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加拿大胃肠病学和肝脏病学杂志》上
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加拿大胃肠病学和肝脏病学杂志》上/2020年/文章

研究文章|开放获取

体积 2020年 |文章的ID 8880888 | https://doi.org/10.1155/2020/8880888

Zhi-Bo张郑史,杨Lan-Fang hong bin高, ”Caveolin-1击倒减少人类肝癌细胞SMMC7721侵袭性通过抑制血管内皮生长因素血管再生”,加拿大胃肠病学和肝脏病学杂志》上, 卷。2020年, 文章的ID8880888, 11 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/8880888

Caveolin-1击倒减少人类肝癌细胞SMMC7721侵袭性通过抑制血管内皮生长因素血管再生

Zhi-Bo张,1 郑史,1 Lan-Fang杨,1 和 hong bin高1

1Hepatopancreatobiliary部手术,第一附属医院、福建医科大学,350004年福州,中国

学术编辑器:Marasco乔凡尼
收到了 2020年4月26日
修改后的 2020年6月3日
接受 08年6月2020年
发表 2020年6月27日

文摘

背景。最近,几项研究已经表明,caveolin-1过度参与细胞凋亡阻力,血管生成,并在肝细胞癌(HCC)侵袭性。然而,caveolin-1-mediated肿瘤进展的机制仍不清楚。Methodogy。慢病毒载体是用来构造caveolin-1小干扰RNA (siRNA)表达细胞。SMMC7721细胞分泌VEGF水平进行评估,酶联免疫吸附试验(ELISA)。SMMC7721细胞增殖、周期、凋亡和侵袭性被MTT检测,流式细胞术,膜联蛋白V-FITC /π,入侵检测,分别。Phospho-eNOS水平在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs) cocultured SMMC7721细胞上清液通过免疫印迹分析。Capillary-like小管形成试验进行分析内皮管状结构形成HUVECs处理上层清液从caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞。SMMC7721植入裸鼠实验观察和增长。血管生成在活的有机体内分析了免疫组织化学血管生成试验。结果。Caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞分泌VEGF水平降低。Caveolin-1 RNAi也造成了抑制SMMC7721细胞增殖和细胞周期的进展,是伴随着细胞凋亡增加。上层清液从caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞抑制细胞周期进展和HUVECs phospho-eNOS水平下降。内皮管状结构形成HUVECs处理上层清液从caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞明显减少。Caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞还显示减少致瘤性和诱导血管生成在活的有机体内。结论。我们的结果显示一个新颖的机制,即caveolin-1积极协调VEGF-induced血管生成调节人类肝癌细胞侵袭性。

1。介绍

Caveolin-1,质膜内陷的一个重要组成部分称为小窝,是参与癌症进展和血管生成。大量研究表明,caveolin-1表达式的作用取决于癌症的细胞类型和阶段的问题。虽然caveolin-1众所周知作为一个肿瘤抑制肺腺癌和肉瘤的病例(1,2),最近的一些研究发现caveolin-1超表达与入侵和血管生成有关。在食管鳞状细胞癌和胰腺导管腺癌,caveolin-1超表达与组织学分级高,一个先进的肿瘤阶段和转移(3,4]。贝利和刘5]表明caveolin-1表达调节epithelial-to-mesenchymal过渡期间;此外,一旦表示,caveolin-1大大增加癌症细胞粘附。此外,Joo et al。6)报道,增加caveolin-1表达和微血管密度(MVD)与转移和肾细胞癌患者的预后不良。这些数据暗示caveolin-1可能通过刺激血管生成调节肿瘤侵袭性。

当参与肿瘤的生长和转移、血管生成被认为是一个病态的事件(7]。多项研究表明,血管内皮生长因子(VEGF)是一种血管生成的关键积极监管机构(8]。以前的研究报道,VEGF (9)与肝细胞癌(HCC)进展和血管生成。然而,研究有关的相关性caveolin-1 VEGF-induced血管生成的主要集中在内皮细胞(10- - - - - -13]。因此,caveolin-1表达之间的联系和相互作用,癌症进展,血管生成在肝癌仍未知。

这些先前发现的功能caveolin-1癌症让我们假设caveolin-1可以诱导肝癌细胞VEGF表达,随后提高肿瘤血管生成,促进肝细胞癌侵袭性。我们先前的研究发现,人类肝癌细胞SMMC7721线caveolin-1较高表达伴随着入侵能力高于其他人类肝癌细胞系(14]。因此,利用RNA干扰(RNAi),我们调查的影响在人类肝癌细胞SMMC7721行caveolin-1在侵袭性和血管生成和评估其作用。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和胎牛血清(的边后卫)从Gibco购买。Lipofectamine 2000和试剂盒购自表达载体。限制性内切酶时代我和EcoR我购买的新英格兰生物学实验室。SYBR®PrimeScript™rt - pcr试剂盒购自豆类。人类VEGF Quantikine酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自R & D系统。发射极耦合逻辑免疫印迹检测试剂购自Amersham生物科学。BD人工基底膜基质和生长因素都可以降低(GFR) BD人工基底膜矩阵从BD购买生物科学。Twenty-four-well Millicells 8μm Transwell室从微孔被购买。膜联蛋白V-FITC /π板买来σ。裸小鼠购自上海Slac实验动物有限公司

慢病毒包装组合(小干扰rna表达载体GenScript pGCSIL-Green荧光蛋白(GFP),菲尔普1.0和2.0菲尔普),增强感染的解决方案(ENi.S)和聚凝胺从GeneChem购买;GeneChem也合成寡核苷酸引物用于这项研究。兔多克隆抗体和鼠标anti-GAPDH anti-caveolin-1和抗vegf单克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术。从NeoMarkers购买鼠标anti-CD34单克隆抗体。兔单克隆anti-eNOS和anti-phospho-eNOS抗体购自细胞信号。重组体人VEGF(处理10 ng / ml) [13)购买的R & D系统。

2.2。细胞培养

人类肝癌细胞SMMC7721线和293 t细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所,上海,中国)与10%的边后卫在DMEM培养补充;细胞用于研究通过少于20倍。控制SMMC7721 (CON,没有感染),负控制SMMC7721(数控,感染了空pGCSIL-GFP向量),和可拆卸的SMMC7721 (KD,感染了质粒编码caveolin-1 siRNA-pGCSIL-GFP)细胞在37°C孵化器孵化有限公司为5%2。

主要培养的人脐静脉内皮细胞获得(通过传代形成细胞的健康的病人如前所述[15与小修改);所有随访制度指导方针。HUVECs是生长在DMEM和20%的边后卫和内皮细胞生长补充补充。

慢病毒载体的建设(LV) caveolin-1小干扰RNA和DNA质粒,我们有以下。

小干扰rna (siRNAs)针对人类caveolin-1基因(加入资源库号:NM_001753)是由上海GeneChem设计有限公司,中国。不同siRNAs被cotransfection筛选与人类caveolin-1 cDNA质粒与Lipofectamine 2000 293 t细胞。小干扰rna序列最优对人类caveolin-1 (5′-CTTCAGACCCGCCAACAAA-3′)被克隆到pGCSIL-GFP质粒编码HIV-derived LV。慢病毒制剂是由上海GeneChem有限公司,中国。由此产生的LV包含人类caveolin-1 siRNA名叫caveolin-1-siRNA-LV及其序列证实了定量实时PCR(存在)和序列分析。SMMC7721细胞被感染了caveolin-1-siRNA-LV慢病毒通过添加慢病毒感染的细胞培养在一个多重性(MOI)大约20;埃尼集团。年代和聚凝胺也添加到增加病毒传染性。控制细胞被感染了负控制(NC)慢病毒感染(CON)。经过5天的感染,可拆卸的效率评估使用中存在和免疫印迹。 The lentiviral DNA plasmid for human caveolin-1 (pGC-FU-caveolin-1) was constructed in our previous study [16]。

2.3。中存在

总RNA收集使用试剂盒;互补脱氧核糖核酸是reverse-transcribed使用SYBR®PrimeScript™rt - pcr设备。Caveolin-1 mRNA表达水平分析了使用中存在执行LightCycler乐器。变性的PCR条件由45周期为5 s在95°C,退火20 s 60°C,和底漆扩展15 s在72°C。人类caveolin-1的引物如下:向前,5′CTGAGCGAGAAGCAAGTG 3′和扭转,5′AGAGAGAATGGCGAAGTAAATG 3′)。对人类β肌动蛋白,引物如下:向前,5′GTGGACATCCGCAAAGAC 3′和扭转,5′AAAGGGTGTAACGCAACTA 3”。所有存在结果表示为褶皱mRNA表达的变化对控制细胞。目标基因表达是规范化的每个示例的看家基因的表达。数据分析使用2−ΔΔCt方法。所有的反应都是一式三份。3目标序列的疗效评估,最好的序列功效被选中,用于后续实验。

2.4。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化细胞增殖试验(MTT)

与KD或数控慢病毒感染后120 h,细胞被孵化与3毫克/毫升MTT 4 h在37°C。麻省理工/甲瓒提取一夜之间通过一个孵化与100年在37°Cμl提取缓冲(20% SDS, 50%甲酰胺(pH值4.7),0.02%醋酸和0.025 mol / l盐酸)。光学密度在570纳米测量使用提取缓冲作为空白。

2.5。膜联蛋白V-Fluorescein异硫氰酸酯(FITC) / Propidium碘(π)细胞凋亡测定

的膜联蛋白V-FITC /π化验caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞根据制造商的说明进行。总共1×106在100年与绑定缓冲和resuspended细胞被洗μl绑定缓冲和膜联蛋白V-FITC(效价从0.1 - -1.0μg),孵化后细胞在室温下10分钟,400年μ包含1 l(绑定缓冲μlπ添加;在一小时内被流式细胞术分析细胞。

2.6。流仪细胞周期分析

流仪分析SMMC7721细胞表达caveolin-1 siRNA和HUVECs cocultured SMMC7721细胞上清液进行FACStarPLUS正欲使用仪器。检测到GFP细胞悬浮在fluorescence-activated细胞排序缓冲区组成的0.5%的牛血清白蛋白磷酸盐(PBS)补充叠氮化钠为0.05%。生活的比例,GFP-positive细胞计算。

2.7。入侵检测

入侵检测进行了使用Millicell室系统与0.25毫克/毫升BD Matrigel-precoated聚碳酸酯膜。而底部钱伯斯满心DMEM补充10%的边后卫化学引诱物,包含血清DMEM室顶部。细胞(5×104每口井)被添加到前室和孵化24小时和48小时37°C公司5%2孵化器。每组三个独立的实验。通过基底膜基质的细胞迁移和坚持膜的底部固定并与结晶紫染色。细胞在十微观领域在100 x放大数和平均。

2.8。分泌VEGF通过ELISA定量

上层清液从caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞准备如前所述[17]。量化人类分泌VEGF水平,elisa进行根据制造商的协议。VEGF水平进行评估,最后单位细胞数量(pg VEGF / 105细胞/ 24 h),因为播种效率差异的实验。

2.9。免疫印迹

cocultured SMMC7721细胞后上层清液24 h或48 h, HUVECs冲洗了PBS和十二烷基硫酸钠溶解- - - - - -聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)蛋白质加载缓冲区包含2-mercaptoethanol 5%。细胞溶解产物与等量的总蛋白被分离在10% SDS-polyacrylamide凝胶12%聚丙烯酰胺凝胶和转移到硝化纤维膜。产生的西方的屁股孵化5%牛血清白蛋白(BSA)为1.5 h,然后孵化一夜之间在4°C兔单克隆抗体针对caveolin-1,以挪士或phospho-eNOS (ser - 1177) (1: 1000)。检测glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)使用一个anti-GAPDH抗体担任内部控制。这些墨迹洗3次,0.05% Tween-20 TBS和孵化peroxidase-conjugated抗体二级抗体(1:5000)在室温下2小时。进一步洗涤后,墨迹使用ECL免疫印迹检测试剂的开发,和免疫反应性的蛋白质可视化在柯达X-Omat电影。核的成交条件培养液效率也使用这种方法分析。

2.10。Capillary-like小管形成试验和免疫细胞化学

capillary-like管状结构的形成是评估Matrigel-coated多井板块如前所述[18]。HUVECs被播种密度1×105肾小球滤过率(GFR) /毫升细胞SMMC7721细胞上清液在BD基底膜基质matrix-coated 24-well盘子和孵化0-24 h的37°C。管状结构的形成是使用一个奥林巴斯BX41显微镜检查。经过24小时的文化,和4%多聚甲醛固定细胞20分钟,阻止5%山羊血清20分钟,然后沾anti-CD34抗体为2 h 37°C。第二个孵化后两步包含IHC检测试剂(pv - 6002) (ZSGB-BIO,北京),反应产物被浸泡可视化解决方案中的幻灯片3,3′diaminobenzidine四氯化含有基质(zli - 9032) (ZSGB-BIO,北京)。最后,幻灯片和迈耶的苏木精复染色。

2.11。SMMC7721裸体小鼠植入和增长

调查SMMC7721细胞的致瘤性感染caveolin-1-siRNA-LV慢病毒,指数增长的细胞被收获。简单,细胞被洗PBS然后暴露于0.25%胰蛋白酶/ 0.02% EDTA很短的一段时间。胰蛋白酶中和了培养基,细胞无血清培养系统清洗一次(SFM)。总共5×106细胞每组在100年被停职µl SFM;的脾脏细胞制剂被接种皮下注射6无胸腺的男性裸体小鼠。接种六周后,所有老鼠都牺牲了。在脾脏和肝脏肿瘤的大小是用卡尺测量。肿瘤体积(毫米3使用公式)估计 ,在哪里l的长度和W是宽度。在肝脏肿瘤的数量也计算在内。肿瘤被切割之前,体重分别固定在10%福尔马林。

2.12。免疫组织化学的血管生成试验

确定不同的血管生成在活的有机体内与改变生产这些细胞生长因子表达的在体外免疫组织化学染色,肿瘤部分进行了分析。肿瘤细胞与抗vegf和anti-CD34抗体染色。MVD值测定通过检查CD34-stained幻灯片。个人微血管数领域的最高五选择微观领域的多血管检查的放大200倍。任何brown-stained微血管内皮细胞附近或集群是分开计算。血管腔的存在是没有必要识别微脉管。大型正弦血管吻合算作一个容器。大型船只厚厚的肌肉墙被排除在外。微脉管数的平均数表示为船舶在选定的地区。

2.13。统计分析

每个实验进行了至少3次;数据显示表示均值±SD适用的地方。统计上显著的差异使用配对组在每个试验测定T测试或一个方差分析事后Dunnett的紧随其后t以及。一个概率值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。人类Caveolin-1信使rna和蛋白质水平显著降低后Caveolin-1 siRNA-LV感染

在感染SMMC7721细胞,LV表达式盒式永久GFP的表达和caveolin-1 siRNA启用。GFP表达和GFP-expressing细胞的百分比流仪测定分析。的转导效率caveolin-1 siRNA-LV和数控慢病毒是大约96%。4 d后感染caveolin-1 siRNA-LV, caveolin-1信使rna和蛋白质含量90%(图撞倒了1(一)(图)和100%1 (b)),分别。

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(b)
图1
信使rna和蛋白质含量表明caveolin-1 siRNA可拆卸的效率。(一)Caveolin-1 mRNA表达中存在探测到。其水平撞倒了大约90%。(b) Caveolin-1蛋白表达检测到免疫印迹。它的水平减少了大约100%。
3.2。Caveolin-1 siRNA-Expressing SMMC7721细胞分泌VEGF水平降低

我们评估通过分析SMMC7721细胞的上清液VEGF分泌的案子,数控,或KD组。在三组中,VEGF水平KD组(1193±50.24 pg / ml)相比显著降低欺诈(1465±26.21 pg / ml)和数控(1466±17.62 pg / ml)组(图2)。


图2
通过ELISA定量的分泌VEGF。VEGF分泌的控制(CON) -控制(NC)和caveolin-1 siRNA-LV (KD)组(1465±26.21)(1466±17.62),和(1193±50.24)pg / ml,分别(KD和欺诈, ;KD和数控, )。

Caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞表现出减少细胞增殖和细胞周期进展与增加细胞凋亡和减少细胞侵袭性有关。

SMMC7721细胞案子,分析了数控或KD组使用MTT测定细胞增殖(图3(一个))和细胞周期状态流仪分析(图3 (b))。数据表明,caveolin-1击倒显著减少细胞增殖和细胞周期进展。

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图3
细胞增殖(a),细胞周期进展(b),和SMMC7721细胞凋亡(c)控制”(体质)、“负控制(数控),和caveolin-1 siRNA-LV (KD)组MTT试验检测,流量仪分析,和膜联蛋白V-FITC /π试验,分别。KD组(a)细胞增殖显著减少在天3和5感染后而反对或数控组 。(b)在第三天,KD细胞的比例在G2 / M和S阶段被欺诈或数控组相比显著降低 。(c)在24 h, KD组的细胞凋亡是反对或数控组相比显著增加 。

的膜联蛋白V-FITC /π试验表明caveolin-1击倒提升SMMC7721细胞凋亡(图3 (c))。

入侵检测进行了阐明SMMC7721细胞侵袭性差别caveolin-1对这些基因的影响。入侵细胞的数量在KD组相比显著降低欺诈或KD组24小时和48 h。然而,侵袭性恢复当KD细胞被补充了重组人类VEGF (KD + VEGF)或感染了pGC-FU-caveolin-1 DNA质粒LV (KD + CAV1)(图4)。结果暗示SMMC7721细胞侵袭性正受caveolin-1表达诱导VEGF表达。

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图4
入侵检测进行SMMC7721细胞控制”(体质)、“负控制(NC)和caveolin-1 siRNA-LV (KD)与BD基底膜基质组使用Millicell室系统。(一)入侵细胞的数量在KD组显著降低24小时和48小时;侵袭性显著恢复后补充与重组人类VEGF (KD + VEGF)或感染pGC-FU-caveolin-1 DNA质粒LV (KD + CAV1)。(b)侵袭性差异组KD和欺诈,数控,KD + VEGF, KD + CAV1组被计数量化细胞迁移到较低的数量水平的十个微观领域的膜在100 x放大和平均的值。数据的均值±SD从三个独立的实验;在每个实验,条件进行复制。在24小时和48 h, KD和欺诈, ;KD和数控, ;KD + VEGF与KD, ;KD + CAV1与KD, ;KD + VEGF与KD + CAV1, )。
3.3。上层清液从Caveolin-1 siRNA-Expressing SMMC7721细胞抑制细胞周期进展和HUVECs Phospho-eNOS水平下降

流仪分析和免疫印迹分析进行确认的影响上层清液从caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞在细胞周期进程和HUVECs phospho-eNOS水平。上层清液治疗从caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞显著减少HUVEC细胞周期进展而反对或KD组(图5(一个))。此外,磷酸化以挪士在HUVECs ser1177显著减少后上层清液治疗从caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞而反对或KD组(图5 (b))。

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图5
细胞周期进程和HUVECs phospho-eNOS水平孵化与上层的控制”(体质)、“负控制(数控),或caveolin-1 siRNA-LV (KD) SMMC7721细胞检测到流仪分析和免疫印迹分析,分别。(a)在第三天,KD细胞的比例在G2 / M和S阶段相比,大大减少了欺诈或数控组 。(b)在12 h和24 h phospho-eNOS (ser1177)水平HUVECs KD组上层清液处理相比,大大减少了欺诈或数控组 。然而,总以挪士表达HUVECs每组没有明显不同 。
3.4。大大减少内皮管状结构形成HUVECs处理上层清液从Caveolin-1 siRNA-Expressing SMMC7721细胞

HUVECs是培养与上层的案子,数控,或者KD SMMC7721细胞评估内皮管状结构的形成。少capillary-like肾小球滤过率(GFR)小管开发了BD人工基底膜矩阵HUVECs KD组上层清液处理相比HUVECs对待反对——或者NC-derived上层清液;这些结果被观察到在6、12和24小时孵化。小管的数量显著增加从KD HUVECs上层清液处理细胞后的重组体人VEGF (KD + VEGF);HUVEC小管形成类似的增加也观察到当HUVECs KD处理细胞,随后被感染了pGC-FU-caveolin-1 DNA质粒LV (KD + CAV1)。MVD分析通过采用免疫检测CD34,表现在24 h,进一步证实了这些结果(图6)。

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图6
上层清液从caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞显著抑制内皮管状结构的形成。(a)亮场的观点被使用一个奥林巴斯BX40荧光显微镜配备了光度CCD相机。注意,而细胞治疗与上层的控制(CON)和消极的控制(数控)SMMC7721细胞6 h, 12 h和24 h少,capillary-like开发的小管细胞处理上层清液从细胞撞倒caveolin-1 (KD)。Capillary-like小管形成是恢复后的重组体人VEGF (KD + VEGF);capillary-like小管形成也获救如果细胞治疗与KD上层清液细胞随后感染pGC-FU-caveolin-1 DNA质粒LV (KD + CAV1)。采用免疫标记的CD34在24小时执行进一步检查capillary-like小管形成。(b) capillary-like小管形成细胞之间的差别对待KD-derived上层清液和细胞治疗与上层的案子,数控,KD + VEGF,或KD + CAV1 SMMC7721细胞是用数量来表示。Capillary-like管状结构被计算进小管的数量在五个微观领域的放大200倍;值从每个被平均。数据代表均值±SD从三个独立的实验; all samples were run in duplicate. At 6 h, 12 h, and 24 h, the results were as follows: KD versus CON, ;KD和数控, ;KD + VEGF与KD, ;KD + CAV1与KD, ;KD + VEGF与KD + CAV1, )。
3.5。Caveolin-1 siRNA-Expressing SMMC7721细胞显示减少致瘤性和诱导血管生成在活的有机体内

从脾脏和肝脏肿瘤解剖六周后注入呈现在图7(一)。6周后,caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞生成脾肿瘤平均质量少,大约是2倍相比,负控制SMMC7721细胞。此外,平均在肝脏转移性肿瘤数量少约5倍于小鼠接受caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞相比,老鼠接受负控制SMMC7721细胞。

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图7
比较SMMC7721细胞致瘤性和诱导血管生成与caveolin-1 siRNA或消极的控制在活的有机体内。(a)最后肿瘤解剖后立即拍摄。相对大小的脾(1、2)反对统治者所示。最大的肿瘤体积caveolin-1 siRNA-LV (KD)和消极的控制(NC)组(347.2±101.7)和(735.6±159.1)毫米3分别 。在肝脏转移性肿瘤的数量(3、4)caveolin-1 siRNA-LV (KD)和消极的控制(NC)组(0.9±0.3)和(3.5±1.9),分别 。(b)免疫组织化学染色的VEGF在肿瘤的部分在400 x放大;VEGF染色深棕色。数控组相比,KD组中VEGF水平明显降低 。(c) CD34免疫组织化学染色的肿瘤部分在400 x放大;CD34染色深棕色。数控组相比,MVD KD组显著降低 。

通过免疫组织化学方法分析肿瘤部分和VEGF染色确定在活的有机体内差异造成的血管生成减少caveolin-1表达式。VEGF水平低caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721细胞相比,负控制SMMC7721细胞在脾脏(图7 (b))。虽然CD34染色显示肿瘤血管发生,越来越薄的血管被发现在caveolin-1 siRNA-expressing SMMC7721肿瘤部分相比,负控制肿瘤在脾脏(图7 (c))。这些数据表明caveolin-1表达与血管生成之间的正相关关系体内。

4所示。讨论

大多数研究表明,caveolin-1促进细胞分化和定向迁移通过协调Src激酶和ρGTPase信号;反过来,这些细胞过程起着重要作用,在许多病理过程,包括血管生成、入侵和转移(19,20.]。的影响caveolin-1超表达在各种类型的侵入性肿瘤细胞也被调查。何鸿燊et al。21]表明caveolin-1 upregulation在肺腺癌细胞介导的丝状伪足的形成,这可能提高侵袭性。最近,杨et al。22)报道,caveolin-1参与人类前列腺癌的恶性进展通过与原癌基因的交互。在人类硬癌的乳腺癌,caveolin-1突变可能激活细胞侵袭性(23]。此外,caveolin-1水平升高在人类癌症细胞系(转移性或耐多药24,25]。Caveolin-1表达式是假设增加癌症的进展促进肿瘤进展(26]。此外,病理生理过程下属caveolin-1的作用已经凸显了临床的角度研究表明间接门脉高压的标志是反过来增加肝癌发生(27和复发28]。特别是,据报道,caveolin-1水平可能是一个好的预示卡培他滨/吉西他滨治疗的疗效有节拍器的有效性的证据卡培他滨在肝细胞癌(29日]。然而,机制caveolin-1-mediated促进肿瘤的侵袭性和血管生成仍不清楚。

慢病毒载体,已知有效建立长期的转基因表达(30.),被用来构造caveolin-1 siRNA-expressing细胞。使用这种方法,我们证实caveolin-1信使rna和蛋白质水平显著撞倒SMMC7721细胞被感染caveolin-1-siRNA-LV。在caveolin-1 siRNA-expressing细胞VEGF分泌明显减少。Caveolin-1 RNAi也造成了抑制SMMC7721细胞增殖和细胞周期的进展,是伴随着细胞凋亡增加。这些与其他研究结果一致表明,分泌caveolin-1促进前列腺癌的细胞增殖(31日)和负调节TRAIL-induced人类肝癌细胞凋亡(HepG2) [32]。入侵检测数据显示,caveolin-1击倒抑制SMMC7721侵袭性在体外。有趣的是,补充与重组体人VEGF恢复SMMC7721细胞侵袭性。这些结果同意以前的报告(33]表明,减少差别caveolin-1对这些小鼠肝癌细胞的淋巴转移。因此,我们的研究结果暗示caveolin-1参与SMMC7721细胞侵袭性通过调节VEGF-induced血管再生。

证实这一假说,我们执行在体外三维化验和基底膜基质增长在活的有机体内致瘤性和血管生成感应化验。建立的人工基底膜系统是一个可靠的模型用于评估血管生成在体外(34,35]。短期文化(≤24 h)人工基底膜不涉及细胞增殖或迁移36,37]。肾小球滤过率(GFR)因此,我们采用人工基底膜试验系统研究的潜在作用SMMC7721 caveolin-1内皮细胞分化。我们的研究结果清楚地表明,caveolin-1 RNAi-induced SMMC7721细胞显著降低内皮毛细管差别VEGF对这些小管形成;此外,内皮毛细管形成获救后补充人类VEGF与重组。这些观察结果的差别表明,对这些caveolin-1可以防止VEGF-induced内皮毛细管小管形成。符合这些在体外结果,我们发现caveolin-1 siRNA明显减少SMMC7721致瘤性,诱导血管生成在活的有机体内。最近,临床研究断言caveolin-1表达式之间的正相关关系,MVD和在肝细胞癌预后不良38- - - - - -41和前列腺癌42癌症患者。这些观察与研究结果相一致,caveolin-1促进SMMC7721细胞侵袭性的监管VEGF-induced血管再生在体外和在活的有机体内。

5。结论

综上所述,我们的数据表明,caveolin-1击倒抑制SMMC7721细胞生长和增殖,促进细胞凋亡,并降低VEGF的分泌。caveolin-1抑制SMMC7721细胞侵袭性的差别,对这些基因通过防止VEGF-induced血管再生在体外和在活的有机体内。我们的结果与假设一致,caveolin-1表达式在HCC进展和血管生成中起着至关重要的作用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了福建省自然科学基金(2013 j01293)和年轻的骨架老师福建医科大学(201311年JGG)的基础。

引用

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