文摘

我们描述的发展分层的建模方法应用于模拟的前进的运动myosin-V分子马达蛋白以及一个肌动蛋白丝跟踪。在分层的模型中,三个不同水平的蛋白质结构解析表示:二级结构,领域,与变化的详细程度和蛋白质,根据分子之间的相互作用的程度。系统的完整性维护使用树的空间组织边界卷和距离约束。虽然应用于一个actin-myosin系统,分级的框架足够全面,可以很容易地适应其他一些大型生物分子系统包含100年的蛋白质。我们比较仿真结果与生物物理数据,尽管缺乏原子细节在我们的模型中,我们找到好的协议,甚至可以提出一些改进当前myosin-V运动模型。

1。介绍

1.1。分子马达和肌凝蛋白V

分子马达是无处不在的原核生物和真核生物和运动的所有生物都非常重要。虽然在结构上和功能上不同,他们都有至少一个共同特征,是一种将化学能转换为机械功的能力。在单个真核细胞中,至少有100种不同类型的分子马达目前负责主动转运细胞内物质在细胞内的大距离。除了驾驶这些重要的亚细胞过程、分子马达也可以驱动整个细胞的运动,如淋巴细胞和胚胎细胞,它还必须在很远的地方旅行。真核细胞中的细胞骨架纤维系统作为脚手架调解定向运动细胞内的分子马达等一群蛋白质。为了达到这个目标,运动肌凝蛋白等蛋白质,驱动蛋白和动力蛋白沿着聚合表面的肌动蛋白微丝和微管蛋白(微管)跟踪通过特定的相互作用分别与肌动蛋白和微管蛋白。尽管其中变化,似乎这些分子马达都聚集在一个核心机制,夫妻atp酶活性产生力和运动/运动通过一个有偏见的构象变化。

所有的分子马达,作用于肌动蛋白丝属于肌凝蛋白总科。至少有35个不同类型的肌凝蛋白(2),这些细胞骨架马达蛋白与宿主细胞运动性生理角色,包括肌肉收缩、趋化性,胞质分裂,吞饮,和有针对性的囊泡和细胞器运输3,4]。类V肌凝蛋白,特别是已被证明运输货物如在神经元内质网,黑素体黑色素细胞,信使rna在酵母(5- - - - - -7]。酶活性的微小变化/动力学和结构适应,否则,高度保守的催化电动机域允许不同的肌球蛋白生成不同类型的细胞中的能动性。二类肌凝蛋白,肌凝蛋白V可能是研究最多的类和竞争对手肌凝蛋白II的最佳特征肌凝蛋白对阐明其分子基础运动(8]。

1.2。持续和责任周期

前进的汽车进行多种化学周期之前分离从灯丝绑定它们。肌凝蛋白V是一个典型的例子,就是前进的运动,因为它可以把在距离大于单个ATP-driven步骤(8]。这与nonprocessive汽车进行单一易位事件分离之前。支持远距离易位,这些汽车必须,因此,工作在几百人口,在附近的一个肌动蛋白丝,确保连续滑动(8]。使用荧光标记,进行的竞选肌凝蛋白V的平均长度估计为2.4μ米,或者36海里(约66步9,10]。

机械臂运动过程中肌球蛋白散步是耦合的化学循环前进的汽车和一个简化的模型运动肌凝蛋白V图所示1。任意两头从ADP束缚态,拖头,postpowerstroke构象,释放ADP循环的速率限制步骤。ATP结合拖头,使其分解,使主要负责人完成其powerstroke prepowerstroke构象。是如此,分离后的头向前推力,其ATP水解,reprimes pre-powerstroke的杠杆臂位置。这个免费的头使扩散搜索绑定到下一个肌动蛋白的网站,成为新的主要负责人(11,12]。交替动力学分支和途径提出了一般模型,不同的顺序采取不同的核苷酸,两位国家元首和肌动蛋白的亲和力在这些国家13- - - - - -16]。

持续相关的工作周期是一个概念,指时间的分数一头肌球蛋白与肌动蛋白丝接触期间进行的。鉴于对肌动蛋白肌球蛋白V的亲和力是最强在ADP核苷酸束缚态和ADP释放速率限制,肌凝蛋白V大部分的强烈动力循环结合肌动蛋白和肌凝蛋白因此归类为高强度的比率。人们认为高关税比率(> 0.5)需要所有前进的肌凝蛋白阻止离解的轨道运动中肌动蛋白。责任比率可以计算在很多方面,比如描述肌凝蛋白催化动力学实验周期和使用派生的利率或观察肌动蛋白附件由单一荧光标记肌凝蛋白。对于肌凝蛋白V,实验研究单头S1片段显示肌凝蛋白的强烈束缚AM-ADP束缚态大约80 - 90%的时间(17)和一种责任比超过0.9的本地肌凝蛋白二聚体(18]。

1.3。Outiline的工作

在这项工作中,我们使用一个粗粒度的分子模型肌球蛋白与肌动蛋白丝[V二聚体19)来模拟和分析的动力前进的运动。部分2综述了算法用于执行模拟和生成的类型的信息模型。

大量的额外细节方法,尤其是当前的应用程序,可以在补充材料。应该被铭记在我们的造型方法不是基于分子物理但使用扩展的对象包括球体,椭圆体,气缸和应被视为一个机械模型。模拟生成的结果集中的可测量的特征模型,该模型可以比较,在可能的情况下,他们的实验。使用这个简单的模型,我们试图描述哪些方面是重要的在产生前进的运动。

2。方法

2.1。分子动力学算法

为我们使用的算法和模型模拟已经详细描述了其他地方(19,20.),只会总结。全部细节的基本方法和目前的工作中使用特定的数据结构可以在补充材料,可用http://dx.doi.org/10.1155/2012/781456。在这项工作进一步开发的组件是肌动蛋白和肌凝蛋白之间的相互作用的动力学将更详细地描述。

2.1.1。分子模型

分子模型的结构是基于myosin-V (PDB代码:2 dfs)[21)使用一个非常粗粒度表示基于二级结构元素(ss,α螺旋和β链)减少到其轴向线段(棒)。SSE棍子的两端是由一个球体和党卫军被分组到域,进而被分组为分子。肌动蛋白和肌凝蛋白的分解的细节(与轻链)中可以找到19]。分子运动模拟在一个简单的Brownian-like方式与分子层次结构中的每一层经历随机位移和转动的固定大小没有惯性,只经历基本空间排斥(20.]。

分子的结构通过两两相互作用维持在上交所和域级别。这些包括限制维持肌凝蛋白head-group的内部结构和扩展的轻链绑定手臂(以前称为“脚”和“腿”,通过类比肌凝蛋白V步行运动)。只有一个克制脚和腿之间的部分,两者之间也给自由转动踝关节和髋关节肌球蛋白分子(在空间皇权的限制)。

肌动蛋白组件被建模为一个克制灯丝的52个肌动蛋白二聚体,避免边缘效应,这些都是弯曲成一个圆的末端加入没有任何不连续的捻长丝(周期性边界条件易于实现点对象(如原子。然而,除了在最低水平,我们的对象是扩展椭圆体和气缸,中国人民银行可以实现,但这不会是微不足道的。肌动蛋白环避免了这个问题在当地的成本最小的失真)。这导致一个环直径超过90海里组成四个灯丝的完整周期重复,或者8个重复有近一半36海里时期考虑对称的肌动蛋白二聚体。这枚戒指是足以防止肌凝蛋白(40 nm)的双腿跨在环(图2)。

肌凝蛋白二聚体的起始位置是基于肌动蛋白和肌凝蛋白的位置观察到的模式昆虫飞行肌(PDB代码:1 o1a)[22)的坐标myosin-V球状(脚)域叠加在相应的域肌凝蛋白ii的肌肉结构。这地方一个肌球蛋白分子接近立即捕获并输入loose-binding模式(下面详细描述)和其他剩余的自由。

几个模拟运行只使用三个肌凝蛋白V模型结构不同数量的智商图案(轻链)。这些模型将以下称为myoV-nIQ n代表智商图案的数量在每个模型的重链。从6智商模型前面描述的(23),第二和第四智商以外的坐标图案在每个链都丢弃获得2智商和4智商肌凝蛋白模型,分别。myoV-4IQ, myoV-2IQ和myoV-6IQ都模拟使用上面描述的算法在一个相同的肌动蛋白丝模型。

2.1.2。Actin-Myosin绑定

actin-myosin交互建模为两个层次,最初由一个没有方向的吸引力称为“loose-binding”,然后从松散绑定,交互可以进步收紧,定向相互作用被称为“紧束缚。“只有在后者模式是肌凝蛋白powerstroke允许的进步。

松散绑定约束被激活时的质心肌凝蛋白head-domain(脚)在15纳米丝轴。(在这个阶段,旋转仍无阻尼自由。)最初疲弱之间的吸引力就激活肌凝蛋白脚和最近的肌动蛋白二聚体的中心,随着随机位移的大小减少5倍经验丰富的肌球蛋白分子。这些限制只应用在一个时间步,被重新评估,在每一个时间步长,使肌凝蛋白改变其选择的肌动蛋白结合的伴侣。

如果肌凝蛋白的脚走到灯丝,两者之间还添加了额外的限制肌凝蛋白actin-binding域和肌动蛋白二聚体中心,引入极性相对于肌动蛋白丝肌凝蛋白方法但是没有择优取向的纤维方向角的方法。如果肌凝蛋白的方向是有利的,与这两个绑定域比脚重心接近肌动蛋白,然后走向一次由紧密绑定。否则,如果肌动蛋白肌凝蛋白还近,现在仍在loose-binding模式经历十倍减少随机旋转和没有随机平移运动。

紧束缚的限制是应用在域级别myosin-binding域之间的肌动蛋白分子是最接近肌凝蛋白脚和两个actin-binding域。介绍取向丝轴,相当于myosin-binding在邻域从而被用来提供额外的限制。脚类比后,绑定域名的“脚”肌凝蛋白的脚是吸引绑定域中央肌动蛋白和肌动蛋白向+(粗糙)的灯丝,而绑定域名的“鞋跟”脚吸引也向-中央肌动蛋白和肌动蛋白(倒钩)长丝。从模拟静态绑定19),发现上述地方限制没有足够强大的肌凝蛋白二聚体的方向,另一半可能经历大的随机运动。增加的强度限制是不实用的科学,这导致中断的肌动蛋白丝(经验补偿同等强度的反应)。采用的解决方案是引入非物质位移修正偏差的肌球蛋白脚对齐与纤维轴及其方向远离灯丝。航空术语指的这些运动的“偏航”和“滚,”分别剩余的自由度(“倾斜”)是及时矫正,决定只能由上述地方紧束缚限制。

在紧束缚模式下,随机旋转运动分子的进一步阻尼十倍,仍然没有随机平移运动。这使得肌凝蛋白分子几乎静态只有轻微的“摆动”运动和小位移产生的具有约束力的限制,空间斥力(总是活跃)。

2.1.3。Powerstroke运动

powerstroke运动包括一个旋转70°肌凝蛋白“腿”的“脚”的重心(详细描述之前19)只激活一次肌凝蛋白是在紧束缚模式和一个合理的高度在偏航和滚在每个(在±1弧度)。powerstroke不是在一个时间步的但在步骤0.05弧度(2.86°),在每一步中,可能存在肌凝蛋白将失去对齐或紧束缚和恢复loose-binding甚至肌动蛋白的分离。

反向运动的脚再采纳prepowerstroke构象(与ATP水解)模型中发生只有当肌凝蛋白被释放。因为这是不受方向相对于肌动蛋白丝,它开始在双powerstroke率(0.1 rad. /步骤),期间,禁止肌球蛋白与肌动蛋白结合。

2.1.4。肌凝蛋白二聚体铰链运动

上面描述的所有限制和构象变化同样适用和独立部分肌凝蛋白二聚体。唯一的两部分之间的联系是通过他们的铰链点的方式。这个铰链是基于一对虚拟点放置在两个远端域之间的中点在每条腿开始(本地)二聚物的构象。(这是相当于一个旋转的铰链每一半结合共同翻译的)。

当两部分都释放,之后每个独立随机旋转和翻译,翻译的两半来恢复一个共同的虚拟铰链点。这样的运动将会完全颠覆性与肌动蛋白的交互如果注定一半一半的情况是绑定和其他免费的,铰链恢复是仅适用于免费的一半。

一半都是绑定时,情况比较复杂,如果一半是在紧束缚模型和其他loose-binding模式,那么铰链修复应用转移到松散只有一半。如果两者都是在松散或两者都在紧束缚模式下,那么一个随机的选择。我们还编码选择偏见这个选择的每一半的时间被束缚,但这不是在下面描述的结果。独立于上述铰链修复转变,虚拟铰链点都被克制,每条腿,提供额外的弹性组件保持铰链。如果一个肌凝蛋白是免费的,这些限制将很快满足但当绑定,然后将腿肌凝蛋白的累积应变的影响反复执行铰链和约束力的限制。

2.1.5节讨论。腺苷三磷酸酶周期的关系

ATP / ADP的状态不是专门模仿,而是构象变化具有明显的同行在ATP / ADP绑定和水解阶段周期。自由,ATP-bound肌凝蛋白,水解ATP与恢复肌凝蛋白构象prepowerstroke构象及其篇肌动蛋白绑定关联。整个loose-binding ADP-Pi绑定状态有关的模式直到过渡到紧束缚。对齐模型中这是明显的肌球蛋白和肌动蛋白丝内禁止公差和生物学中π的损失(可能与一个类似的实现精确绑定)。powerstroke之前和期间花在postpowerstroke构象是一个结合紧密的状态模型和生物,称为“严格”状态。这以ADP的释放,取而代之的是ATP导致肌球蛋白与肌动蛋白的分离,完成循环。我们没有明确的分子中与应变释放ADP但任何应变模型将扰乱绑定构象的回归通过loose-binding释放的可能性更大。

2.2。仿真设置和数据收集

在仿真中轨迹生成记录每台计算机的信息时间步(或帧数),包括坐标轨道肌动蛋白和肌凝蛋白二聚体在参考帧的肌动蛋白和肌凝蛋白。我们也记录每个肌凝蛋白的脚的绑定状态松,紧或免费的的身份,以及肌动蛋白域它注定和是否达到其postpowerstroke构象(摇摆状态)。此外,由于肌动蛋白轨道是圆形,圈肌凝蛋白的数量也是旅行记录。

2.2.1。楼梯数据和速度

截然不同的步骤在肌凝蛋白二聚体的运动轨迹的模拟可以确定通过监测其与肌动蛋白丝的交互。如果肌凝蛋白脚的位置被定义为该网站的肌动蛋白丝束缚,策划这个职位作为时间的函数(或帧在模拟)揭示了一个肌凝蛋白走,发生在不同的梯状的增量。获得这些,考虑到环形肌动蛋白用于模拟的轨迹,每个肌凝蛋白的头的位置是使用圈肌凝蛋白的数量计算旅行除了当前的依恋,肌动蛋白给距离(D),,在那里的总数是从而组成的环形轨道(52),l(圈数)的次数一头肌凝蛋白游历了环形轨道,年代肌动蛋白的位置开始,是肌动蛋白的数量约束的模拟。

2.2.2。测量步长

测量肌凝蛋白的步长,从每个轨迹被用来提取帧数据只有这些帧,肌球蛋白与肌动蛋白。考虑到单个步骤的时间持续了多个帧,最后一帧代表每个离散步骤是任意选择的步长进行分析。一步是那么的大小计算的绝对距离,定义为肌动蛋白的数量单位之间的铅和拖着脚每一帧。一个帧,一只脚被第二对肌动蛋白肌动蛋白13和20将结果是一个步长7单元。以连续的肌动蛋白单体之间的平均距离52单体环形轨道平均距离从而为5.70海里。这意味着7单元对应的步长约39.9纳米。

2.2.3。停顿时间

停顿时间表示步进事件之间的时间间隔,在自然系统的持续时间,随机指数分布。提取停顿时间的模拟,我们可以隔离所有步骤头都附加到肌动蛋白跟踪和计数的帧数,肌凝蛋白的脚的位置保持不变。停留时间分布分别绘制了每个肌凝蛋白的头也结合起来,生成的直方图都装有一个速率常数根据模型所描述的Yildiz et al。24),显示一个阴谋的停留时间分布特点是一个初始上升然后下降。派生的动力学方程为这种类型的运动,假设利率()的两个头都是平等的。这适用于实验一头肌凝蛋白只有一个标签和标签在哪里附近的汽车领域,这样只观察标记头部的运动。相反,如果运动是观察到的肌球蛋白,居住时间减少到一个指数: 从模拟记录两头的位置在一个给定的时间,单一指数方程(1)是适当的形式。

2.2.4。责任比例

工作周期比率反映了一部分的时间凝头接触,与肌动蛋白丝强烈束缚,在前进的运行。模拟计算的责任比例,我们把帧紧密绑定的比率平均为每个头和总帧这些值超过5为每个myoV-2IQ运行,myoV-4IQ, myoV-6IQ模拟。这给了比仅供单头。随后,计算的工作周期比双头物种,我们的平均帧的比率,要么为负责人的强烈束缚态总在每个仿真框架。

3所示。结果

节中描述的动态模型2不包含组件,将保证任何前进的运动,甚至,肌球蛋白马达仍将附加到肌动蛋白的时间长度。两腿肌凝蛋白二聚体,当释放,同样自由摆动方向向前丝以及向后每个能独立从肌凝蛋白分离。,因此,是一个受欢迎的观测模型“走”肌凝蛋白跟踪用很少的反向步骤和一个相对较小的分子数“下降”。

上半年的这一节中,我们研究这个运动的起源和需求系统模型的改变方面。在第二部分,我们比较的速度和行为描述的截断结构部分2.1。1。

3.1。描述的方法

与任何轨道运动,我们监测的整体行为模式的圈速跑步:具体有多少时间步长必须完成52个肌动蛋白二聚体的一个搭接电路。评估的重要性也有相当大的分子运动员脱落的频率跟踪。我们没有试图详尽的优化模型的参数为速度但我们采取任何改变,显著提高圈速,不引入身体不合理行为或导致过度的超然。虽然我们不知道是否一个卸载本地myosin-V已经向最大速度,它提供了一个简单的评价标准模型中使用的发展。

3.1.1。结合亲和力

在运动的简单Brownian-like模型采用模拟、位移都有一个固定大小的成对约束的强度取决于他们如何应用,进而取决于截止范围内,他们变得活跃。

第一个约束被激活在actin-myosin绑定一个centroid-centroid景点15海里。我们的初始测试这是删除它被发现导致一种改进的圈速的当属分子较小。鉴于圈速的传播,它不能声称这种改善意义重大,但是所提供的测试没有理由保持约束,省略了从默认的方法。从视觉评估,消除约束少导致失真的肌动蛋白丝(由于相反的反应肌凝蛋白吸引力)可能更好的性能(表解释1)。

的参数区(默认的12海里)决定当loose-binding交互激活(包括肌凝蛋白绑定域)是不同的从15海里的步骤3 nm降到7纳米(1纳米在分离的肌动蛋白和肌球蛋白分子信封碰撞)。变化的区参数导致一些改进15海里的略高价值但作为高值更难以证明身体上,在这个方向转变不被接受。否则,小一圈的差异除了最短的价值(7海里)(超过50%)*得到默认值(表1)。

成对interdomain限制参与维持紧密绑定更重要的控制偏航和滚动角丝轴。节中描述2,powerstroke只是激活这两个旋转时的公差内±60°(设定的参数:对齐)。为了测试这个极限,值对齐这个默认30°的范围进行了测试。正如人们预期的那样,与默认值相比,更严格的限制导致稍长一些的圈速宽松的约束是稍快,但更多的分子分离。这些测试没有提供明确的指示改变默认值(表1)。

3.1.2。肌凝蛋白铰链的影响

生成的模型的一个重要方面在于肌凝蛋白之间的联系进行的运动,尤其是当一个人正在经历一场powerstroke构象变化。使用最好的模型如上所述,肌凝蛋白能够完成的电路在1000步(表跟踪1)。这似乎有效进行的运动可能是一个大的直接结果构象变化与powerstroke关联,导致拖着腿被释放。测试这种可能性,我们试图取消powerstroke允许的直接影响分离的铰链,实际上,会扰乱肌凝蛋白在powerstroke髋关节。实现这种变化导致的意想不到的行为大多数肌凝蛋白分离的跟踪(表1)。这种行为的原因是不明显,但我们怀疑一旦拖着腿是免费的,突然恢复的铰链扰乱了绑定附加的腿。

3.1.3。弱的腿

改变铰链的有害效应意味着小信息获得的贡献在powerstroke leg-strain超然的拖着脚。另一种方法来调查这是改变腿的刚度降低应变的累积。如前所述(19),该域的轻链构成的腿是克制与邻域和那些adjacent-but-one之间的联系。此外,第一个和最后一个域之间的两个长链接添加了额外的刚性。当这两个长时间限制在腿上被显著增加20%的观察,表明腿的僵化导致有效运动但仍然很难确定这是由于更快的超然的拖脚或更有效的寻找下一个结合位点。

3.1.4。束缚态共存

区别这两个选项,绑定时间和步距进行了分析,特别感兴趣的是共存的两个肌凝蛋白不同的绑定状态。表编译的时间步骤的数目每四个不同的绑定状态共存超过10单圈默认肌凝蛋白模型的模拟与斜撑(good-leg)和一个模型,这是省略(weak-leg)。绑定状态是“免费”(F),“宽松”(L),“紧”(T)和亚态紧密绑定,肌凝蛋白的“摇摆”(S)已达到其postpowerstroke构象(表2)。

根据定义,没有计数时肌凝蛋白都是免费的(FF),这将导致终止的模拟。像预计的那样,也没有计数当这两种分子都在postpowerstroke构象(SS),因为即使有更灵活的腿,这需要太大的扭曲。其他的对称,两双松散绑定(LL)和双紧绑定(TT)并不常见,前者是weak-leg模拟更加丰富。

的两条腿被同样在这种模式下,对称的数量增加(例如,圣+ TS)和表(表2,结合)。在这些方面的差异(表2,区别)显示了一个整体的仿真时间的增加,因为疲软的腿,其中增幅最大的一条腿在组合是免费的,另一个绑定,特别是绑定在postpowerstroke构象。相比之下,没有重大变化时,两条腿都在紧密绑定模式(TT),这可能会如果是容易保持这种结合弱腿。在一起,这些观察结果表明之间的主要区别是与压力无关两种绑定状态,但是等待时间也增加了更加灵活自由腿找到一个结合位点相比硬自由腿。这可以合理化的空间搜索每个自由腿:僵硬的腿将搜索一个薄壳,而一个更灵活的腿将搜索一个厚壳(图3)。后者有更大的体积,它将需要更长的时间来找到下一个肌动蛋白结合。

3.1.5。迫使棘轮模型

powerstroke运动的传播通过肌凝蛋白髋关节铰链是唯一沟通两个肌凝蛋白单体之间发生的,否则在一组相同的约束条件下运行。除了这个物理“力”,没有指令,指导的trailing-leg二聚体释放当leading-leg绑定。调查如果绑定状态之间的直接通信的腿可能提高效率进行的运动,我们添加了,条件是当leading-leg获得绑定的拖着腿postpowerstroke配置,然后拖着腿会被设置为未绑定状态。这种变化不涉及任何直接的位置变化的trailing-leg但另一条腿在绑定模式下,然后随机运动,包括髋关节的维护,将会集中在拖着腿所以给它一个很好的机会远离肌动蛋白丝。

共存的束缚态的分析在这种模式下显示相同的百分比出现两头紧束缚模式(TT)在默认模式(表2,好腿计数与减少5倍),但州绑定的一条腿是postpowerstroke构象(TS或圣)。虽然这些计算表明一个更有效的转移到另一条腿的运动,平均圈速(20多个电路)与当前默认模型和无关紧要的不同,实际上,稍慢。这个意想不到的结果可以合理化,肌凝蛋白的速度在我们的模型是由时间寻找下一个肌动蛋白结合位点,几乎90%的时间花在与一条腿自由状态。提高圈速,因此,只有在剩下的10%的时间。已经有一个有效的运动从一条腿转移到另一个在默认模式下,任何额外的收益只能小。

3.2。模拟不同的腿长度不一致

3.2.1之上。楼梯数据和速度

步骤的运动肌凝蛋白二聚体可以作为观察振幅跳跃的杰出的staircase-plot距离与时间。myoV-6IQ的位移跟踪轨迹包含楼梯最常见的事件,而myoV-2IQ轨迹包含最少的。对所有模拟,在一个方向上位移是有偏见的,只有偶尔的后退(图4)。然而,有一个数量的差异myoV-2IQ之间的后退,4智商,智商和6模拟,后两个大约4倍的后退。总数量的步骤的轨迹算作1261年,845年和964年,myoV-2IQ 4智商,智商和6模拟,分别观察到的后退占5.95%,19.5%,和20.7%的全部步骤。

步跟踪样本的长距离跑是绘制在图5(一个)的三个模型。可以看出这两个longer-legged模型(Myo-4IQ和Myo-6IQ)能够在远距离旅行,旅行或最短模型(Myo-2IQ),少但相当一段时间。的点运行终止给出一些想法的长度的前进的运行6智商模型与66步估计Sakamoto et al。10]。然而,我们没有使用这种直接的方法来衡量持续合成以来,除了长时间模拟需要,大量的电路后,肌动蛋白跟踪变得越来越扭曲,可以增加超然的机会。

为使损失减少到最低效果由于肌动蛋白跟踪,每个模型的速度计算是基于大量的短跑两圈组成的轨道。图5 (b)显示所有轨迹收集的数据点在三种不同智商长度模型最适合线数据。适合(actin-units /帧)myoV-6IQ如下,myoV-4IQ,和myoV-2IQ模型,分别为0.057,0.039,0.0067。速度成正比的增加手臂的长度只有4和6之间的智商与2智商模型模型运行出人意料地缓慢。

3.2.2。测量步长

的平均步大小2智商、4智商,智商和6肌凝蛋白模拟得到的拟合高斯分布,,分别为单位(图6)。相比之下,使用中间值数据给平均尺寸的3步,分别为4和6台。鉴于5.70 nm / 1肌动蛋白的关系单位,这些值转化为平均步大小的海里,海里,纳米使用手段,和17.1 nm, 22.8 nm, 34.2 nm使用中间值。一个阴谋的步骤大小和数量(智商图案(图)7(一))显示了一个最适合线的线性关系步长之间的肌球蛋白(myoV模型n智商)。

实际策划的步长腿的长度(l)也揭示了一个接近线性关系最适合线为0.598l-0.164,几乎经过原点。当约束包括起源、斜率变化(图略到0.597 (b))。这意味着有一个常数角之间形成肌凝蛋白腿桥结合位点时,无论腿的长度。如果腿的长度与stepsize,那么这个角(θ)是,这对,给°或33.55°之间的肌动蛋白丝轴和肌凝蛋白的腿。如果我们假设一个运动之间的70°和postpowerstroke构象,这几乎位置绑定肌凝蛋白丝轴正交powerstroke之前。

3.2.3。停顿时间和责任周期比率

仿真算法记录以来的两头的位置在任何给定的时间,单一指数(1)是用来描述停顿时间的分布在肌凝蛋白模型走的三个不同的智商长度。理论适合分布(图8)提供速率常数总结表3,在那里表示率为1,表示的头2,表示两头从合并后的数据率。安装的利率获得一生单独为每个头然后结合显示无统计学差异,确认两头有一个平等的步进速度,如预期。因此,后续分析使用两份数据的利率执行头肌凝蛋白(改进的统计)。使用以上利率和理论曲线给平均住一生的252.7,83.06,和67.61帧,myoV-2IQ myoV-4IQ myoV-6IQ,分别。

2的计算工作周期比率智商,智商4智商、6模拟,,单头,,,分别为双头物种。如下将讨论更多的细节,停顿时间和工作周期比例很好地与实验数据相对应。

4所示。讨论

4.1。行为模型的

力学模型应用于当前工作保留myosin-V的已知结构相对应,除了两个肌凝蛋白分子之间的连接(“时髦”联合)是未解决的21]。自由度在这个模型之前,parameterised概括描述内部分子运动和肌凝蛋白的相对取向的肌动蛋白丝当绑定(19]。当前工作中所开发的动态行为造成额外的能力对肌球蛋白与肌动蛋白结合和进步通过powerstroke绑定。作为一个简单的结果相对僵硬的腿,两个肌凝蛋白不能保持绑定时他们都是postpowerstroke构象。这意味着当一条腿绑在postpowerstroke构象和另一个结合,并尝试powerstroke,一个或另一个必须分离。我们的模型不包含明确的行动或偏见指定哪个肌凝蛋白,应该有一个50:50个机会可以是leading-leg或trailing-leg。这显然是对称的情况应该导致主要沿着纤维单向进行的运动可以解释不同的预处理和postpowerstroke州的两个肌凝蛋白。偶然,如果领导腿分离,然后因为拖着腿已经经历了powerstroke,这意味着主要的腿仍将邻近的灯丝,能够重新绑定。然而,如果trailing-leg分离,导致腿是免费继续powerstroke将摇摆拖着腿从灯丝,减少其机会重新绑定。

前进的运动,这种不对称的结果相对不敏感的参数模型。行为由圈速监控和下降时,选择让大多数的区别是那些影响的搜索时间的腿找到新的肌动蛋白结合位点。其中包括如何关闭之前必须一个肌动蛋白肌球蛋白的脚在loose-binding捕获模式和僵硬的腿。后者的依赖似乎是一个提高效率的结果在大弧搜索,而不是花时间在当前绑定点的附近。撇开效率的考虑,我们模型生成的基本要求进行的运动应该身体是不可能的(或非常不利的)对肌凝蛋白单体postpowerstroke构象存在,都被绑定到肌动蛋白。没有这个条件,两腿肌凝蛋白结合,swing postpowerstroke构象,永远坚持。此外,它也是很有必要为每个脚偶尔滑从紧束缚,显然,如果紧束缚是永久,没有运动的结果。

任何机制来允许结合非常紧密的绑定到模型需要绑定的腿之间的通信状态的脚(或负责人)。ratchet-like模型,trailing-leg必须释放肌动蛋白(或放宽)置于应变时powerstroke leading-leg的摇摆。这种机制可能确实存在于自然系统,因为它可以假定应变引起的构象变化可能导致疲软的亲和力结合ADP的拖着腿。为了测试这个模型,我们直接编码肌凝蛋白分子之间的通信,这样一来,拖着腿在postpowerstroke构象会立即释放主要腿绑定。这并没有导致肌凝蛋白的增加速度或影响减少发病率和建议的棘轮机构没有必要进行的运动。然而,我们的模型不同于自然在寻找下一个结合位点的病原反应步骤,而不是ADP的绑定肌凝蛋白的释放。也许,如果放置负载下,需要更强的约束力在我们的模型中,以防止滑脱率增加,进而可能会引入一个棘轮机制的必要性。

4.2。腿的长度变化

4.2.1。准备步长

检查的作用在确定步长腿的长度,智商图案被减去创建“突变”肌凝蛋白V模型脖子较短的地区。2步长分布的智商,智商4 - 6 iq-hmm呈线性相关(图5)之间的步长和颈部长度不等纳米(2智商)纳米智商(6)。这说明我们的模型符合实验研究显示肌凝蛋白V是一个函数的工作行程长度的腿(或杠杆臂),在前进的步长运行的主要决定是腿的长度(或颈部),而不是仅仅的pseudorepeat肌动蛋白丝(4,6,25,26]。

4.2.2。持续

在模拟的2,4,和6-IQ肌凝蛋白模型,肌凝蛋白很少跌落轨道。这意味着我们无法计算数量的持续步骤分离。相反,最大行驶距离的模拟提供了一个下限的持续肌凝蛋白模型。6 4 2智商,智商,智商肌凝蛋白模型能够穿越200年,250年和500年,从而对应1140海里,1425 nm和2850 nm,分别在终止之前。这些距离是在微米范围内,对应于2.4μm代表前进的长度为肌凝蛋白V在文献中报道,或约六十六36海里步骤(10]。最大行驶距离的差异之前终止似乎与腿的长度,但这只对应一个任意不同数量的运行轨道。很可能2 iq-myov模型也可以实现类似的距离6智商模型。

4.3。楼梯数据和速度

longer-legged模型(4和6的智商图案)移动平均速度成正比,这是腿的长度而采取的时间框架的平均数(图2智商长度模拟比例大5(b))。腿的长度和速度之间的线性关系不一定是自速度取决于预期的时间需要寻找下一个结合位点。然而,这并不提供任何直接的解释缓慢2-IQ模型和分子运动建议的检查这个模型有一个不成比例的时间搜索的方向运动。这表明尽管脚(或负责人)主要是在正确的区域,更难以形成一个附件。我们怀疑这是由于位阻相邻的腿,可能造成的对简化模型的髋关节变得夸张与短的腿的长度。

4.3.1。停顿时间

不同myoV-nIQ模拟生产的停顿时间,出现相关的杠杆臂的长度,myoV-2IQ有最大的居住时间和myoV-6IQ最小的。单一研究的角度来研究停顿时间对不同肌凝蛋白V智商突变体的坂本和他的同事们发现他们的停顿时间不以任何可预见的方式与脖子的长度(26]。他们认为这个结果可能失真的短智商突变体(2 IQ智商和4)引起的分子内的应变随着头结合在不同方位角度,和损失的压力在一个更长的智商突变,从而改变菌株依赖核苷酸释放率从野生型6智商肌凝蛋白V在他们的研究(26]。应变之间没有明确的联系和核苷酸释放过程中粒度的肌凝蛋白V模型中,一个可能的解释相关的停留时间在模拟手臂的长度是手臂的时间越长,越快潜在的变形和应变累积在手臂上,可以反过来干扰肌球蛋白与肌动蛋白丝的结合构象使其释放更多的可能性。

除了一个相对比较不同智商住时间的长度,可以使用获得的利率和实验推导出利率来获得一个粗略的估计时间尺度的模拟。然而,值得注意的是,停顿时间不是一个绝对的财产肌凝蛋白V汽车,而是取决于环境条件下系统的研究。差异是否肌凝蛋白V在研究单体的或二聚的,外部负载/部队应用的数量,如果有的话,和(化验)试剂浓度导致停顿时间在文献中报道的数组。比较停留时间利率从粗粒度的模拟实验推导动能率,重要的,因此,选择那些从研究/实验用人最像我们的粗粒度模型的动力学模型。

最简单的两个关键参数动力学模型描述的文学,巧合的是最适合我们的粗粒度的肌动球蛋白模型中,ATP和ADP条件,每个核苷酸的相对浓度可以改变前进的运动的动力学反应速率。在饱和ATP的条件下(在我们的模型中隐含的条件),ADP释放已被证明是ATP酶的速率限制步骤循环,和电动机主要住在等待ADP分离状态。后面的头然后释放核苷酸结合肌动蛋白的ATP使其分离。在研究/动力学模型ADP释放速率限制,计算反应速率常数一直在12 - 14秒⁻¹。ADP的释放率是直接耦合的停留时间(停留时间较长较慢的速度引起的),它可以方便地用于虚拟时间转换为实时估计。通过校准相对于速度限制使用myoV-6IQ模拟步骤,一个框架或一步相当于约1.2秒。

4.3.2。工作周期比率

生物,高负载比前进的运动是至关重要的,因为它确保至少有一两个头肌凝蛋白V分子强烈绑定到肌动蛋白丝在任何给定的时间,从而确保随机热部队不导致扩散距离跟踪(27]。前进的汽车像肌凝蛋白V,责任比例必须,因此,至少大于0.5。单头重组肌凝蛋白V的研究表明其atp酶周期有责任的比例约为0.7 (18,28),有人认为工作周期比率达到0.9 [17]。这些值解释为底层的动力学,ADP释放的速率限制步骤(ATP饱和条件下)导致肌凝蛋白V头把大部分的稳态周期强烈结合肌动蛋白,因此更高的工作周期。这与肌球蛋白II,其动力学不同的肌球蛋白诉具体来说,速度限制肌球蛋白ATP酶循环的二步是ATP水解或π释放的主要状态是弱束缚或脱离肌动蛋白。

腺苷三磷酸酶周期的占空比可以估计速率常数确定解决方案,如果周期是完全以解决所有肌动蛋白绑定状态的稳态分布。比较ADP的分离点的速率常数ADP的整体状态稳态的atp酶,可以测量汽车的比例的强烈束缚态,从而近似负载比(8]。注意,这种方法是不适用的所有其他类肌凝蛋白,肌动蛋白的亲和力在一个腺苷三磷酸酶周期可能有所不同。Forgacs和同事确定责任比例的通量的强烈束缚中间体磷酸水解率的限制,离解,ADP离解和M-ATP分离离子从肌动蛋白(17]。

给定一个工作周期比率测量单头肌凝蛋白,然后双头物种的比率可以计算的假设没有交互的正面。在我们的模拟中,2智商、4智商,智商和6头平均花费的51%,55%,和54%,分别的时间强烈结合肌动蛋白。使用上面的公式,这将预示责任比率为0.76,肌凝蛋白为0.80和0.79。然而,由于每一帧记录弱,强或关闭束缚态对于每一个头,双头的工作周期比肌凝蛋白可以直接计算通过加法的帧头的强烈束缚态和比较每个模拟的总帧数。以这种方式计算,肌凝蛋白V 2智商,智商,智商和6模型给工作周期比率为0.99,0.94,和0.93,分别。

5。结论

我们开发了一种非常粗粒度模型沿着肌动蛋白myosin-V运动保持足够的细节,允许直接与实验结果比较,包括不同的繁殖速度和步大小不同的腿长度。我们的研究结果证实,高的工作周期是持续的先决条件,但这是否可以不再需要一个封闭的机制,根据一些研究建议(29日我们的实验),并没有完全解决。我们试图分离菌株在肌凝蛋白二聚体髋关节通过允许错位是破坏性和应变软化,使腿更灵活,也影响了搜索下一个结合位点。然而,double-bound状态的观察,发生的频率是一样的僵硬和灵活的腿表明leg-strain不是一代的一个重要组成部分进行的行为。这个结论被显式地引入支持脚之间的直接沟通(复制一个棘轮模型),我们发现小效率增加导致没有导致任何显著增加速度。

从方法论的角度来看,我们已经开发出一种新颖的算法,能够模拟布朗动力学对于大型大分子系统,适合同时协调跨多个不同级别的分辨率。我们选择我们的方法应用于调查肌凝蛋白V如何实现其前进的运动肌动蛋白丝和我们的模型代表了最低机械要求必须这样做。虽然有很多mechochemical actomyo系统模型之前发表的文献,这些合并用化学动力学和结构参数在实验研究和结构细节过渡率报告从晶体研究描述自由能转化为机械功。相比之下,我们的分级的,粗粒度模型只使用基于结构参数来描述肌动球蛋白复杂,既是一个静态和动态系统。这些参数是充分复制相关的自由度柔性连接肌凝蛋白和肌动蛋白丝前进的运动特征。

确认

j·莫雷,c . Veigle和m .桑塞姆是感谢有用的讨论。工作得到了MRC项目代码:U117581331(泰勒)。

补充材料