文摘

甘氨酸水平在大脑中被认为是改变了在神经精神疾病,比如精神分裂症和阿尔茨海默病(AD)。几项研究已经报道了在活的有机体内甘氨酸浓度测量大脑中使用质子核磁共振光谱(1H-MRS),但1H-MRS是不能成像与高空间分辨率甘氨酸浓度的分布。化学交换饱和转移磁共振成像(CEST-MRI)是一种新技术,可以检测到特定的分子,包括氨基酸,在组织。验证甘氨酸浓度的测量生活组织使用c从甘氨酸水(GlyCEST),我们从小鼠大脑组织中提取和生化执行测试。在野生型C57BL / 6小鼠,GlyCEST丘脑的影响被发现是高于大脑皮层( ,配对t以及),这个结果是在良好的协议与生化结果。5 xfad小鼠动物模型的广告,GlyCEST测量表明,在大脑皮层(甘氨酸浓度 ,未配对t以及)和丘脑( ,未配对t以及),但不是在海马体,在野生型小鼠相比下降。这些发现表明,我们已经成功地应用了CEST-MRI技术映射小鼠大脑中甘氨酸浓度的分布。目前的方法也捕捉老鼠脑甘氨酸浓度的变化与广告。大脑成像甘氨酸浓度的分布可能是有用的在调查和阐明神经障碍的病理机制。

1。介绍

甘氨酸,这是最简单的氨基酸的蛋白质中发现的生物,被作为一种抑制性神经递质在脑干和脊髓中枢神经系统(1,2]。相比之下,它的作用在大脑的coagonist n -甲基- d -门冬氨酸受体,一个ionotropic谷氨酸受体(3,4]。NMDA受体控制钙的涌入到神经元和突触传递是至关重要的,神经可塑性,学习和记忆的机制5,6]。门冬氨酸受体的激活需要绑定的谷氨酸和甘氨酸结合位点在各自的子单元7]。细胞外的甘氨酸浓度改变大脑活动,主要由星形甘氨酸转运蛋白(8]。甘氨酸浓度被认为是与NMDA受体的功能,和甘氨酸有时用于治疗精神分裂症(9]。考虑到甘氨酸在脑代谢和功能的重要角色,更好的了解甘氨酸分布在活的有机体内可能会进一步阐明在生理和病理条件下其功能。

甘氨酸浓度在大脑中被认为是改变了在神经精神疾病如精神分裂症和阿尔茨海默病(AD) [10- - - - - -12]。广告,患者血和脑甘氨酸浓度不同于那些在健康受试者10,11],但其他研究已经表明,甘氨酸浓度不变在AD患者12]。我们假设这些不一致的数据可以由甘氨酸浓度的变化在大脑的不同区域。因此,区域甘氨酸浓度的测量和成像的甘氨酸浓度分布在大脑中可能对AD的发病机制提供知识和促进这种疾病的分期。

测定甘氨酸的浓度在活组织,有必要提取蛋白质的组织和测量使用高效液相色谱法(HPLC)或质谱法。几项研究已经报道了在活的有机体内甘氨酸浓度测量大脑中使用质子核磁共振光谱(1H-MRS) [13- - - - - -15),但这种技术不能与高空间分辨率显示甘氨酸浓度分布。化学交换饱和转移磁共振成像(CEST-MRI),衡量目标代谢物质子交换的水分子和代谢产物的浓度计算16),可以用来获得高空间分辨率的甘氨酸浓度分布。

本研究的目的是建立一个方法来衡量使用CEST-MRI甘氨酸的分布技术(GlyCEST)和评估这种方法在疾病中的应用。我们首先验证GlyCEST使用幻影包含已知甘氨酸浓度的解决方案。随后,我们应用小鼠大脑的方法在活的有机体内。最后,5 xfad小鼠模型的广告(17)是用于验证该方法的功能检测小鼠的大脑中甘氨酸浓度的变化与广告。

2。材料和方法

2.1。幽灵的准备

研究的线性浓度GlyCEST效果,我们使用解决方案不同甘氨酸浓度(0、2.5、5.0、7.5和10.0毫米)在磷酸盐,pH值调整到7.0使用1 M盐酸或1 M氢氧化钠。这些解决方案添加到10.8毫米内径管,沉浸在33.7毫米内径玻璃管装满磷酸盐在pH值7.0。

2.2。实验动物和设置

本研究机构批准的新泻大学动物保健和使用委员会(SA00849)和按照指南进行的美国国立卫生研究院的有关护理和使用动物实验过程(18]。我们利用七个纯合子5 xfad转基因雄性老鼠表达五个突变与广告相关的人类基因(APPSwFlLon PSEN1 M146L L286V)和6799血管/ Mmjax [17]在16 - 17个月的年龄,以及16 C57BL / 6野生型(WT)雄性老鼠在2 - 3个月大的时候。育种祖细胞是购自杰克逊实验室(美国我巴尔港)。所有动物都维持在标准实验室条件下用12 h / 12 h光/暗周期提供食物和水随意。5 xfad老鼠的基因DNA聚合酶链反应分析得到尾活检。

在第一组实验中,我们评估GlyCEST是否可以在甘氨酸浓度检测区域差异。九C57BL / 6 WT小鼠被用于这些GlyCEST测量。老鼠使用异氟烷麻醉(感应高达3% - -4%,其次是1.2% - -1.5%维护)和30:70 O2:N2O在2 L / min和置于核磁共振成像扫描仪使用头固定在耳朵和牙齿酒吧。动物的直肠温度保持在37±0.5°C使用定制的温度控制的空调系统。MRI测量后,大脑被收获相关的核磁共振数据与生化测量。提取的大脑被切成4毫米厚冠状切片(±2毫米中心的MR成像板),分为皮层和丘脑。

在第二组检查GlyCEST数据的重现性,我们测量GlyCEST同一天在同一个老鼠的两倍。五C57BL / 6 WT小鼠被用于这些再现性测量。

在第三组,我们评估GlyCEST效果5 xfad老鼠(n= 7)和C57BL / 6小鼠WT (n= 7)。大脑GlyCEST测量和样品制备的协议都是相同的那些在第一组实验中使用。

2.3。高效液相色谱法测量甘氨酸

从小鼠的大脑提取的标本使用高效液相色谱法测定。收集到的组织样本在5毫升的80%甲醇溶解。样本离心机(15分钟3000 rpm),和5μL的上层清液由高效液相色谱分析。使用安捷伦1100系列HPLC-FLD执行测量系统(美国威明顿安捷伦科技),荧光检测器和一个安捷伦Poroshell 120 EC-C18(3.0×150毫米,2.7μ米)列。到5μ每个样本的L, 5μL硼酸溶液,0.5μL ortho-phthalaldehyde / 3-mercaptopropionic酸溶液,0.5μL (9-fluorenylmethyl氯甲酸酯和混合加入了解决方案。进样,Na2HPO4(5毫米,pH值7.6)作为流动相,和泵流量设置为0.5毫升/分钟40°C的一个列温度(19]。安捷伦“ChemStation”软件(ChemStation LC 3 d系统,转速B.04.02 SP1)是用来控制系统和分析数据。

2.4。核磁共振测量

MRI进行使用16厘米的孔7 t水平磁铁(Magnex科学,阿宾顿,英国)与安捷伦团结- inova - 300系统(美国安捷伦Inc .,帕洛阿尔托,CA)配备一个积极屏蔽梯度。一个定制的发射机体积和表面正交接收机质子线圈组(高岛Seisaku-syo、日野、日本)被用于核磁共振测量。成像协议是按照以下顺序:(1)本地化人员(三个平面),(2)t2加权图像旋转回声形态(T2WI),和(3)GlyCEST。总图像采集时间为每个老鼠是43分钟。GlyCEST成像是418 ms的饱和脉冲序列(包括十40毫秒Gaussian-windowed饱和脉冲2毫秒脉冲间隔的延迟)B1rms = 5μT,紧随其后的是中心下令快照快角度拍摄(FLASH)收购。其他成像参数如下:切片厚度= 2毫米,角= 20°,翻转矩阵= 128×64,重复时间(TR) (FLASH) = 4.37毫秒,回波时间(TE) = 2.20毫秒,总TR = 5000毫秒,和信号平均= 4。原始c图像获得在不同频率偏移量的饱和脉冲,从−5 ppm到5 ppm(−1500赫兹到1500赫兹7 t MRI)的步长60赫兹。映射B0不均一,含水饱和度变化参考图像与100年汉宁女士窗口的饱和脉冲B1rms = 0.5μT是在饱和补偿频率从−0.5 ppm为水峰值0.5 ppm,步长为6赫兹。

2.5。GlyCEST(%)计算

在GlyCEST成像,应用饱和脉冲选择性地抑制特定频率。甘氨酸的共振频率不同于水峰+ 2.85 ppm。辐照位置+ 2.85 ppm时,甘氨酸是饱和,先生形象的信号强度降低是由于水和甘氨酸分子之间的质子交换。的信号强度米+ 2.85 ppm和米−2.85 ppm在+ 2.85 ppm,−2.85 ppm, GlyCEST (%) = (米−2.85 ppm−米+ 2.85 ppm)/米−2.85 ppm×100计算作为一个指数来定量评估c的效果。计算GlyCEST(%)像素的基础上创建了甘氨酸浓度地图(GlyCEST地图)。所有的数据处理和分析使用MATLAB(版本2020、MathWorks纳蒂克,妈,美国)。感兴趣的区域(ROI)的分析,利用ImageJ GlyCEST地图软件(版本1.53,国家卫生研究院https://imagej.nih.gov/ij/index.html)。五个圆形roi,对应管包含0,2.5,5.0,7.5,和10.0毫米甘氨酸用于甘氨酸幻影。四个解剖roi,对应于整个皮层,顶叶皮层,颞叶皮层和丘脑,手工画在老鼠大脑的图像。

2.6。统计分析

统计分析了使用GraphPad棱镜版本9(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。皮尔森的优质品率相关系数是用于分析和甘氨酸浓度之间的相关性GlyCEST(%)和高效液相色谱法和GlyCEST之间数据。的配对t以及用于比较甘氨酸浓度和GlyCEST(%)中的值C57BL / 6小鼠WT皮层和丘脑。评估GlyCEST测量的重现性,我们计算了组内相关系数(ICC) (20.)之间的第一和第二的MRI测量GlyCEST(%)大脑皮层和丘脑中的值相同的C57BL / 6小鼠。ICC质量评判如下:ICC < 0.4差,0.40 - -0.60,0.60 - -0.75,和0.75 1优秀[21]。未配对的t以及用于比较的手段WT地区GlyCEST测量和5 xfad老鼠。一个 被认为是具有统计学意义。所有数据显示为平均值±标准偏差。

3所示。结果

3.1。相关性GlyCEST(%)和甘氨酸浓度

z-spectra,信号强度与水的比例(米坐)和(米0)选择性饱和,显示米坐/米0比率下降与甘氨酸浓度增加从0到10.0毫米(图1(一))。z-spectra显示之间的不对称的积极和消极的饱和补偿水共振;c不对称的饱和补偿评估都是由相同的计算用于获取GlyCEST(%)(图1 (b))。c不对称甘氨酸浓度的增加而增加。对于每一个像素,GlyCEST在饱和度(%)2.85 ppm的频率计算,和GlyCEST地图创建(图2(一个))。GlyCEST(%)与甘氨酸浓度的上升和增加线性与甘氨酸浓度显著相关(R2= 0.99, )(图2 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
GlyCEST效果。(一)z-spectra幻影包含不同的甘氨酸浓度(pH值7.0)。(b) c不对称在不同饱和补偿不同的甘氨酸浓度。相同的计算是用来确定GlyCEST (%)。
(一)
(一)
(b)
(b)
图2
(一)GlyCEST幻影的地图。(b)显著线性相关性GlyCEST(%)和甘氨酸浓度。
3.2。相关性GlyCEST(%)和甘氨酸浓度由高效液相色谱法

WT老鼠(nGlyCEST = 9)成像,roi被放置在大脑皮层和丘脑基于相应的区域在T2WI图像(图3(一个))。GlyCEST成像后,小鼠大脑皮层和丘脑的提取,高效液相色谱分析。GlyCEST(%)值明显高于在丘脑皮层( )(图3 (b)),这是符合甘氨酸浓度的高效液相色谱(图3 (c))。这一发现表明,GlyCEST可以检测局部脑甘氨酸浓度的差异。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
GlyCEST C57BL / 6和甘氨酸浓度影响野生型小鼠(WT) (n= 9)。(一)t2加权图像旋转回声(T2WI)显示感兴趣的区域(roi)冠状脑片(左面板)和相应的GlyCEST地图(中心面板)。相应的GlyCEST(%)和甘氨酸浓度检测高效液相色谱(HPLC)分析皮层和丘脑也显示面板(右)。(b) GlyCEST(%)在皮层和丘脑以T2WI-defined roi。(c)甘氨酸浓度的皮层和丘脑被高效液相色谱法。GlyCEST和高效液相色谱法测量,甘氨酸浓度在丘脑高于皮质。使用成对的数据进行了分析t以及( )。

一些老鼠WT (nGlyCEST = 5)成像的两倍(补充图s - 1 (a)),roi被放置在大脑皮层和丘脑(补充图s - 1 (b))。皮层和丘脑GlyCEST(%)值显示优秀的可以在皮层和丘脑(0.88)(补充表s - 1)。这些结果表明,GlyCEST测量是可靠的。

3.3。区域GlyCEST效果

接下来,我们成像GlyCEST WT (n= 7)和5 xfad (n= 7)老鼠。图4(一)地图显示代表GlyCEST WT(右上面板),5 xfad(右下面板)老鼠。5 xfad GlyCEST影响小鼠低在皮层和丘脑在WT老鼠相比。在次区域分析,GlyCEST(%)明显降低在顶叶皮层( ,图4 (b))、颞叶皮层( ,图4 (c))、丘脑( ,图4 (d)5)xfad老鼠WT动物相比。没有海马体(图中观察到的差异4 (e))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图4
在WT GlyCEST效应(n= 7)和5 xfad (n= 7)老鼠。(a) T2WI roi日冕大脑切片(左面板)和相应的GlyCEST地图(右面板)。(中)GlyCEST(%)顶叶和颞叶皮层、丘脑和海马。使用未配对的数据进行了分析t以及。 , ,和 。

图5显示之间的关系HPLC-determined甘氨酸浓度和GlyCEST(%)值WT和5 xfad老鼠的大脑。GlyCEST(%)明显与甘氨酸浓度的高效液相色谱法(R2= 0.4854, )。


图5
高效液相色谱法和GlyCEST测量之间的相关性。GlyCEST(%)明显与甘氨酸浓度测量通过高效液相色谱法。

4所示。讨论

氨基酸残基,如北半球,北半球2,-哦组,与周围的水分子交换质子。通过应用选择性饱和脉冲,可以检测组织内的特定分子,如糖类、氨基酸、发射器和核苷。虽然各种成像和内源性物质的应用实例,包括恰当的c (22- - - - - -24]和GluCEST [25,26),已报告,c成像的甘氨酸尚未被描述。因为甘氨酸具有很高的化学汇率与自由水(27],饱和度高功率短脉冲时间需要GlyCEST形象。高功率饱和脉冲增加特定的吸收比率(SAR)和核磁共振成像系统上可能征收高负载,导致系统的局限性。在这项研究中,火车10高斯脉冲,而不是连续波脉冲,是申请presaturation减少射频(RF)放大器系统上的负载(28]。通过这一战略,大功率辐照可以只要射频系统允许执行。

丘脑的GlyCEST效果高于C57BL / 6 WT小鼠大脑皮层。这个结果证实了高效液相色谱法测量。此外,这一研究获得的GlyCEST地图是在良好的协议与以前的组织病理学研究的结果,检查细菌人工染色体表达增强绿色荧光蛋白转基因小鼠专门甘氨酸转运体2启动子的控制下(29日]。

AD的发病机制尚未阐明;然而,淀粉样蛋白假说是被广泛接受的30.]。这一假说表明,广告开始于异常的病理过程(β淀粉样蛋白的积累β),其次是τ蛋白的积累,最终导致神经元死亡。然而,在AD患者异常蛋白质积累并不一定与病理学时空上关联,和突触赤字出现在最早的阶段(31日]。NMDA受体通道,控制钙离子的流入,和通道打开需要绑定的甘氨酸和谷氨酸。一项研究使用后期患者大脑标本广告报道,甘氨酸水平降低AD患者相比的优越的额叶脑回的健康受试者(10]。在目前的研究中,在顶叶皮层GlyCEST效应较低,颞叶皮层和丘脑5 xfad老鼠,支持先前的研究的结果。一个β聚合增加NMDA受体活性和诱导会(32]。因此,它可能抑制长期势差,导致认知障碍(33,34]。皮层和丘脑甘氨酸损耗的原因5 xfad老鼠仍不清楚。然而,由于extrasynaptic NMDA受体的激活可能会涉及(35]。门冬氨酸受体存在于intrasynaptic和extrasynaptic区域的神经元。Intrasynaptic NMDA受体调节神经功能。然而,增加活动的extrasynaptic NMDA受体被认为引起由于会引起神经元死亡。美金刚胺,改善AD患者认知症状,被认为施加其影响通过抑制extrasynaptic NMDA受体的活动(36]。类似于甘氨酸,D-serine是一种小分子,结合NMDA受体甘氨酸结合位点,从而把NMDA受体激活处于准备状态。一个β肽促进星形胶质细胞通过合成和释放D-serine丝氨酸消旋酶激活。此外,增加反应性星形胶质细胞由于炎症反应可能会进一步上调D-serine合成(37]。过度D-serine释放可能导致会通过激活extrasynaptic NMDA受体,导致突触丢失,甚至甘氨酸浓度减少由于神经损失(38,39]。另一方面,甘氨酸的生物合成是保持平衡与L-serine丝氨酸hydroxymethyl-transferase [40]。丝氨酸消旋酶的活性增加β可能导致合成D-serine L-serine,导致减少L-serine和甘氨酸的水平。另一方面,GlyCEST效应在海马体WT没有差异和5 xfad老鼠,这是一致的发现人类的一项研究[41]。然而,目前尚不清楚为什么海马体保留甘氨酸含量5 xfad老鼠。我们组最近报道,树突和轴突密度5 xfad老鼠却降低了大脑皮层,但不是在海马体(26]。同样,组织病理学的一项研究发现,在5 xfad老鼠,5层的神经元密度减少大脑皮层但保留在海马体(42]。这些地区差异可能影响甘氨酸浓度的分布。

目前的研究也有一些局限性。GlyCEST效应确定在本研究中可能有一些混杂因素在评估脑甘氨酸浓度。GlyCEST效果pH-dependent和增强在酸性条件下27]。其他脑部代谢物,磁化传递(43)和核奥佛好塞增强(44),也可以调节GlyCEST效果。然而,我们证实GlyCEST效应的线性相关与甘氨酸浓度使用幻影,和生化试验也进行确认GlyCEST方法的有效性。

5。结论

在这项研究中,CEST-MRI技术提出了小鼠大脑中的甘氨酸浓度分布地图。结果表明,GlyCEST成像可以定量测量大脑中甘氨酸浓度。C57BL / 6小鼠获得GlyCEST数据显示良好的协议与甘氨酸浓度的生化测量在丘脑高于皮质。5 xfad小鼠动物模型的广告,在大脑皮层和丘脑GlyCEST影响,但不是在海马体,低于在WT老鼠。目前的方法提供了一本小说在活的有机体内成像工具人员捕捉甘氨酸浓度的变化。

数据可用性

数据和程序脚本用于支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这项研究的出版物。

确认

这项工作是支持jsp KAKENHI(批准号。18 k02762b和20 k16774)。

补充材料

补充材料的再现性评估GlyCEST测量。补充图s - 1: GlyCEST地图和GlyCEST(%)从两个测量在皮层和丘脑。(一)GlyCEST五C57BL / 6小鼠的地图(a e)。(b)的开放和封闭圆圈表示GlyCEST(%)的平均两个测量在皮层和丘脑,分别。补充表1:GlyCEST在皮层和丘脑(%)从两个测量和他们组内相关系数(可以)。(补充材料)