^99米TC-⁶⁸GA-ICG-标记的大团聚与人血清白蛋白的纳米胶体：使用三峰显像剂的合成方法商品化试剂盒

抽象

在前哨淋巴结（SLN）和无线电隐匿性病变定位（ROLL）的最新发展突出显示多峰造影剂的需要，提供了更好的术前的PET成像和术中映射由于荧光检测的改善。出于这个原因，我们已经研究了三峰SLN / ROLL靶向剂（^99米TC-⁶⁸GA-ICG）与大颗粒或纳米胶体清蛋白（MA / NC-HSA）的市售试剂盒。⁶⁸嘎PET成像确实提供了更好的空间分辨率和使得能够在手术期间预测信号强度。的存在^99米TC评估这些化合物的功效在体外而且在手术过程中。本研究的目的是优化这些两个放射性药剂的标记和标记，并评估其产率和稳定性。MA / NC-HSA粒子（Pulmocis®和NanoAlbumon®）的试剂盒被用于具有顺序放射性标记^99米Tc和⁶⁸Ga。使用三碳菁染料吲哚菁绿进行荧光标记。三标MA/NC-HSA的ITLC放射化学纯度为>95%。用光动眼探针扫描条带，测定荧光纯度。最后,在体外用DTPA和人血清溶液进行稳定性试验，评估荧光标记和放射性标记的效果。

1.简介

在前哨淋巴结（SLN）的最新发展，放射导向隐匿性病灶定位（ROLL）在乳腺癌和其它癌症，以及评价在健康和癌症组织局部灌注，指向需要一种多模态的造影剂，可以提供的映射通过正电子发射断层扫描（PET）或单光子发射断层摄影术（SPET）和术中映射手术前规划都更好截面图像通过荧光和/或放射性检测，使用手持式探头或便携式摄像机。两个主要的微粒药物一般用于上述目的，即，人白蛋白（NC）和大颗粒白蛋白（MAA）的纳米胶体。

前哨淋巴结（SLN）活检是一个在数种癌症，主要是乳腺癌和黑色素瘤常规和公标准化过程。^99米tc标记的NC是金标准治疗，尤其是在欧洲。最近，一种杂交示踪剂与吲哚菁绿(ICG)结合^99米Tc-标记的纳米胶体已示出的附加值[1，2]，这对提高SN检测不仅在常规而且在腹腔镜或机器人手术[1，3，4]。其他考虑的颗粒白蛋白制剂是MAA。由于他们的大小(大约80μm)，它们栓塞了先前用于肺显像的第一个毛细管前滤器，使研究区域灌注成为可能，特别是在肿瘤中。用PET或SPET示踪剂标记MAA，可准确定位肿瘤，建立灌注定量，荧光信号引导外科医生切除肿瘤[五]。几种方法已被提出，以辐射近红外(NIR)发射荧光团甘露醇-二乙烯三胺五乙酸(DTPA)-葡聚糖(Tilmanocept®)⁶⁸Ga和^99米前哨淋巴结的TC分子成像[6，7]，具有优良的效果。然而，Tilmanocept®PET扫描只是一个病人，而我们的目标是减少使用市售的，多剂量试剂盒的成本。在机器人手术的最新发展凸显了需要一个特定的过程，它可以识别网站和靶病变的轮廓[8]。PET图像较好的空间分辨率有助于外科医生在手术前更精确地定位淋巴结，而注射ICG后的荧光信号有助于机器人手术，使切除更加准确。此外，混合示踪剂可以帮助确定术中检测荧光特征所需的剂量[9]。为了改善这些临床应用中，我们已经研究并准备了三峰靶向剂^99米TC-⁶⁸Ga的ICG-MAA或-NC基于SPET，PET，和荧光成像[9]。的物理特性⁶⁸遗传算法isotope, given its high percentage of positron emission (89%), relatively short half-life (t½ = 67.71 min), and chemical properties, can label the various diagnostic molecules, making it an excellent positron emission isotope with superior resolution, speed, and quantification capacity [五]。这项研究的目的是获得即时的射频标记工具包，集成三个成像系统。这种创新的方法将使制备多用途、多用途药物成为可能。此外，这些放射性药物可用于诊断、定量、术前PET/CT或SPET-CT成像，并可用于术中混合成像。

2。材料和方法

2.1。材料

在我们的研究中使用的所有药品已经被商业化和授权给临床使用。Nanocolloid (nanosized human colloidal particles of ≤80 nm diameter, containing 0.5 mg human albumin) is a radiopharmaceutical commercially available as NanoAlbumon® (Radiopharmacy Laboratory Ltd., Budaörs, Hungary). We tested other commercially available nanocolloid kits (Nanocoll® GE Healthcare S.r.l., Milano), but due to supply shortages in 2018, we were not able to complete the tests and report our findings. The NanoAlbumon® kit is a sterile, nonpyrogenic, lyophilized mixture of stannous chloride, glucose, poloxamer 238, disodium phosphate dehydrate E339, and sodium phytate. MAA with a diameter up to 150 μm and a number of particles per vial, ranges between 2 × 10⁶和4。五 × 10⁶(Pulmocis®CURIUM CIS-Bio international, Saclay, France)。

该kit is a sterile, nonpyrogenic, lyophilized mixture of 1.0 mg albumin aggregated with 10 mg human albumin, stannous chloride (SnCl₂.2H₂O), 10 mg sodium chloride, and sodium caprylate. All the reagent solutions were prepared from sterile distilled water according to European Pharmacopea. The radiolabelling procedure involved only ultrapure reagents excluding metal needles to avoid any traces of metal impurities.

2.2。放射性标记

被顺序地执行NC或MAA的商业粒子放射性标记。该试剂盒首先标记^99米TC（按照制造商的说明），然后用⁶⁸佐治亚州的colabelled解决方案，然后与标记的ICG荧光分子。⁶⁸Ga和^99米TC剂量的CRC-15 PET剂量校准器（Capintec公司，新泽西州，美国）进行测定。该⁶⁸Ga和^99米标记洗脱前24小时，用8或6 mL盐酸或盐水洗脱Tc发生器，以消除⁶⁸锌和⁹⁹Tc，存在于发生器中，会影响合成产率。

2.2.1。^99米Tc NC和MAA标签

According to the manufacturers’ instructions, the NC kit was reconstituted with 1000 MBq of sodium pertechnetate [^99米TCO₄⁻]， 从...获取⁹⁹莫/^99米TCTekcis®发生器（锔IBA顺式生物，伊维特河畔吉夫，巴黎，法国）和每次注射氯化钠（0.9％）。该suspension was incubated at room temperature for 25 min, according to the standard labelling procedure. Likewise, the MAA kit was reconstituted with 1000 MBq of sodium pertechnetate obtained from⁹⁹莫/^99米每次注射用Tc Tekcis®发生器和氯化钠(0.9%)，然后根据标准标记程序在室温下孵育20分钟。

2.2.2。手册⁶⁸嘎标签

⁶⁸通用电气/⁶⁸Ga发生器(1.1 GBq TiO₂-based GalliaPharm® Eckert-Ziegler Isotope Products, Berlin, Germany) was eluted with 8 mL 0.1 N HCl (Eckert-Ziegler). 0.75 mL 0.1 N NaOH/phosphate buffer (1 mL) was added to this 0.1 N HCl solution of [⁶⁸Ga] Ga-氯，将pH值提高到6-6.5。将得到的4ml溶液(约370 MBq)加入^99米tc标记的试剂盒给出的最终体积为6毫升。混合30秒后，[⁶⁸Ga]Ga- nc悬浮液在75℃的恒温箱中孵育15分钟。(⁶⁸Ga- maa悬浮液在40℃热阻下孵育15分钟。只有塑料针作为金属痕迹的存在，可能会严重影响合成产率。

2.2.3。自动化⁶⁸嘎NC / MAA标签

为了限制职业暴露于放射性，并确保放射性药物的无菌性，我们还测试了一种自动标记系统的结果，使用ModularLabEAZY®（埃克特-齐格勒同位素产品，柏林）系统，其试剂可在无菌条件下进行设置。⁶⁸通用电气/⁶⁸遗传算法generator (GalliaPharm® Eckert-Ziegler 1,1 GBq) was eluted with 8 mL 0.1 M HCl. The generator was eluted 24 hours prior to synthesis to eliminate⁶⁸锌会影响产率。350 - 700的兆贝可⁶⁸GaCl₃(approximately 8.0 mL), were used in an automatic synthesis module. The⁶⁸镓洗脱预纯化并浓缩在SCX柱（ABX Radensberg，德国）。纯化⁶⁸遗传算法³⁺was obtained by eluting the column with 0.8 mL of NaCl/HCl 3 M solution (pH = 1). 2 mL of CH₃COONa / CH₃COOH 0.8 M缓冲液和400μ的EtOH / H L的₂O at 50/50 % (v/v) were added to the NC lyophilized kit together with 0.8 mL of⁶⁸遗传算法³⁺溶液从柱中洗脱。该final volume was approximately 3.5 mL. The reactor was heated to 75 ± 2°C for 15 min. The product was diluted to 8 mL with a 0.9% saline solution. The pH of the final product ranged between 4.0 and 5.0. All chemicals were manufactured by TraceSELECT-UltraPURE from ABX Radensberg, Germany. The same procedure can be used for MAA automated labelling incubated at 40 ± 2°C for 15 min.

2.3。荧光标记

Indocyanine green is a negatively charged, tricarbocyanine dye, with a molecular weight of 751.4 Da. Pharmaceutical ICG is available in a dry form (25 mg, ICG Pulsion Medical Systems, Feldkirchen, Germany), stable at room temperature and soluble in water. A vial of ICG was dissolved in 5 mL of sterile water, and its final concentration was about 6.65 mM. 100 μ此溶液L的溶液中加入到^99米TC-⁶⁸Ga-NC / MAA的解决方案。然后我们取了500μL of the sample, which was centrifuged at 4000 rpm (12000 rpm for NC) for 10 min in a 1.5 mL vial and then washed with 500 μ大号生理盐水。该循环重复3次。

2.4。NC最终解决方案

该final radio and ICG-labelled solution (total volume 6 mL) contains 7.25 nmoles of NC (0.5 mg aggregated HSA), 1 GBq of^99米Tc (5.31 × 10^-11摩尔，8.85×10^-9 M), about 270 MBq of⁶⁸Ga(2.64×10)^-12moles, 4.40 × 10^-10 M), and 0.5 mg ICG (665.4 nmol, 1.11 × 10^-4米)。

2.5。MAA最终的解决方案

该final solution (total volume 6 mL) contains 14.49 nmoles MAA (1 mg aggregated HSA), 10 mg HAS, 1 GBq of^99米Tc (5.31 × 10^-11摩尔，8.85×10^-9 M) about 270 MBq of⁶⁸Ga(2.64×10)^-12和0.5 mg ICG (665.4 nmol, 1.11×10)^-4米)。

2.6。基于自动合成模块NC / MAA最终解决方案的准备

该final solutions (total volume 8 mL) contain 14.49 nmoles MAA or 7.25 nmoles NC, respectively: 1 GBq of^99米Tc (5.31 × 10^-11摩尔，8.85×10^-9 M), 270 ÷ 550 MBq of⁶⁸遗传算法(2.64 ÷ 5.28 × 10^-12和0.5 mg ICG (665.4 nmol, 8.32×10)^-5米)。

2.7。质量控制

质量控制（QC）进行验证的标记率和稳定性^99米TC-⁶⁸Ga-ICG-NC / MAA。免费的百分比^99米Tc和ICGwas evaluated by thin-layer chromatography, using ITLC-SG (Varian, Folson–USA) as a stationary phase (15 cm long and 2 cm wide) and CH₃OH : H₂O 85 : 15 as a mobile phase. A 10 μL将含有样品的溶液点涂在距底边约1.5 cm的条带上。然后将条带放入分离室，溶剂运行至少10-12 cm。标记的NC/MAA仍然在应用点，而自由^99米TC高锝酸盐和游离ICG迁移随溶剂前沿。免费的百分比⁶⁸遗传算法was assessed in the same way, using 0.1 M tribasic-citrate solution, adjusted to pH 6 with HCl, as a mobile phase. NC/MAA labelled with⁶⁸嘎停留在应用点，而免费⁶⁸Ga随溶剂前缘迁移。根据欧盟药典说明书，我们还评估了通过聚碳酸酯膜过滤器过滤MAA标签的质量控制(3)μm孔径，25mm直径;和Swin-Lok®25 mm过滤器(Nuclepore-Whatman, GE Healthcare，米兰，意大利)。在同一条ITLC-SG条带上使用手持荧光成像仪PDE探针(由SEDA S.P.A.意大利公司生产的PhotoDynamicEye Hamamatsu)检测荧光标记率。

2.8。稳定性测试

标记和标记化合物(MAA和NC)的稳定性评估是通过PBS(磷酸盐缓冲盐水)稀释试验或使用强螯合剂DTPA(二乙基三胺五乙酸)的挑战试验进行的。

PBS稀释test: 1 mL of compound was diluted to a total volume of 100 mL; DTPA challenge test: 1 mL of compound was diluted to 100 mL using a 1 mM DTPA solution.体内stability simulation of the trimodal labelled agents was carried out incubating 1 mL of compound in 9 mL of human serum (total volume 10 mL) for 1 and 24 hours, respectively, at 37°C. Due to⁶⁸遗传算法’s short half-life, the 24 h tests cannot be performed on compounds labelled with this isotope.

2.9。纳米胶体尺寸的测量

颗粒直径的百分比分布（数和体积）通过动态光散射（DLS）使用Zetasizer粒度分析仪（马尔文仪器，马尔文，UK）测定的。This instrument has a measuring range of 0.4 nm to 8.6 μ米Analysis was performed with a 90° angle over a glass cell containing 1 mL of the nanocolloidal sample at room temperature (20°C, refractive index at 578 nm = 13331, absorbance at 630 nm∼0). The nanoparticle shape was observed by electron microscopy (150000–300000x).

2.9.1。放射性分布后^99米TC标签

真空下纳滤法是一种测定不同尺寸纳米粒子中放射性分布的方法。聚碳酸酯膜过滤器(孔径50和30纳米，直径25毫米;使用的是Nuclepore-Whatman)和Swin-Lok 25mm滤镜支架(Nuclepore-Whatman)。一个0.1 mL的样品^99米TC-⁶⁸GA-ICG-NC was passed through the cascade of two filters and rinsed with 5 mL of N₂吹扫的milliQ水中（Milli-Q系统，默克，达姆施塔特，德国）。Filtered radioactive fractions (as percentages) were determined using a 3 × 3  inch NaI(Tl) pinhole 16 × 40 mm gamma counter (Raytest, Straubenhardt, Germany). An overpressure of N₂在滤波器的顶部使得能够排除氧的存在，使更快的过滤过程[10]。

2.10。MAA颗粒大小的测量

所有测试均使用Pulmocis®商业试剂盒进行，因为它是截至2018年10月意大利市场上唯一的MAA产品。光学显微镜测量每瓶的颗粒大小和数量，使用伯克-土耳其细胞计数室。测量是在之后进行的^99米Tc和⁶⁸嘎标签，在40℃下。软件ImageJ®（健康美国全国学院）用于图像处理和测量。

2.11。体外实验

为了模拟乳房外科手术过程，我们设计了一套模拟乳房外科手术程序离体在全乳房切除术后进行检测。试验在两个手术室进行，一个配备卤素手术灯，另一个配备LED照明灯。300年μl (50 MBq)的^99米TC-⁶⁸将Ga-ICG-MAA注射到选定的乳房部位。与此同时，300人μ自由ICG（根据SPC的药物的适应症的方法制备）的升注射入乳房的另一区域。

3.结果

3.1。放射性同位素纯度

放射性同位素纯度测定后进行评价⁶⁸遗传算法decay, with a 3″ × 3″ NaI(Tl) pinhole gamma counter. The⁶⁸在最终产品中发现的Ge百分率是<总放射性的0.001％，根据欧洲药典。对于⁶⁸Ga-radiopharmaceuticals。

3.2。标签产量和质量控制：放射化学和荧光纯度

测定了其放射标记率和放射化学纯度^99米TC-⁶⁸ga标记的MAA和NC(表)1)总高于97%，即时薄层色谱测定。ITLC条带没有显示溶剂前端的放射性(RF约为8 cm)。每个部分的百分比相对于色谱的总活性被确定。同样，ICG标记的MAA和NC在ITLC条带上应用时仍然存在，而游离ICG在溶剂前沿迁移(如图)1-6)。MAA的免费的QC过程中未检测到显著差异^99米TC /⁶⁸镓，当将其用3过滤 μ米的聚碳酸酯过滤器。反应收率是显著受pH的影响，并且必须进行控制。pH values <3 and >10 give very poor labelling results.

3.3。放射化学和荧光稳定性试验

在PBS中稀释的测试和挑战试验与两个MAA的DTPA和NC化合物标记有⁶⁸嘎，^99米Tc和ICG显示出放射性和荧光分布与未稀释的对照（表可比2和3)。在用柠檬酸三盐0.1 M显影的ITCL-SG试纸的溶剂前沿检测到可忽略的放射性/荧光痕迹(<5%)。因此，定值产品的百分比总是超过95%。^99米TC-⁶⁸GA-IGC-MAA exhibited good stability both after 1 h and 24 h incubation with human serum for all labelling agents.^99米TC-⁶⁸GA-IGC-NC also exhibited good stability after 1 hr and 24 hr incubation for^99米锝标记和IGC标记剂，而键的稳定性与⁶⁸遗传算法dropped to 80% after 1 hr incubation.

3.4。NanoAlbumon®商用试剂盒中颗粒大小的测量

Particle diameter ranges between 12 and 122 nm. 30% of the total number of particles were found to have a diameter of about 18 nm (SD = 3 nm), and 99% have a diameter of <33 nm [10]。电镜观察到的纳米颗粒形状如图所示7。

3.5。放射性分布与纳米胶体大小后^99米TC /⁶⁸嘎标签和ICG标记

放射性分布数据表明^99米TC-NC-HSA commercial kits, less than 10% of radioactivity bound to particles with a diameter <15 nm [10]。最大放射性(约50%)与直径在30到50纳米之间的粒子绑定。表4和五报告直径为30和50纳米的颗粒的标签值的百分比。标记和标记程序对三维分量之间的放射性分布没有实质上的影响。

3.6。一个MAA商业套件的粒度测量

光学显微镜表明，Pulmocis®MAA商业试剂盒由不规则颗粒聚集体，其尺寸7和100之间的范围内的混合物的 μ米，具有约50个粒子的患病率 μ米（图8)。大骨料平均约2765000 MAA颗粒/瓶，符合厂家规格(2-4×10)⁶粒子/瓶)。我们开始测量标记有MAA的商业工具包的颗粒大小⁶⁸如文献报道，Ga在75℃孵育15 min后[11-14]。但是，光学显微术揭示MAA颗粒尺寸和结构的实质性改变。In fact, when heated to 75°C, a fraction of the macroaggregates disaggregated into subunits of about 7 ± 2 μ米（图9)。After being centrifuged at 300 rpm × 5 min, this fraction contained an amount of total radioactivity of about 5.5%. Therefore, we decided to reduce the⁶⁸Ga标签温度从75℃到40℃。这保留了颗粒的结构和大小，以及标签产量(>99%)和稳定性参数，这些基本没有变化(表)3和图8)。

3.7。体外样品分析

我们的目标是比较自由的ICG组织灌注与ICG必然^99米Tc和⁶⁸Ga-标记的MAA。与PDE手持荧光成像探针获得了离体的图像（图10)。荧光成像被用于可视化注入乳房组织和淋巴组织后的定位和示踪剂的分布（图11)。体外实验表明，游离ICG快速、专一地扩散到周围区域，扩散范围可达数厘米(图)12)，使其无法用于鉴别肿瘤。相反，icg标记的MAA制剂仍然严格限制在注射区域，因此可以准确识别并切除(图)13)。此外，体外实验表明，这种示踪剂也可用于解剖病理诊断。事实上，放射性信号会迅速衰减，而荧光信号可以在几天内被检测到，比如在淋巴结和被移除的组织样本中。

4。讨论

多模态成像是改变临床成像领域一个比较新的概念。用荧光团的放射性核素的组合使得能够评估和定位使用SPET / PET-CT或MRI的疾病。此后，术中的定位变得容易与成像或非成像可检测放射性和/或光信号的探针。这种方法要求能够发出核常兼备的光信号[代理15-17]。

文献中有几个双峰方法的例子[1，2，18-20.]，而据我们所知，这是对标签中使用的三模态法HSA颗粒的第一次尝试。

我们的研究结果也证实，有可能获得一种三峰示踪剂使用开发一个商业化试剂盒^99米锝标记（白蛋白大团聚和纳米胶体人血白蛋白）和可用ICG和⁶⁸嘎氯化物无菌前体。所述试剂盒首先双放射性标记与⁶⁸Ga和^99米然后用荧光ICG标记Tc [9]。

这种方法带来了两个问题。第一个问题涉及使用同一试剂盒而不改变其化学成分的标签方法的技术兼容性，第二个问题涉及在常规辐射损害和临床实践中使用该程序的实际考虑。

一些已经尝试标记MAA市售试剂盒与⁶⁸GA，这排除锝标记[21]，避免使用中间螯合剂。射电金属是通过螯合作用典型地结合到纳米粒子22]。但是，这种方法仅限于有关白蛋白颗粒[试点研究12，13]。更近期的研究，包括我们自己的发现，表明有效率⁶⁸Ga标记不需要预先与DOTA或其他螯合剂结合。

的化学性质⁶⁸GA结合NC / MAA尚不完全清楚。一种假说涉及水解不溶性氢氧化镓的NC / MAA的表面上的吸收。相反，一个收集机构由于嘎的特异性相互作用³⁺不能排除暴露在粒子表面的蛋白孤对离子[11]。pH值是影响Ga与NC/MAA结合的重要参数，最佳范围在3.5 - 6.5之间[3，11-13正如我们的结果证实。在所有的可能性，蛋白质结构不利于的结合在强酸性条件下很复杂。中和的⁶⁸通用电气/⁶⁸嘎发生器洗出液可能会逐渐增加GA的亲和力（OH）₂⁺，镓（OH）^{2 +}，和Ga（OH）₃NC/MAA化学种类。

孵化温度是一个更重要的因素。最初，我们跟着穆勒等人的指示。[14，谁获得了⁶⁸GA-MAA labelling yield of about 99 ± 0.5%, after 15 minutes of incubation at 75°C, at pH 6. However, as highlighted in the results, the 75°C incubation of Pulmocis® leads to the partial loss of MAA structure and to a drastic dimensional decrease from 50 μ米至小于7 μ米由于这些MAA亚基的尺寸与毛细血管的直径相当，我们推测颗粒的温度相关的碎片可能会降低MAA的栓塞效果，牺牲几个在活的有机体内这些化合物的诊断应用。事实上，这些小片段可以携带放射性物质的量显著。片段小于10 μm逃脱了毛细管过滤器，被脾脏、肝脏和骨髓中的RES所吸收，从而恶化了目标与背景的比例，阻碍了定量方法。Shanehsazzadeh等人[3]报道，离心后，约1.31%的MAA颗粒直径小于2μ直径在2到10之间μ在小鼠实验中，会导致肝脏和肾脏的不良摄取，以及约0.6%的骨髓不良摄取。

孵育温度为40℃，标签率保持在99%以上，避免了上述现象，稳定性测试无显著差异。

我们的数据与文献相比，我们推测，大小和形态差异与使用，并紧扣贴标温度MAA的商业套件。毛斯等人。[8使用MAA GE试剂盒(Maasol)在95℃时未观察到任何碎片，但作为Shanehsazzadeh等人领导的另一项研究的合著者[3]，他也利用帕尔斯同位素公司试剂盒（TCKPars-1800），当在75℃下，报碎片。然而，颗粒尺寸和形态后⁶⁸Ga标记还没有被详尽地阐明在文献中。只有六个小组关注这个问题[3，8，11，14-16]。他们四人[8，11，14，16]不与光学显微镜或SEM [观察颗粒尺寸和形态的任何修改或者8]，而其他两组[3，15]标记后确认MAA碎片，因为在我们的经验观察。

在有关的文献中可获得的信息较少⁶⁸HSA纳米胶体的镓标记。毛斯的企图[8标记纳米胶体(Nanocoll®)的效果不佳，因为可能发生了颗粒的凝集，改变了它们的大小。在大鼠体内静脉注射后，所产生的颗粒主要集中在肺而不是肝脏。作者将这种凝集归因于75℃的反应温度。Maus等观察到的凝集[8]可能是由于prelabelling洗涤步骤和除去存在于该制剂中的泊洛沙姆358。相反，我们并没有观察到NC颗粒的任何显著结构或大小的修改后⁶⁸遗传算法labelling for 15 min at 75°C. In fact, Nuclepore filtration of NanoAlbumon® showed only a negligible size variation after⁶⁸嘎标签和证实了我们之前的报告中的数据[10]。

ICG是标签程序的第三个步骤。ICG必须先溶于5 mg/mL的水，然后用生理盐水稀释，因为它不容易溶于这种溶液。标记率和稳定性测试证实了它与MAA和NC的牢固和稳定的结合。标记后用ITLC观察到的游离荧光团的数量并不影响其质量在活的有机体内应用中，由于在人体内其短的生物半衰期，这表现在其他作者[18]。一些临床试验已经使用^99米未评估ICG与NC的绑定百分比的Tc-ICG-NC [19]。游离ICG可能与脂质脂蛋白复合物结合(β-lipoprotein）20.，比icg与游离胆固醇结合产生更强烈的荧光[21]。其血液中的蛋白质结合逐渐朝向较长波长偏移IR吸收峰和发射峰[22]。

之前的学习 [3，8，11，13]之前已经强调了预洗步骤的重要性⁶⁸Ga标签，以去除商业试剂盒中存在的锡(II)、游离白蛋白、表面活性剂和其他辅助剂。我们故意省略了这个预洗步骤，因为工具包需要标记^99米TC其次是因为穆勒等人。[14报道中没有显著差异⁶⁸使用无辅料和原MAA试剂盒的Ga的放射性标记收率。

我们没有通过离心执行我们的化合物postpurification放弃任何免费⁶⁸总会计师及ICG [3，8]因为⁶⁸嘎的标记率总是≥97％，并免费ICG的量不限制其在活的有机体内因其生物半衰期短而使用[23]。不仅没有这个程序允许我们减少标记时间，而且微生物污染的洗涤过程中的风险和减少职业暴露。

的稳定性^99米TC-⁶⁸Ga的ICG-NC / MAA化合物通过测试它们在稀溶液结合，在人血清中与DTPA激发试验和温育证实。金属离子和稀释后的NC / MAA颗粒移向解离，释放出放射性金属之间的配位反应平衡。在我们的研究中，标记率呈恶化的PBS稀释试验无显著迹象。作为非环状配体配合物DTPA镓以高亲和力，我们用它来剥离不太稳定，从化合物的非特异性结合的Ga的离子。产生的放射性的损失可以忽略不计，虽然略有NC比MAA更明显，但并不可能影响其在活的有机体内行为。人血清稳定性，在37℃下为至少一小时，模拟皮下或实质内施用后的生理条件。所有的标记的化合物进行测试证实其在血清中的稳定性，除了NC揭示的显著损失⁶⁸Ga。在临床中，这种损失可能不是一个限制，因为游离镓(Ga)³⁺）迅速地被循环淋巴除去。

体外在乳腺组织稳定性进一步证实其在体外稳定，即使这样离体该模型没有考虑其他附加参数，如循环血液。

关于使用多示踪剂的另一个问题涉及稳定的干扰，由于不同的标签可能改变其生物分布。从理论上讲，辐射可诱导的染料radiobleaching。然而，使用多模态示踪剂其制备后，立即在这种情况不会发生，因此，在我们的配方，它们不影响在活的有机体内生物分布[24]。

我们建议的试剂盒标记程序可以调整，以满足特定的临床需要，使用一个、两个或三个成像组件。van Leeuwen等人[20.]总结和比较用于SLN程序不同的示踪剂，突出混合示踪剂的好处。

ICG无法被人眼可以看出端倪。在手术室照明中使用可与IR探头采集的成像（PDE）干涉。如果照明具有在红外光谱中的强发射，使用常规的卤素灯的情况下，ICG信号不能从背景区别开来。LED灯外科用在黄 - 绿光谱几乎单色光发射避免这个问题。

与游离ICG单独相关的另一个问题是上覆组织的衰减。事实上，深度超过0.5 - 1cm的目标是不容易被探测到的。其他作者(25，26当深度超过2cm时，认为病灶检测不充分，而放射性信号仍可清晰检测到。此外，荧光发射的非定量特性进一步阻碍了ICG作为单一示踪剂的使用。此外，在其他身体区域，如头颈部或盆腔区域，淋巴引流在患者间表现出广泛的差异，还涉及其他问题[27，28]。

当SLN位于靠近注射部位，其活性可以通过施用的放射性的量越大被掩蔽。这种所谓的光泽通现象限制术前检测到与平面闪烁或SPET-CT [29]。使用PET-CT，具有更好的空间分辨率，可避免这个问题。此外，机会来量化SUV（标准化摄取值）而言绝对目标摄取允许医生预言术探测。在手术探查，荧光信号是位于更好并清楚地辨别从注射部位的靶，如由离体实验。

表6总结的前和手术中设置不同的标记技术的优点和CON因素。

相较于γ和β⁻发射器,β⁺isotopes are less frequently used in radioguided surgery due to the large amount of 511 keV annihilationγ射线，引起了几个问题。首先，很难准直这些光子，其次，因为它增加了操作人员的辐射暴露。另一种方法可能是使用对511 keV光子基本透明的专用正电子探测器，从而避免了对目标准直和深度评估的限制。最近Collamati等人[三十]实验了一种基于对三苯的探针原型，它可以成功地用于⁶⁸Ga和其他β⁺同位素。⁶⁸嘎的半衰期短，需要从示踪物进行彻底的规划过程，PET扫描和运送病人到手术室[31，32]。

我们三峰化合物的​​另一种实际应用中可能是其在机器人手术中使用。如果ICG荧光与来自相同探测放射性信号组合病变的确切部位的鉴定大大增强[33，34]。特别地，达芬奇机器人可以配备有一个荧光成像器和放射性检测系统，从而避免与使用卤素灯的问题，开放式手术过程中发生。最近很少有研究调查了PET / CT引导下的机器人辅助外科手术和机器人臂PET / CT辅助活检[中的潜在作用五，32]。虽然进一步的研究和验证测试必须在其临床使用前进行，我们有信心^99米TC-⁶⁸GA-ICG-NC / MAA示踪剂还可以用来很大的优势在机器人手术。

5.结论

这第一次尝试示出了获得三峰成像的可行性（γ/β⁺使用一种商用的白蛋白大聚集物或纳米胶体的试剂盒，使用一种简单的程序，不需要额外的步骤，如离心和纯化前或纯化后。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的实验​​室实验数据请直接从相应的作者。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

作者的贡献

马可·乔瓦尼·佩西科和曼努埃拉MARENCO同等贡献这项研究。

致谢

笔者衷心感谢Campoverde S.R.L.（米兰，意大利）的免费送货NCNanoAlbumon®商业套件，SEDA S.P.A.（米兰，意大利），用于提供PhotoDynamicEyeHamamatsu®探头，和夫人凯伦·道尔对英语语言编辑。

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