的融合点半径不大于10像素。一个补丁图像序列的程度对于每个候选人囊泡融合是剪裁。高斯拟合每一帧后,泡半径的高斯函数的应用),强度加权质心(峰值强度),总强度可以派生。它们之间的关系在囊泡运动如图3。积分平均半径也计算检测扩散过程的启动,标志着黑色的星号。摘要扩散过程可以被定义的起始时泡大小是1.2倍积分平均大小。这意味着囊泡的大小变化不超过20%融合孔隙内持续时间。候选人泡可以被定义为一个融合如果在扩散过程中最大的泡点半径是2倍的积分平均大小泡的起始扩散。如图3的假设(2,6)的整体强度在整个表面是常数的结果不满意是因为细胞释放细胞表面的荧光材料。评估结果自动识别融合事件三组图像数据如表所示2。四种典型的识别结果比较地面实况图所示3。许多融合事件错误地识别(FP),该方法在细胞的边缘,如图3 (c)。尽管当地背景是减少,2 d高斯拟合不能输出满意的结果由于不均匀图像的背景。而错过了一个(FN)是由于严格的条件,融合点在融合事件的最大半径是2倍的积分平均大小泡的起始扩散事件,如图3 (b)。这种方法非常依赖于精确的二维高斯拟合。总图像日期集,评价结果表2表明它可以达到较高的精度优于手工分析,然而在一小部分的时间。

4所示。结论

在本文中,我们提出了一个完全自动化的和容易的方法识别融合事件。我们评估方法使用真实图像数据注释的生物学家。评价结果表明,向前移动平均分化结合自适应阈值检测融合的疯狂更有用的候选人囊泡结合pH-sensitive记者,而二维高斯拟合的融合过程有助于注释TIRFM序列图像融合事件。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

支持这项工作由中国的国家基础研究计划(2011 cb504400),中国国家自然科学基金(31301176,31301176),浙江省自然科学基金(LY13C050001)和专门研究高等教育的博士项目基金(20130101120172)。

引用

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