产OXA-232碳青霉烯酶ST437的酶学性质肺炎克雷伯菌在中国

摘要

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（CRKP）在世界范围内流行，已成为全球公共卫生的威胁，其最重要的耐药机制是产生碳青霉烯酶，尤其是碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC），在国际克隆复合物CC11中普遍存在。高危多药耐药CC11在世界范围内广泛存在，并产生KPC和（新德里金属）以前在该克隆复合物中曾报道过NDM产生菌株；此外，与其他克隆复合物相比，CC11菌株的病例面临更严重形式的耐药性和治疗挑战。在本研究中，我们确定了一种产生OXA-232的ST437肺炎克雷伯菌在中国分离，属于CC11。该分离物对β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类，但对磷霉素、替加环素和粘菌素敏感布拉_{oxa - 232}该基因位于6141位点 bp-ColKP3型非结合质粒，并通过化学转化成功转化该质粒，这是首次报道产生OXA-232的ST437k .肺炎在中国，一种高危耐多药CC11的新克隆。

1.导言

随着碳青霉烯酶基因的传播，碳青霉烯耐药菌的出现和传播肺炎克雷伯菌（CRKP）是一个不断升级的全球威胁。最重要的碳青霉烯类耐药机制是产生碳青霉烯酶，包括KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48样。在中国进行的一项全国性调查显示，获得两个碳青霉烯酶基因，布拉_KPC-2和布拉_NDM90%的CRE菌株(分别为58%和32%)产生表型抗性，其中ST11为主要菌株类型k .肺炎，被确认[1.]目前，我国已报道了OXA-48型碳青霉烯酶的局部克隆传播[2.–4.]，但我们缺乏关于这种碳青霉烯酶的流行病学的精确数据。

OXA-48型碳青霉烯酶于2001年首次鉴定[5.]，对碳青霉烯抗性较低。迄今为止，已有11种OXA-48型碳青霉烯酶被描述:OXA-48、OXA-162、OXA-181、OXA-204、OXA-232、OXA-244、OXA-245、OXA-247、OXA-436、OXA-484和OXA-519。OXA-163和OXA-405能水解头孢菌素类化合物，但对碳青霉烯类化合物的活性有限。此外，其他oxa -48变异如OXA-252、OXA-438、OXA-439、OXA-505、OXA-517、OXA-566、OXA-567等仅在GenBank中列出，目前尚不确定这些酶是否具有碳青霉烯酶活性[6.].OXA-232是OXA-48型变体的一部分，2011年从印度转移到法国的三名患者中首次发现，其与OXA-48的五种氨基酸替换不同，位于6141 bp-ColE型非结合质粒[7.]．

克隆复合体11 (CC11)表示与ST11不同的一个管家基因，包括ST11、ST258、ST340、ST437、ST757、ST855等。CC11是一种流行病k .肺炎克隆复合体[1.]和其他克隆复合物相比，CC11菌株的病例面临更严重形式的耐药性和治疗挑战[8.].KPC生产[1.]和NDM生产[9]CC11在中国已有报道，尽管OXA-48产生型ST147和ST383的克隆传播，但在中国没有报道OXA-48产生型CC11克隆[4.]此外，在中国还报道了产生OXA-232的ST15的两次克隆传播[2.,3.]这是OXA-232-ST437的首次报道k .肺炎在中国，一种高危耐多药CC11的新克隆。本研究的目的是确定耐药谱，并鉴定载体质粒和侧翼区域布拉_{oxa - 232}基因。

2.材料和方法

2.1.隔离和识别

k .肺炎NB5306从一名72岁女性患者的血液培养中恢复。该患者在中国宁波第一医院血液科病房住院（第0天），有再生障碍性贫血病史。为了防止医院感染，头孢曲松/舒巴坦（3 g q8 h） 入院后2天给药，然后改为比阿培南（0.3%） g q8 h） 持续10天；患者病情稳定，没有进行侵入性手术。但是，患者在第20天发烧，最高温度高达40℃，白细胞计数为0.60 × 10⁹/五十、 中性粒细胞占20.0%，c反应蛋白（CRP）占37.20% mg/L。在第20天立即检查血培养，并使用亚胺培南（0.5）进行经验性治疗 g q6 h） ，万古霉素（0.5 g q12 h） 和伏立康唑(0.2%) g q12 h） .在治疗期间，患者体温持续升高，病情持续恶化，因此，患者在第22天放弃进一步治疗，返回家中。不幸的是，我们通过电话随访得知患者出院后两天在家中死亡。k .肺炎NB5306从血液培养中回收，并通过VITEK®2自动微生物鉴定系统进行鉴定。

2．2.抗菌药物敏感性试验

mic药敏试验采用琼脂稀释法或微量肉汤稀释法(替加环素和粘菌素)，药敏标准参照CLSI (M100-S28)和EUCAST(8.1版，替加环素和粘菌素)指南。

2.3.基因组测序和生物信息学分析

基因组DNA由QIAamp DNA Mini Kit（德国Qiagen）提取并发送给浙江天科高科技发展有限公司（中国杭州天科），用于文库制备和基因组测序。通过HiSeq仪器（美国加利福尼亚州圣地亚哥Illumina）对基因组进行测序。阅读是从头使用CLC Genomics Workbench（版本9.5.1）组装。使用MLST 2.0通过基因组序列识别多位点序列分型（MLST）(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/).使用ResFinder 3.1鉴定抗药性(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/).两个外膜孔蛋白编码基因的突变ompK35和omp分别使用KX528043.1和JX291114.1作为参考测定K36。

２.４.质粒接合与化学转化

质粒接合布拉_{oxa - 232}在37°C下使用利福平耐药基因进行接合试验大肠杆菌EC600或耐叠氮化钠大肠杆菌J53为受体，亚胺培南（0.12 mg/L）与利福平相关（700 mg/L）或叠氮化钠（300 mg/L）用于选择。

当接合失败时进行化学转化布拉_{oxa - 232}基因被转移到细胞中大肠杆菌DH5α用亚胺培南（0.12）进行化学转化 mg/L）进行选择。NB5306-D（DH5）的MICsα将NB5306）转化为厄他培南、美罗培南和亚胺培南。

2．5．S1 PFGE和南螺栓

基因组DNA用s1 -核酸酶(Takara, Otsu，日本)消化，并在PFGE系统(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)上电泳，14°C，运行条件为6 V/cm，脉冲时间从2.16 s到63.8 s。DNA片段转移到带正电的尼龙膜(Millipore, Billerica, MD, USA)，然后与地高黄素标记的杂交布拉_{oxa - 232}-特异性探针。然后使用NBT/BCIP颜色检测试剂盒（德国曼海姆罗氏）检测片段。

2.6.底漆行走顺序

质粒包含布拉_{oxa - 232}由Axygen质粒miniprep（Axygen Biosciences，USA）获得，第一轮测序来自模板一端的已知序列，初始引物为布拉_{OXA-48 -}F(5“-ATGCGTGTATTAGCCTTATCGGCT-3”)布拉_{OXA-48 -}R（5′-CTAGGGAATAATTTTTCCTGTTTGAG-3′）；然后，根据从先前反应中获得的序列末端，从一个新的引物开始每一轮后续反应。最后，在几轮反应后对质粒全长进行测序。质粒的复制子由质粒查找器2.1鉴定(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/).

3.结果

3.1.药敏试验和MLST结果

NB5306对厄他培南耐药（MIC为8） mg/L），但对亚胺培南敏感（MIC为0.25 美罗培南中间体（MIC为2 此外，NB5306对磷霉素、替加环素和粘菌素敏感，但对其他药物耐药β-内酰胺或β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂（头孢噻肟、头孢曲松和哌拉西林/他唑巴坦）、氨基糖苷类药物（庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星）以及氟喹诺酮类药物（环丙沙星和左氧氟沙星）。NB5306经鉴定为ST437(差距3,infB3，医学博士h 1，pgi1.摄影师E 1，rpoB 1，以及吨B 31），与ST11有一个管家基因差异(差距3,infB3，医学博士h 1，pgi1.摄影师E 1，rpoB 1，以及吨B 1）。

3.2.抗微生物试验结果

抗菌素组由对抗生素产生抗性的基因组成β-lactams (布拉_{oxa - 232},布拉_CTX-M-55,布拉_TEM-1b和布拉_SHV-11)，氨基糖苷类(阿弗(3)活动花絮,阿弗（3〃）-Ib，阿弗(6) idrmtB） ，氟喹诺酮类(oqx一个和oqxB),磷霉素(fosA） ，甲氧苄啶(dfrA14），磺酰胺(南部2） ，菲尼考(弗洛R） 和四环素(春节A） 。

３．３．质粒接合和化学转化的结果

NB5306携带一种野生型病毒ompK35不过是一部小说ompK36变体，环3区域内的高度保守结构域（DVLPEFGGDTYGFDFNFLQSRA NGV）。

在共轭实验中，布拉_{oxa - 232}未成功转移到EC600和J53。NB5306-D（DH5）的MICαNB5306）转化为厄他培南、美罗培南和亚胺培南的化学转化子上升至1 毫克/升，0.12 mg/L和0.5 分别为mg/L，其MIC高于对照组大肠杆菌DH5α(厄他培南0.03 mg/L，美罗培南0.03 mg/L，亚胺培南0.06 mg/L1.).

3.4.S1 PFGE和质粒测序结果

S1-PFGE和Southern杂交显示布拉_{oxa - 232}基因定位于∼6kb质粒（图1.)，及布拉_{oxa - 232}该基因位于6141位点 引物行走测序法检测bp质粒。

质粒不同于质粒(GenBank登录号。KY454616)在上海发现，有一个核苷酸取代[2.]，包含9个开放阅读框(MobA、MobB、MobD、ΔMobC、ΔISEcp1、blaOXA-232、ΔLysR、ΔEreA、RepA)。质粒发现者发现布拉_{oxa - 232}该基因位于ColKP3型质粒上。

4.讨论

经常有报道称，新出现的OXA-232碳青霉烯酶产生菌与前往印度旅行有关。例如，Potron等人报告说，有两种k .肺炎一大肠杆菌2011年从印度转移到法国的三名患者中发现了携带OXA-232的病毒[7.]Findlay等人报告说，在2007年至2014年间报告在英国各地旅行到印度的患者的分离物中发现了OXA-232[10]Jeong等人报告说布拉_{oxa - 232}基因间肠杆菌科在一家韩国医院，这名患者可能在之前在印度住院期间被殖民化[11]但是一些报道的OXA-232菌株与最近出国旅行的历史没有很强的相关性。例如，Mancini等人报道6k .肺炎2017年从5名不同的患者中康复，他们报告最近没有出国旅行[12]Abdul Momin等人报告说，5-OXA-232-1产生k .肺炎从文莱的5名患者身上分离出菌株；所有患者均在当地住院，近期无旅行史[13].在本研究中，患者在当地住院，且无出国旅行史。

以前的报告显示，主要流行于布拉_{oxa - 232}k .肺炎属ST14(法国)[7.]，美国[14,15]，韩国[11]和中东[16)， ST15(中国[2.,3.]捷克共和国[17])，ST16（美国）[14]，意大利[18]，以及英国[10])，ST147（印度）[19]突尼斯[20]，以及英国[10)， ST231(瑞士[12]，英国[10]，波兰[21]，新加坡[22和文莱达鲁萨兰国[13])，及ST395（印度）[19]和英国[10]).此外，ST11（印度）[19])和超规范ST23（印度）[23])OXA-232-产生k .肺炎也偶尔被发现。在本研究中，我们鉴定了一株产OXA-232菌株，属于ST437。ST437属于克隆复合物11（CC11），它与其单基因座变体ST11和ST258一起存在[24]高风险的多重耐药CC11在世界范围内广泛存在，与其他克隆复合物相比，CC11菌株的病例面临更严重的耐药形式和治疗挑战[8.]特别是KPC生产和NDM生产CC11。在CC11中，ST258 CRKP主要分布在北美和欧洲[25]此外，ST11是东亚特别是中国的主要CRKP克隆[1.]．我们感兴趣的是，我们在中国发现了一株产生oxa -232的CC11分离株，这表明oxa -48型碳青霉烯酶在高危CC11中传播，如KPC和NDM。

布拉_{oxa - 232}k .肺炎是在法国发现的[7.]中国[2.]这项研究仍然对粘菌素和替加环素敏感，但NB5306对碳青霉烯类抗生素的耐药谱与第一个菌株RAN不同k .肺炎包庇布拉_{oxa - 232}[7.]使用NB5306，厄他培南的MIC为8 mg/L，亚胺培南为0.25 mg/L，美罗培南为2 mg/L，而RAN对厄他培南、亚胺培南和美罗培南耐药，MIC>32 毫克/升[7.].NB5306-D已获得布拉_{oxa - 232}通过化学转化，厄他培南的MIC为1 mg/L，其中我们推测ompK36变异可能在厄他培南的MIC中起作用[26]．

在涉及OXA-232的研究中，只有Jeong等人报告说布拉_{oxa - 232}基因定位于一个大小为6141 bp的cole型接合质粒上，成功地从k .肺炎H16来大肠杆菌J53由共轭词组成[11].然而，这项调查和其他研究报告说布拉_{oxa - 232}基因定位于大小为6141 bp的colkp3型非偶联质粒上[3.,7.,22]。非结合质粒不能启动接合；但是，它们可以在结合质粒的帮助下转移。同样的6kb质粒含有布拉_{oxa - 232}在欧洲、北美、亚洲和北非也有发现[20].据推测 kb质粒可能在全世界传播。

这项研究提供了一种OXA-232的出现k .肺炎属于CC11。需要进一步的监测和调查，以更好地了解世界上产生OXA-232碳青霉烯酶的CRKP的潜在传播和进化。

数据可用性

肺炎克雷伯菌NB5306的基因组草图和携带blaOXA-232的质粒的完整核苷酸序列已分别存放在GenBank中，登录号为QYCO00000000和MK105834。

道德认同

我们获得了宁波市第一医院伦理委员会的批准函（批准号：2019-R044）。宁波市第一医院临床研究管理委员会批准发布病例详情。

同意

获得患者儿子的书面知情同意书。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

翁兴北、石秋成对这部著作贡献相当。

致谢

该分离株KP1质粒由傅品虎博士获得，该项研究得到浙江国家重点科学研究基金（2015C03046）、中国国家自然科学基金（8183009）、宁波自然科学基金（2019A61038）、宁波公益基金会（2019C500）的资助。

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