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对比媒体与分子成像
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对比媒体与分子成像/2017年/文章
特殊的问题

Theranostic为癌症成像探针

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2017年 |文章的ID 1686525 | https://doi.org/10.1155/2017/1686525

赵Wanqin Wang Jun,庐山逍夏温家宝,柯蒂斯Chun-Jen林,俊杰,黄黔Yongqiang Yu Shiaw-Yih Lin Chun李, ”MicroPET / CT成像的一半寿命的差别妳对这些抑制三阴性乳腺癌”,对比媒体& # x26;分子成像, 卷。2017年, 文章的ID1686525, 11 页面, 2017年。 https://doi.org/10.1155/2017/1686525

MicroPET / CT成像的一半寿命的差别妳对这些抑制三阴性乳腺癌

Wanqin王,1,2 小君赵,1 庐山逍夏温,1 柯蒂斯Chun-Jen林,3 俊杰李,1 钱黄,1 Yongqiang余,2 Shiaw-Yih林,3 和 春李1

1美国癌症系统成像,德克萨斯大学MD安德森癌症中心,休斯顿,TX,美国

2放射学、安徽医科大学第一附属医院,合肥,安徽,中国

3系统生物学、德克萨斯大学MD安德森癌症中心,休斯顿,TX,美国

学术编辑器:Kai杨
收到了 07年2月2017年
接受 2017年04月02
发表 2017年5月14日

文摘

妳的固体中受体酪氨酸激酶是过表达的肿瘤类型包括三阴乳腺癌(TNBC)。妳是epithelial-to-mesenchymal过渡的重要调节器(EMT)和TNBC的潜在的治疗目标。在这项工作中,我们使用microPET / CT64年Cu-labeled反妳抗体(64年Cu-anti-hAXL)动物询问妳体内的降解反应17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG),一半的有效抑制剂。17-AAG治疗引起妳表达式能显著降低原位TNBC mda - mb - 231肿瘤,抑制EMT,和体内肿瘤生长延迟,导致显著减少肿瘤吸收64年Cu-anti-hAXL microPET / CT明确可视化。我们的数据表明,64年Cu-anti-hAXL可以用于监测anti-AXL一半寿命评估治疗和抑制分子伴侣使用妳作为分子代理。

1。介绍

大多数乳腺癌死亡源于疾病复发由于入侵和转移(1]。人们认为epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)的激活肿瘤细胞转移和治疗失败(密切相关2,3]。三阴乳腺癌(TNBC)构成15% -20%的乳腺癌。TNBC的治疗是一个挑战由于异质性的疾病和缺乏可操作的目标4,5]。有一个未满足的医疗需要识别和验证分子TNBC的目标。

妳属于受体酪氨酸激酶TAM亚科包括TYRO-3,妳和海洋博物馆。妳通常是由其自然配体激活GAS6(增长arrest-specific蛋白质6)。妳随后激活激活MAPK / ERK和PI3K / AKT信号通路,导致肿瘤生长和入侵6]。妳是EMT在乳腺癌的重要调节器(7),神经母细胞瘤(8),而非小细胞肺癌(9]。妳表达升高与贫穷有关肺肿瘤的结果(10],乳腺癌[11),胰腺(12]。它还与耐药性(13,14]。迈耶et al。15]显示,TNBC细胞和表皮生长因子受体之间的相互作用和妳妳的一个可能的作用抗表皮生长因子受体抑制剂。因此,显示了抗肿瘤活性[差别妳对这些16- - - - - -18]。的first-in-class small-molecular-weight妳抑制剂BGB324(原名R428)被带到2013年临床试验(19]。在最近的一项研究中基于1789从969年蛋白质酪氨酸磷酸化肽识别,妳被发现被激活在大多数激进TNBC细胞系(20.]。综上所述,对TNBC妳是一个潜在的治疗目标。

因为妳在TNBC的新兴角色和其他癌症,重要的是要评估是否治疗衰减的妳可以无创成像和量化表达,这将提供有价值的信息来评估对治疗的反应,调节妳表达水平。因为small-molecular-weight妳抑制剂R428只影响妳但不是妳蛋白的磷酸化水平,我们选择90年热休克蛋白抑制剂(一半),17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG)作为模型药物。差别妳对这些先前的研究已经表明,妳的是客户端之一蛋白质以及,妳可以下调一半抑制剂(21,22]。本研究的目的是调查是否microPET / CT64年的差别Cu-labeled anti-AXL抗体可用于监测对这些由17-AAG妳。

2。实验部分

2.1。化学和放射化学

Anti-hAXL抗体或免疫球蛋白g混合p-SCN-Bn-DOTA摩尔比率为1:1 50 M碳酸氢钠缓冲溶液(pH值8.5)。反应混合物在一夜之间被孵化在4°C,然后DOTA-conjugated抗体纯化在PD-10列(通用电气医疗集团,马尔伯勒,MA)使用磷酸盐生理盐水(PBS)作为洗脱液。放射性标记的整除64年CuCl2(2µL, 74年0.1 N HCl兆贝可)在40稀释µL 0.1醋酸钠缓冲(pH值6.0)。最终的解决方案被添加到水溶液中DOTA-anti-hAXL或DOTA-IgG -37兆贝可18.5的比率64年铜/ 25µg抗体。孵化后45°C 45分钟,反应混合物含有放射性标记的anti-hAXL和免疫球蛋白g受到即时薄层色谱法(ITLC)分析来确定放射性标记效率。

确定的稳定性64年Cu-labeled抗体,64年Cu-anti-hAXL或64年铜-免疫球蛋白是孵化PBS中含20%小鼠血浆在37°C 48 h。放射性在最初的地点被记录的百分比的总放射性ITLC地带。的64年Cu-antibody轭合物纯化PD-10列上。

2.2。体外细胞结合分析

细胞在体外特定绑定的64年Cu-anti-hAXL AXL-expressing人类mda - mb - 231细胞是通过竞争性评估方法(23]。简单地说,细胞(2×106细胞/毫升)绑定缓冲(PBS 1%牛血清白蛋白(BSA))被镀在过滤板(96 -;孔隙大小,0.65µm;微孔、Billerica MA)在1×105细胞/好,室温下孵化64年Cu-anti-hAXL (1500 Bq /)的浓度增加冷anti-hAXL抗体(0 - 667 nmol / L,总量200µ为2 h L)。之后,这些细胞被洗了三次PBS (0.1% BSA)和干的放射性cell-bound过滤器使用γ计数器测量。50%抑制浓度(IC50mda - mb - 231细胞)值的计算是通过拟合的数据使用GraphPad Prism 6.05版本(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)。三为每个样本进行了复制。

2.3。细胞培养

细胞系都写明ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州)购买的。乳腺癌MCF-7、T47D和mda - mb - 231细胞生长在RPMI 1640中有10%胎牛血清的边后卫,100 UI /毫升青霉素,和100年µ克/毫升链霉素。Hs578T在杜尔贝科修改基本培养基培养细胞(DMEM)和0.01毫克/毫升胰岛素,10%的边后卫,100 UI /毫升青霉素,和100年µ克/毫升链霉素。MCF-10A在乳腺上皮细胞培养生长培养基(MCF-10A介质:1:1杜尔贝科修改鹰的中等(DMEM) - F12培养基,20%马血清,0.5毫克/毫升氢化可的松,10µ20 g / mL胰岛素,ng / mL重组EGF, 100 ng / mL霍乱毒素,和100年1:青霉素、链霉素(表达载体;15070 - 063])。

2.4。免疫印迹分析

全细胞提取物受到凝胶电泳和转移到聚偏二氟乙烯膜。目标蛋白质与山羊反探测妳初级抗体和抗体Cy-labeled驴二级抗体(IRDye 800连续波)。蛋白质乐队被可视化荧光扫描仪(奥德赛CLx红外成像系统,LI-COR)。

2.5。流式细胞术分析

这些细胞被收集并与人类妳PE-conjugated抗体染色(FAB154P、研发系统)30分钟在冰上。PE强度是衡量BD LSRFortessa细胞分析仪(BD生物科学,圣何塞,CA)。鼠标IgG1 PE-conjugated抗体(IC002P、研发系统)被用作isotype-matched控制抗体。

2.6。愈合/划痕试验

mda - mb - 231细胞被播种在6-well板(纽约康宁公司康宁),2.5×105细胞/在2.5毫升RPMI 1640生长介质。细胞被serum-starved 24 h confluency当他们到达约90%。细胞单层挠了无菌移液管提示“伤口。“增长中被移除和细胞层和无血清培养基去除水洗三次分离细胞。RPMI 1640中等(0.5%的边后卫)+ 0.5%二甲亚砜(DMSO)或17-AAG 5µ米被添加到每个预先设计好,这些细胞被孵化。划痕的宽度被缩影照片记录(0)12、24和36 h。受伤区域的百分比衡量和计算通过使用ImageJ version 1.51(美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.7。实时聚合酶链反应

RNA提取各均质肿瘤使用Direct-zol RNA miniPrep工具包(Zymo研究、欧文、CA)和使用反面reverse-transcribed互补脱氧核糖核酸合成装备(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。reverse-transcribed RNA受到实时PCR权力SYBR PCR反应混合液(热费希尔科学)。以下引物被使用:波形蛋白,向前:GACGCCATCAACACCGAGTT,相反:CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT;Twis1转发:TCCATTTTCTCCTTCTCTGGAA、反向:GTCCGCGTCCCACTAGC;Snai1转发:TCTGAGTGGGTCTGGAGGTG、反向:CTCTAGGCCCTGGCTGCTAC;Snai2转发:CAGACCCTGGTTGCTTCAA,相反:CAGACCCTGGTTGCTTCAA。

2.8。动物模型和MicroPET / CT成像

所有动物进行了程序根据机构的指导方针和MD安德森癌症中心机构批准的动物保健和使用委员会。女性裸体小鼠,6到8周大,重量在20到25之间g,买来Taconic生物科学公司(纽约哈德逊)。给小鼠注射mda - mb - 231细胞(5×106100年µL汉克平衡盐溶液)双边的乳腺脂肪垫降低腹壁。

microPET / CT研究肿瘤小鼠静脉注射64年Cu-anti-AXL或64年Cu-IgG ( 老鼠= 3 /组)剂量的7.4兆贝可/鼠标(~ 0.03 nmol抗体在200年µL), 24小时之后,他们与2%异氟烷麻醉,放置在卧姿。15分钟PET / CT扫描进行力量Albira microPET / SPECT / CT扫描仪(力量BioSpin有限公司林地,TX)。系统的分辨率为宠物和90年0.7毫米µ在三轴CT采集。感兴趣的数据分析,卷(看到)在肿瘤被吸引手动为每个扫描记录意味着放射性。每个VOI的放射性计数是转换为kBq /立方厘米(cc),以及由此产生的值除以接种剂量兆贝可和体重公斤获得标准摄入值(SUV)。

用于图像的反应抑制、老鼠被分配到2组( = 3 /组)小鼠肿瘤大小达到平均直径5 - 7毫米。每个鼠标在组1收到每日腹腔内注射的剂量17-AAG 60毫克/公斤/ 200年剂量µL通过26-gauge卷针9天。每个鼠标在组2收到每日腹腔内注射车辆(64% DMSO在PBS, v / v, 200µL) 9天。肿瘤尺寸测量前第一次和最后一次治疗后用游标卡尺(9天)。老鼠注射64年去年17-AAG Cu-anti-AXL静脉注射当天或车辆治疗和成像24 h后已经描述。

2.9。Biodistribution和放射自显影法

所有的老鼠都完成后立即实施安乐死microPET / CT成像。主要器官肿瘤被删除和重。器官和肿瘤组织的放射性计数使用帕卡德眼镜蛇γ计数器。器官或肿瘤的放射性示踪剂被表示为一个百分比的注射剂量每克组织(% ID / g)。自动射线照相术,切除肿瘤组织和cryosectioned 10µm片;片暴露在富士图像板(BAS-SR 2025) 24 h。每个图像板是由一个多功能扫描成像系统(富士胶片FLA5100,生命科学,瓦尔哈拉殿堂,纽约)。

2.10。肿瘤组织的免疫组织化学和免疫印迹分析

Formalin-fixed,石蜡包埋肿瘤被加工成4µ米的部分。免疫组织化学(包含IHC)染色、肿瘤部分deparaffinized和水化。抗原后检索,幻灯片被封锁在PBS 10%驴(hAXL染色)或山羊(波形蛋白和Ki67染色)血清和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。抗体稀释如下:hAXL, 1: 20;波形蛋白,1:100;Ki67 1: 400。幻灯片抗体与生物素化的清洗和孵化驴子和山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 200;向量的实验室,伯林盖姆,CA)和streptavidin-conjugated辣根过氧化物酶(DAKO Carpinteria, CA) 30分钟。幻灯片被暴露于3 3′-diaminobenzidine然后用苏木精复染色。幻灯片是可视化在蔡司Axio观察者Z1显微镜(德国哥廷根)。

免疫印迹分析肿瘤组织的肿瘤在液氮snap-frozen均质在冰。的溶解产物搅拌、离心后收集。

2.11。统计分析

定量数据表示为平均值±标准偏差(SD)。对每组意味着利用学生的比较t以及。P值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。的制备和表征64年Cu-Labeled Anti-hAXL抗体

如图S1(在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/1686525),p-SCN-Bn-DOTA孵化了anti-hAXL或免疫球蛋白共轭队伍螯合剂的抗体。Anti-hAXL标记了64年铜效率大于92%(图S2)。净化后的特定的放射性是1.50±0.24兆贝可/µ克64年Cu-anti-hAXL和2.22±0.29兆贝可/µ克64年Cu-IgG。孵化后20%小鼠血浆在37°C 2天,放射性相关抗体保持在90%或更多(图S3)。

3.2。妳表达在乳腺癌细胞系和细胞结合分析

表达妳是只在两个TNBC细胞系,mda - mb - 231和Hs578T,而不是在其他两个乳腺癌细胞系(MCF-7和T47D)或正常的人类乳腺上皮细胞系(图1(一))。流式细胞仪数据证明了妳的超表达的表面mda - mb - 231和Hs578T细胞(图1 (b))。竞争细胞结合实验表明,竞争冷anti-hAXL抗体的浓度,流离失所的特定绑定的50%64年Cu-anti-hAXL(集成电路50)为0.76 nM(图1 (c))。

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图1
妳乳腺癌细胞系的表达和细胞结合分析。(一)妳总蛋白质含量在乳腺癌细胞被西方墨点法确定。两TNBC细胞系mda - mb - 231和Hs578T妳蛋白表达。(b)流式细胞仪显示高水平的妳表面表达mda - mb - 231和Hs578T人类TNBC细胞。(c)测定表明,竞争细胞绑定64年Cu-anti-hAXL绑定到mda - mb - 231细胞和一个集成电路500.76 nM的价值。
3.3。药物动力学、体内MicroPET / CT自动射线照相术,Biodistribution64年Cu-Anti-hAXL原位mda - mb - 231肿瘤

血液活动时间曲线64年如图S4 Cu-anti-hAXL提出。半衰期的放射性示踪剂分布阶段( )和消除阶段( )估计为2.15±1.29 h和47.8±22.5 h,分别。因此,microPET / CT成像研究进行24小时接受更好的匹配的血液半衰期放射性示踪剂和放射性同位素的半衰期(64年铜、 h = 12.7)。microPET / CT成像对肿瘤小鼠静脉注射后24小时64年Cu-anti-hAXL或64年Cu-IgG控制,肿瘤被划定64年Cu-anti-hAXL但不64年Cu-IgG(图2(一个))。定量VOI分析证实,肿瘤吸收64年Cu-anti-hAXL明显比64年Cu-IgG (SUV: 143.20±8.97和39.34±0.85,P< 0.0001;图2(一个)),这一发现与放射自显影法结果(图是相一致的2 (b))。

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图2
MicroPET / CT成像的mda - mb - 231肿瘤64年Cu-anti-hAXL,放射自显影法,biodistribution。(一)代表microPET / CT图像的mda - mb - 231肿瘤异种移植小鼠静脉注射后24小时64年Cu-anti-hAXL或64年Cu-IgG控制。肿瘤的64年Cu-anti-hAXL,但不是64年Cu-IgG,显然是可视化(左)。白色箭头:肿瘤。MIP:最大强度投影。定量分析宠物肿瘤吸收每个放射性示踪剂( = 3 /组,对吧)。肿瘤的老鼠64年Cu-anti-hAXL放射性示踪剂的吸收明显高于肿瘤的老鼠64年Cu-IgG (SUV: 143.20±8.97和39.34±0.85, < 0.0001)。(b)代表的放射能照像mda - mb - 231肿瘤部分静脉注射后24小时64年Cu-anti-hAXL或64年Cu-IgG。(c)的放射性示踪剂Biodistribution小鼠静脉注射后24小时64年Cu-anti-hAXL或64年Cu-IgG控制( = 3 /组)。吸收64年Cu-anti-hAXL mda - mb - 231肿瘤的三倍64年Cu-IgG(14.48±2.88和5.24±0.76% ID / g,P< 0.001)。插图:tumor-to-muscle和tumor-to-blood吸收比率的比较64年Cu-anti-hAXL和64年Cu-IgG ( < 0.001, < 0.01)。

microPET / CT成像,成像后的老鼠受到biodistribution研究。老鼠立即被杀,他们的器官和肿瘤收集。肿瘤的64年Cu-anti-hAXL高出近三倍64年Cu-IgG(14.48±2.88和5.24±0.76% ID / g,P< 0.001;图2 (c))。也观察到类似的结果tumor-to-muscle和tumor-to-blood比率(图2 (c)插入)。tumor-to-muscle比率分别为8.65±2.7164年Cu-anti-hAXL和2.42±1.2664年Cu-IgG, tumor-to-blood比率分别为1.37±0.39和0.60±0.15,分别。

3.4。17-AAG下调妳mda - mb - 231细胞中表达,减少细胞迁移

长篇妳蛋白质的分子量为104 kDa。两个转译后的修改形式的妳代表产品部分和完整的糖基化(重120 KDa和140 KDa, resp)已确定(http://atlasgeneticsoncology.org)。免疫印迹分析表明17-AAG主要减少的水平140 kda妳在剂量依赖性的方式与在体外完成糖基化(图3(一个))。妳的差别明显对这些观察17-AAG浓度为0.5µ早在4 M和h治疗后(图3(一个))。17-AAG机制诱发妳退化和随后的抑制致癌作用短暂如图S5。

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图3
17-AAG对妳表达的影响和mda - mb - 231细胞的能动性。(一)上面板:蛋白质溶解产物mda - mb - 231细胞治疗17-AAG 8 h表示剂量的免疫印迹妳;NT:未经处理的细胞。β肌动蛋白被用作加载控制。底板:蛋白质溶解产物mda - mb - 231细胞接受1000海里17-AAG和收获在指定的时间点是免疫印迹,再次使用anti-AXL和anti-actin抗体。(b)愈合mda - mb - 231细胞迁移试验处理17-AAG (5µ米),伤口的愈合的细胞迁移,成像在乘以0,12、24和36 h(左)。代表性的图片所示。比例的封闭伤口面积36小时治疗后相比在0 h(右)。结果表示为意味着±SD从三个独立的实验( < 0.0001;学生的t以及)。

在愈合划痕试验用来评价17-AAG对细胞迁移的影响,一位著名的差距持续36小时后在17-AAG-treated细胞,与完全愈合在vehicle-treated细胞(P< 0.0001;图3 (b))。

3.5。通过17-AAG差别妳对这些被MicroPET / CT成像

MicroPET / CT成像注射后24小时64年Cu-anti-hAXL检测到低肿瘤放射性示踪剂摄取小鼠接受17-AAG为9天(每天一次60毫克/公斤/剂量)比在控制老鼠收到车辆( = 3 /组;图4(一))。定量VOI分析表明,小鼠的肿瘤治疗17-AAG SUV低于44%的肿瘤vehicle-treated老鼠(78.32±5.02和140.00±3.73,P< 0.0001;图4(一))。这些数据进一步证实了放射自显影法结果,显示高放射性的整个肿瘤vehicle-treated老鼠却低得多的放射性肿瘤的17-AAG-treated老鼠(图4 (b))。cut-and-count方法定量分析表明,肿瘤吸收64年Cu-anti-hAXL为9.31±3.46% ID / g vehicle-treated控制老鼠和4.74±1.01% 17-AAG-treated老鼠ID / g (P< 0.05;图4 (c))。

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图4
17-AAG对妳的影响在异种移植mda - mb - 231肿瘤评估microPET / CT成像和体外放射自显影法和放射性示踪剂biodistribution老鼠。(一)代表microPET / CT图像的mda - mb - 231肿瘤异种移植小鼠静脉注射后24小时64年Cu-anti-hAXL。一群老鼠收到每日腹腔内注射的剂量17-AAG 200年60毫克/公斤µL DMSO的PBS(128年:72年,v / v)成像(前9天 = 3)。对照组收到每日腹腔内注射的老鼠同样体积的128:72 DMSO / PBS车辆( = 3)成像前9天。肿瘤的64年Cu-anti-hAXL 17-AAG治疗组明显低于vehicle-treated对照组(左)。白色箭头:肿瘤。MIP:最大强度投影。定量VOI分析肿瘤吸收microPET / CT图像(右)。肿瘤的64年Cu-anti-hAXL低44%的17-AAG治疗组比对照组(SUV: 78.32±5.02和140.00±3.73, < 0.0001)。(b)的放射能照像代表mda - mb - 231肿瘤部分从vehicle-treated控制老鼠和17-AAG-treated小鼠静脉注射后24小时64年Cu-anti-hAXL。(c) Biodistribution的放射性示踪剂静脉注射后24小时64年Cu-anti-hAXL vehicle-treated控制老鼠和老鼠17-AAG-treated ( = 3 /组)。放射性示踪剂降低了49%的肿瘤吸收17-AAG治疗组比对照组(4.74±1.01和9.31±3.46% ID / g, = 0.01)。

我们接下来检查肿瘤反应17-AAG。rt - pcr分析表明,从小鼠肿瘤治疗17-AAG EMT的mrna水平显著降低标记,如波形蛋白Twis1, Snai1, Snai2比控制老鼠的肿瘤(图5(一个))。免疫印迹证实了妳的减少和波形蛋白表达在肿瘤小鼠接受17-AAG(图5 (b)按照包含IHC),结果(图5 (c))。17-AAG-treated肿瘤也表现出显著减少Ki67-positive增殖细胞(图6(一)),这是与延迟肿瘤生长一致(2.22±0.34倍体积增加了肿瘤体积测量立即治疗前17-AAG-treated vehicle-treated的老鼠和3.90±0.37,P< 0.01;图6 (b))。

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图5
rt - pcr和免疫印迹分析肿瘤溶解产物和免疫组织化学染色的肿瘤样本。(a) rt - pcr的mda - mb - 231肿瘤溶解产物从17-AAG-treated表明肿瘤小鼠显著降低EMT标记(mrna的表达波形蛋白、Twis1 Snai1, Snai2; < 0.05, < 0.01, < 0.001)。左面板(b):妳的免疫印迹分析和波形蛋白表达在肿瘤溶解产物。右面板:量化的蛋白质印迹妳和波形蛋白表达在肿瘤溶解产物( < 0.001)。(c)包含IHC染色妳和波形蛋白表达的小鼠肿瘤标本处理车辆或17-AAG。代表图像(比例尺:20所示µ米, < 0.001, < 0.0001)。
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图6
17-AAG Ki67染色的抗肿瘤效果。(一)代表包含IHC染色Ki67的小鼠肿瘤标本处理车辆或17-AAG(比例尺:20µ米, = 3, < 0.01)。(b)肿瘤生长延迟。数据表示为意味着褶皱变化9天的治疗后肿瘤体积±标准差相比,肿瘤体积测量立即开始治疗前( = 6, < 0.01)。代表的照片,两组治疗后的肿瘤小鼠左侧面板所示。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现妳表达TNBC mda - mb - 231肿瘤很容易通过使用microPET / CT成像和量化64年Cu-labeled anti-hAXL抗体的差别,对这些妳一半寿命在这些肿瘤抑制剂可以无创评估17-AAG microPET / CT成像。

TNBC的非侵入性成像是具有挑战性的,因为这些肿瘤低表达的可成像的ER和her - 2等生物标志物。虽然TNBCs表达表皮生长因子受体(EGFR) [5),表皮生长因子受体抑制剂显示令人失望的活动对TNBC的诊所(24]。我们发现妳不是在正常的人类乳腺上皮细胞MCF-10A细胞表达,但表达了两个TNBC细胞系的四个乳腺癌细胞系我们检查。综上所述,这些数据暗示,妳是一个有效的治疗目标在TNBC的无创性评估TNBC的妳表达式可以用来预测针对妳耐药性和对治疗的反应。

此前,Nimmagadda et al。25单光子发射断层扫描/ CT使用125年妳标anti-AXL抗体形象表达胰腺和前列腺癌异种移植肿瘤。李等人。26)使用人源化单克隆抗体(h173) anti-AXL用近红外荧光染料标记Cy5.5形象肺癌异种移植。刘等人。27)使用64年与micro-PET Cu-labeled h173形象肺癌,显示高血池活动和肝脏吸收。与β+和β- - - - - -排放和半衰期约13 h,64年铜使PET成像和放射性核素治疗。作为一个结果,64年铜被认为是一个有吸引力的宠物放射性核素对抗体和纳米颗粒标记(28- - - - - -30.]。多克隆抗体反妳和使用p-SCN-Bn-DOTA介绍无线电金属螯合剂,我们实现了高标记效率和良好的稳定性。标签稳定尤为重要,因为的离解64年铜的无线电金属螯合剂将导致累积的自由64年铜离子不属预定目标的组织,这将降低图像质量。由于高温(45°C)和长期培养时间(45分钟)所必需的高64年铜标记效率,我们担心妳绑定特异性是否可以被保留下来。这一事实64年Cu-anti-hAXL绑定到AXL-expressing mda - mb - 231细胞可能有竞争力流离失所冷anti-hAXL IC50值为0.76 nM表示64年Cu-anti-hAXL专门绑定到mda - mb - 231细胞与高亲和力。

体内microPET / CT成像显示,肿瘤的积累64年Cu-anti-hAXL大于肿瘤特异性的积累64年Cu-IgG。一般来说,肿瘤的纳米粒子或抗体可以归因于两个主动和被动定位。靶向起源于特定的抗原抗体相互作用在这种情况下,而被动定位的结果增强渗透性和保留效果。我们包括isotype-matched免疫球蛋白作为排除控制被动定位的效果。定量分析microPET / CT图像和cut-and-count测量显示,肿瘤吸收的64年Cu-anti-hAXL显著高于64年Cu-IgG。这是支持的明显高于tumor-to-blood和tumor-to-muscle比率64年Cu-anti-hAXL比64年Cu-IgG。因为商业anti-hAXL抗体的高成本,我们不包括冷抗体阻断剂microPET / CT成像。然而,微分肿瘤之间的吸收64年Cu-anti-hAXL和isotype-matched免疫球蛋白表明前者具体绑定到AXL-expressing肿瘤细胞在体外和体内。

定量分析表明,吸收64年Cu-anti-hAXL小鼠的肿瘤中对待17-AAG明显低于vehicle-treated老鼠的肿瘤。Downregulation妳的mda - mb - 231肿瘤17-AAG证实了免疫印迹分析和包含IHC。总的来说,这些发现表明妳表达式及其药理衰减可以无创成像microPET / CT使用64年Cu-anti-hAXL成像探针。

妳的潜在应用成像是基于妳作为客户端一半的蛋白质(31日]。一半需要适当的折叠,许多致癌rtk的成熟和稳定。大多数细胞过程涉及大量蛋白质的客户已确定是蛋白质陪伴(32]。一半的抑制17-AAG耗尽ErbB2, EGFR磷酸化AKT,其他致癌蛋白参与肿瘤恶化。17-AAG目前正在测试在诊所(22]。评估早期响应和获得一半寿命药效学洞察抑制,提出了放射性标记的抗体针对ErbB2和表皮生长因子受体和测试作为潜在的可成像的代理人用于询问和量化的程度抑制(33,34]。然而,因为并不是所有的肿瘤表达ErbB2或EGFR和一半抑制也能导致妳polyubiquitination和随后的蛋白酶体降解[31日),非侵入性成像64年Cu-anti-hAXL一半寿命可能是一个有用的替代监测反应抑制不表达ErbB2或表皮生长因子受体的肿瘤。

最后,妳是一个EMT的重要调节器。我们发现治疗17-AAG EMT的差别导致了对这些生物标志物波形蛋白、扭曲、Snai1, Snai2在转录水平和波形蛋白在蛋白水平表明,妳可能作为潜在生物标志物用于成像EMT抑制的药效学。然而,把妳的差别image-derived对这些抑制EMT,更多的肿瘤模型与不同级别的妳表达式及其衰减与不同的治疗方法在未来的研究应该执行。此外,应采取谨慎64年Cu-anti-hAXL异构瘤内分布(图显示4 (b)),这可能会或可能不会反映EMT的转录/蛋白质组反应途径的整个肿瘤包括妳的表情没有检测到的领域64年Cu-anti-hAXL。

本研究的一个限制是使用队伍作为无线电金属螯合剂64年铜。虽然队伍仍然是最广泛使用的螯合剂,稳定的64年Cu-anti-AXL可能进一步增加使用其他无线电金属螯合剂等1,4,7-triazacyclononane-1, 4, 7-triacetic酸(背板)或横桥cyclam衍生品(35]。因为螯合剂,连接器和配体都是宠物追踪器的成像质量的关键,未来工作的重点应该是发展中妳显像剂,将其转化为临床使用的终极目标。其次,我们使用了多克隆抗体在当前工作。进一步改善成像质量应由使用工程单克隆抗体血液半衰期较短(diabody ScFv如单链抗体,抗体片段),或通过使用放射性同位素半衰期更长(例如,89年Zr),图像可以获得较长时间间隔注射后放射性示踪剂主要是清除从正常器官。

5。结论

妳的差别及其对这些基因的表达17-AAG可以通过使用成像和量化64年Cu-labeled hAXL。使用放射性探针非侵入性成像的妳的肿瘤转移和耐药的一个重要目标,可能提供有价值的信息关于剂量优化,剂量间隔,AXL-targeted分子疗法的治疗效果。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Wanqin小王和小君赵了同样的工作。

确认

谢谢凯瑟琳·黑尔编辑作者的手稿和梁董博士帮助分析药代动力学数据。这项工作的部分支持由美国国防部(DOD)乳腺癌研究项目(BCRP)的时代,希望学者奖(w81xwh - 10 - 1 - 0558;林Shiaw-Yih)和约翰·s·邓恩基金会(Chun Li)。研究动物的支持工具和小动物成像设备支持癌症研究中心支持由美国国立卫生研究院(P30CA016672)。

补充材料

补充材料包括评议和抗体使用,药物动力学,和数字放射化学反应计划,放射性标记效率、放射性示踪剂稳定性、血液活动时间曲线,机制的示意图说明17-AAG诱导妳退化。

  1. 补充材料

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