萨力多胺的保护作用2、4、6-Trinitrobenzenesulfonic段实验结肠炎大鼠通过17辅助T细胞的抑制作用

文摘

客观的。观察萨力多胺的影响2、4,6-trinitrobenzenesulfonic酸- (TNBS)诱导实验结肠炎大鼠和探索的可能机制萨力多胺治疗CD。方法。四十SD大鼠随机分为健康对照组和TNBS-induced结肠炎组织,包括一个未经处理的TNBS-induced结肠炎组织、低剂量萨力多胺组和高剂量萨力多胺组,10大鼠。7天之后,疾病活动指数(DAI),结肠宏观损伤指数(CMDI)和组织损伤指数(TDI)进行评估。结肠蛋白和mRNA表达白细胞介素- 6 (il - 6)的水平,IL-17 IL-23,视黄酸受体相关孤儿核受体γt (RORγt)测定使用免疫组织化学、免疫印迹和存在。结果。相对于未经处理的TNBS-induced结肠炎,傣族,CMDI, TDI都减少后萨力多胺的管理。分析测试(免疫组织化学、免疫印迹和存在)表明,il - 6, IL-17, IL-23和RORγt蛋白mRNA表达水平明显降低萨力多胺( 对于所有),这些高剂量萨力多胺组的水平明显低于低剂量萨力多胺组( 对于所有)。结论。萨力多胺有效缓解症状和TNBS肠道炎症损伤诱导的老鼠,这是剂量依赖性的影响。底层机制可以降低il - 6的表达水平,IL-17, IL-23和RORγt在结肠组织,然后后续Th17细胞的分化和功能的抑制,从而进一步减轻肠道炎症反应。

1。介绍

炎症性肠病(IBD)是一组慢性、复发性、和非特异性炎症性疾病,包括两个主要实体:克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。乳糜泻的病因和发病机制并不完全清楚;然而,CD的发病率与多种因素有关,同时基于遗传易感性由于抗原激活体内免疫反应和环境因素,如感染、饮食互动,和肠道免疫系统失衡,导致肠道粘膜损伤和非特异性肠道炎症。

T细胞的激活是一个关键的感应肠道免疫反应和随后的炎症。天真的CD4⁺1 T细胞可以分化成T辅助(Th1)细胞,Th2细胞,Th17细胞,监管(Treg)和T细胞的作用下不同的细胞因子。CD被认为是一种Th1-mediated疾病(1]。近年来,越来越多的研究表明,Th17细胞及其相关细胞因子与CD的发病机制密切相关。对Th17细胞的分化,TGF -β1和il - 6启动因素,视黄酸受体相关孤儿核受体γt (RORγt)是一个关键的转录因子,IL-23主要参与成熟、放大,Th17细胞和功能维护,和IL17是其主要的效应1- - - - - -5]。目前,探索Th17细胞及其相关细胞因子的作用在CD的发病机制是一个热门研究课题。

目前,CD的主要药物是5-amino水杨酸(5-ASA)、糖皮质激素和免疫抑制剂(咪唑硫嘌呤、环孢霉素A),和生物制剂;然而,这些药物有不同的局限性和副作用。乳糜泻患者在活跃阶段,糖皮质激素可以诱导缓解,但是长期使用会导致严重的副作用,如骨质疏松症,糖尿病和高血压。免疫抑制药物,如硫唑嘌呤(AZA)可用于CD的减少和维护缓解,但这需要很长时间药物生效。肿瘤坏死因子-α(TNF -α英夫利昔单抗)拮抗剂,是有效治疗CD;但是,昂贵的成本限制了其应用。

萨力多胺在1950年代末首次开发常用的孕妇。这是远离市场由于广泛在欧洲爆发的先天缺陷,特别是短肢畸形,缩短长骨头的四肢,通常的上臂。直到1997年,萨力多胺被提拔为其在炎症性肠病治疗效果;然而,·维特斯坦et al。6]报道的CD萨力多胺处理,并没有有效的皮质类固醇治疗。萨力多胺是医生用来治疗多种免疫介导的疾病。

临床研究(7)发现,在儿童和青少年耐火CD,与安慰剂相比,萨力多胺导致改善临床治疗8周后缓解和长期缓解在知道后续的维护。另一个临床研究8)报道,萨力多胺降低TNF -α和白介素生产CD患者中慢性活跃。Lazzerini et al。9]表明,长期的数据分析从两个临床试验涉及儿科患者CD或加州大学,52周萨力多胺治疗导致54.3%的患者临床缓解ileocolonic或结肠疾病;这些患者中,75.3%显示粘膜愈合,52.6%也显示组织学愈合。最近的动物研究表明,萨力多胺是有效管理CD-like TNBS-induced结肠炎大鼠由于抑制NF -差别和对这些κB,肿瘤坏死因子-α,il - 1β、il - 12、VEGF、内皮细胞粘附分子,促炎趋化因子和抗炎细胞因子il - 10的upregulation [10- - - - - -12]。然而,报告对萨力多胺对Th17细胞功能的影响缺乏。

在目前的研究中,萨力多胺对肠道炎症的潜在的保护作用是阐明使用2,4,6-trinitrobenzenesulfonic酸- (TNBS)诱导大鼠实验性结肠炎模型。改变Th17 cells-related测量细胞因子和一个相关的转录因子在结肠炎感应探索萨力多胺治疗CD的可能机制。

2。材料和方法

2.1。动物

总共40雄性sd大鼠中(男,20;女,20),重180 - 220克,是购自北京HFK生物科学有限公司有限公司(中国,北京)。老鼠被喂食的SPF环境,22±2°C的温度和60%的湿度,并被允许自由吃喝。动物适应了七天前的实验。本研究经伦理委员会批准的中国医科大学盛京医院(2015号ps160k)。

2.2。试剂

抗体免疫组织化学和免疫印迹获得如下:il - 6, IL-17, IL-23和RORγt (Abcam、剑桥、马、美国),GAPDH (Abcam、剑桥、马、美国),和辣根酶标记山羊anti-rabbit IgG抗体II(美国Proteintech Rosemont, IL)。PrimeScript RT试剂盒和SYBR预混料Taq交货(Tli RNaseH +)中存在购买从豆类(大津,日本)。设计的引物被Sangon生物科技(上海)有限公司,有限公司(上海,中国)。2、4、6-Trinitrobenzenesulfonic酸获得SHYY-BIO(上海,中国),萨力多胺是来自常州制药厂。有限公司(江苏,中国)。

2.3。2、4、6-Trinitrobenzenesulfonic酸- (TNBS)诱导结肠炎模型

以前的方法[TNBS-induced结肠炎是诱导13]。老鼠禁食24小时免费喝,被随机分为健康对照组和TNBS-induced结肠炎组织,包括一个未经处理的TNBS-induced结肠炎组织、低剂量萨力多胺组和高剂量萨力多胺组,10大鼠。TNBS-induced结肠炎组织,老鼠被异氟烷麻醉和对待TNBS(25毫克/公斤,50%乙醇溶液)灌肠。健康对照组的老鼠接受0.9%氯化钠溶液灌肠。从第二天开始,萨力多胺是管理intragastrically每天一次(低剂量组,100毫克/公斤萨力多胺和高剂量组,200毫克/公斤萨力多胺)诱导结肠炎,但是健康对照组的老鼠和未经处理的TNBS-induced结肠炎组收到了400年μL 0.9%的氯化钠溶液由同一过程。所有大鼠自由吃食物和喝水。结肠炎的七天的感应后,老鼠被异氟烷安乐死。结肠组织标本进行评估宏观上被切除和4%多聚甲醛固定,脱水,石蜡包埋组织分析和免疫组织化学。其余组织冻结在−免疫印迹和存在分析80°C。

2.4。评估疾病活动指数(DAI)

在无菌技术,100毫克的粪便收集细菌微生物区系分析。戴分数评估根据先前建立评分系统(14)(表1)。

2.5。评价结肠宏观损伤指数(CMDI)

CMDI是根据表中描述的标准进行评估2(15]。

2.6。评估组织的损伤指数(TDI)

组织被苏木精和伊红染色(他)。TDI评估使用修改后的版本的组织病理学分级系统所描述的麦克弗森和菲佛,如表所示3(16]。

2.7。免疫组织化学

组织deparaffinized,水化,然后煮在0.01 M柠檬酸缓冲。过氧化氢(0.3%)是申请20分钟,和正常山羊血清应用随后15分钟。一夜之间,部分被孵化在4°C内抗体在兔子长大对il - 6 (1: 600), IL-17 (1: 500), IL-23(1: 200),和RORγt (1: 100)。的部分是孵化poly-HRP anti-rabbit免疫球蛋白。PBS是用作负控制。部分和二次孵化与辣根过氧化物酶标记抗体,然后链霉素。五个领域的每个部分从每个老鼠每组中选择图像分析。获得的平均光密度是量化表达的il - 6水平,IL-17, IL-23和RORγt。

2.8。实时定量PCR(存在)

结肠组织的总RNA提取使用试剂盒,和cDNA被PrimeScript reverse-transcribed RT试剂盒。PCR扩增系统是由使用SYBR®总理Taq II交货。两步PCR扩增是由使用lightcycle480 II如下:一个5分钟在95°C,其次是在95°C和15秒30秒60°C, 40周期。GAPDH作为内部参考。引物序列表中列出4。计算的mRNA的表达方法。实验进行了一式三份。

2.9。免疫印迹

结肠组织受到钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到PVDF膜。阻止1% BSA之后,一夜之间,膜被孵化在4°C抗体如下:il - 6 (1: 400), IL-17 (1: 400), IL-23(1: 200),和RORγt (1: 1000)。第二天,膜与辣根孵化酶标记山羊anti-rabbit IgG抗体II(1: 5000)在室温下2小时。发射极耦合逻辑被用于检测和量化了乐队凝胶微(图片J开源软件),使用GAPDH作为加载控制。

2.10。统计分析

统计分析是由单向方差分析使用SPSS v22.0软件(方差分析)。结果表示为平均数±标准差,是统计意义 。

3所示。结果

3.1。戴分数

老鼠在健康对照组一般戴显示最低的分数。相比之下,老鼠接受TNBS戴有显著较高的分数比健康对照组( )。未经处理的TNBS-induced结肠炎集团得分最高,也明显不同的两个萨力多胺治疗组( )。与低剂量萨力多胺组相比,高剂量萨力多胺组(戴得分较低 ),萨力多胺的影响存在剂量依赖的相关性(图1(一))。

3.2。CMDI分数

所有TNBS-induced结肠炎组CMDI得分要明显高于那些在健康对照组( )。与未经处理的TNBS-induced结肠炎集团所有thalidomide-treated组显示CMDI得分较低( )。有统计学差异( )低剂量之间萨力多胺组和高剂量萨力多胺组,后者得分较低,表明存在剂量依赖的相关性萨力多胺(图的效果1 (b))。

3.3。他染色和TDI分数

根据组织病理学染色,结肠组织的健康对照组是在正常范围内;腺体细胞排列,与正常隐窝没有炎症细胞浸润。显微镜检查显示低水平的损伤老鼠萨力多胺处理,而在治疗TNBS-induced结肠炎集团有广泛破坏粘膜,隐窝和透壁的浸润的中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞和上皮细胞(图中的缺陷2)。在每个TNBS-induced结肠炎组织,TDI分数显著高于健康对照组( )。两个thalidomide-treated组,显著降低TDI分数检测与治疗相比TNBS-induced结肠炎集团( 对于所有),高剂量萨力多胺组显示得分低于低剂量萨力多胺组( )(数据1 (c)和2)。

3.4。免疫组织化学

健康对照组,il - 6、IL-17和IL-23腺上皮中表达,肠上皮、固有层的炎症细胞,和黏膜下层棕色颗粒状分布,而RORγt被认为只有在固有层的炎症细胞。il - 6, IL-17 IL-23,免疫组织化学染色发现在细胞质中,而RORγt在细胞核染色观察。与健康对照组相比,il - 6的表达水平,IL-17, IL-23和RORγt TNBS感应后显著增加( 对于所有的人,人物3(一个)- - - - - -3 (d))。未经处理的TNBS-induced结肠炎组il - 6的表达水平最高,IL-17, IL-23和RORγt与thalidomide-treated组( 对于所有的人,人物3(一个)- - - - - -3 (d))。此外,高剂量布朗颗粒分布萨力多胺组显著低于低剂量萨力多胺组( ,数据3(一个)- - - - - -3 (d))。免疫组织化学染色模式观察il - 6、IL-17 IL-23和RORγt是如图4- - - - - -7,分别。

3.5。中存在

il - 6、IL-17 IL-23和RORγt是由存在决定的,和显著差异观察所有这些mRNA的表达水平相比TNBS-induced结肠炎组与健康对照组,而添加萨力多胺表达下调他们的mRNA表达( ,与未经处理的TNBS-induced结肠炎组相比,图8)。与此同时,高剂量的镇静剂导致mRNA表达的il - 6水平明显降低,IL-17, IL-23和RORγ比低剂量t萨力多胺( ,图8)。

3.6。免疫印迹

健康对照组,il - 6、IL-17 IL-23和RORγt表达水平较低;然而,滴注法TNBS显著调节他们的表达式( ,与健康对照组相比),而添加萨力多胺表达下调表达( ,与未经处理的相比TNBS-induced结肠炎集团)。与此同时,高剂量的镇静剂导致表达的il - 6水平明显降低,IL-17, IL-23和RORγ比低剂量t萨力多胺( )(图9)。

4所示。讨论

炎症性肠病是一种慢性免疫介导性肠道条件。加州大学和CD是两个主要类型的炎症性肠病。乳糜泻是一种慢性肉芽肿性炎症,可以涉及任何消化道的一部分,通常回肠末端和邻近结肠。CD的病理学常常表现为透壁的炎症,与多个节段和不对称分布。症状包括腹痛和腹泻,这通常是复杂的肠道肛周的造瘘术或阻塞。乳糜泻的病因和发病机制并不完全清楚;然而,目前,它被认为是基于遗传易感性和环境因素相互作用,饮食,和感染,导致一种不平衡的肠道免疫系统和非特异性胃肠道炎症。

目前,CD的主要药物治疗包括5-ASA、类固醇激素,immune-suppressants(咪唑硫嘌呤,环孢菌素A)和生物制剂;然而,这些药物有不同的局限性和副作用。萨力多胺,作为immune-modulator,已广泛应用于自身免疫性疾病的治疗。近年来,萨力多胺也被用于治疗炎症性肠病。1979年,水等。17]报道了第一例加州大学成功接受萨力多胺和直到1997年,萨力多胺被提拔为其治疗效果在IBD由于·维特斯坦等人的研究。6]。在随后的临床研究,萨力多胺被发现中发挥作用的诱导和维护CD缓解。2013年的一项随机对照试验的结果(相关的)7]萨力多胺的研究治疗儿童难治性CD的显示,第八周thalidomide-treated集团的缓解率是46.4%,而安慰剂组为11.5%,差异具有统计学意义。回顾性多中心2016年的一项研究发现,萨力多胺有12个月的临床缓解率54%,成人耐火CD [18]。2014年,共识指南出版/ ESPGHAN关于儿科的医疗管理CD表明萨力多胺可用于CD患者的治疗反应迟钝或抗TNF -α(19]。

目前,萨力多胺治疗CD的潜在机制理解为主要免疫调节、抗炎、抗血管,肠道粘膜屏障功能的影响。金等。20.)发现,萨力多胺能抑制TNF的表达α和NF -κB,其他研究[21)表明,萨力多胺可以抑制血管生成减少VEGF和人类肠微血管内皮细胞的增殖(HIMEC)。进一步的研究(22)表明,萨力多胺能减少肿瘤坏死因子的水平α、il - 1、il - 6、MPO和没有在老鼠TNBS-induced结肠炎,进而减少炎症反应在CD。

进一步探索萨力多胺治疗IBD的机制,我们建立了一个在大鼠实验性结肠炎模型使用TNBS /乙醇的方法。1984年,TNBS-induced结肠炎动物模型首次成功地由莫里斯et al。13),目前研究最多的细胞免疫模型用于反映病理变化和药物疗效的CD。政府半抗原2,4,6-trinitrobenzenesulfonic酸,在0.25毫升50%的乙醇作为屏障断路器,“结肠溃疡和炎症存在剂量依赖的相关性。的特点和相对长期的炎症和溃疡引起的在这个模型提供一个机会来研究结肠炎性疾病的病理生理学专门控制的方式。这项研究的结果表明,与健康对照组相比,未经处理的TNBS-induced结肠炎组显著低于精神状态,进食、活动程度和重量( ),戴和得分显著增加( )。肠壁的老鼠在未经处理的TNBS-induced结肠炎组显示不同程度的水肿,侵蚀,溃疡,甚至坏死,肠粘连、狭窄。CMDI分数TNBS-induced未经治疗的大鼠结肠炎组显著高于健康对照组( )。显微镜显示结肠,结肠黏膜上皮坏死和脱落的未经处理的TNBS-induced结肠炎组;此外,大量炎症细胞渗透,严重破坏腺体,增加数量的溃疡,和固有层参与被认为,纤维化的肉芽组织出现在少数情况下。此外,TDI TNBS-induced结肠炎组得分显著高于健康对照组(所有 )。这些结果表明我们成功建立了大鼠实验性结肠炎模型。我们使用两种不同剂量的镇静剂TNBS-induced结肠炎大鼠进行干预。结果表明,与未经处理的TNBS-induced结肠炎组大鼠相比,thalidomide-treated组大鼠的一般情况明显改善,减肥是慢,傣族,CMDI, TDI分数显著降低(所有 )。显微镜表明,肠道粘膜被不同程度改善,粘液和粘膜下浸润的炎症细胞减少,腺体的结构进行改进,减少充血和水肿,边际增生的上皮细胞覆盖的溃疡表面,和肉芽组织形成fibroses。高剂量萨力多胺组大鼠的一般情况和病理变化明显松了一口气,而那些低剂量萨力多胺组( ),这表明萨力多胺剂量依赖性在TNBS-induced结肠炎大鼠结肠炎损伤减轻。

近年来,越来越多的证据表明,Th17细胞是炎症性肠病的发病机制密切相关,已成为IBD发病机制的研究焦点。Th17细胞是一个相对较新的CD4的子群⁺T细胞,一旦激活分泌细胞因子,如IL-17A IL-17F, IL-21,和il - 22生成,其中IL-17是主要的效应。IL-17促炎因子与一个强大的能力招募和激活中性粒细胞。此外,它还可以刺激成纤维细胞,巨噬细胞,上皮细胞产生多种促炎介质如il - 1、il - 6、TNF -α、MCP-1和基质金属蛋白酶。一项研究[23Stat-6]表明,(- / -)T-bet(- / -)小鼠,无法生成Th1、Th2细胞il - 6就足以引发强劲Th17细胞的分化;然而,当激活TGF -β孤独,CD4⁺T细胞分化成Foxp3⁺Treg细胞。RORγt是一个关键的转录因子控制Th17细胞分化。IL-23不能诱导T细胞Th17细胞的分化;然而,它可以增加il - 6的表达,il - 1β和肿瘤坏死因子-α通过积极的反馈和参与Th17细胞的扩增和生存。

在过去,CD的发病机制与Th1-mediated免疫反应;然而,近年来,越来越多的研究表明,Th17细胞及其相关细胞因子与CD的发病机制密切相关。江et al。24)报道,Th17细胞及其分泌的细胞因子的表达(IL-17 IL-21, il - 22生成)增加活跃的肠粘膜炎症性肠病病人。小林et al。25)发现CD4⁺细胞和IL-17生产高粘膜固有层的样本IBD的患者进行了手术切除。IL-23R和RORC调节,这表明IL-23可能扮演了一个重要的角色在控制微分Th1 / Th17平衡在加州大学和CD,尽管Th17细胞可能存在于这两种疾病。另一项研究[26]表明,IL-17能与肠道黏膜和黏膜下fibromyocytes的上调表达的il - 1、TNF -α,并通过经典激活MAPK / NF - il - 6κB信号通路引起肠道炎症。IL-17RA(- / -)小鼠已被证明不太容易急性肠道粘膜损伤(27],IL-17(- / -)或应用程序的一个anti-IL-17抗体可以减轻TNBS诱导小鼠实验性结肠炎(28]。炎症性肠病临床研究(29日)显示,治疗组的临床反应和缓解率后的政府anti-IL-6抗体(pf - 04236921)比安慰剂组。IL-23和白介素p40子单元,和一些临床研究(30.- - - - - -32已经证实一个anti-IL-12p40单克隆抗体是有效治疗活跃CD患者。

进一步调查的潜在机制是否萨力多胺治疗CD包括调制Th17细胞,我们的实验检查相关细胞因子的水平和一个相关的转录因子影响分化、扩增,Th17细胞的功能。我们使用免疫组织化学、免疫印迹和存在评估IL-23的蛋白质和信使rna表达水平,IL-17, il - 6在大鼠的结肠组织。统计分析结果表明,蛋白质和IL-23 mRNA表达水平,IL-17, il - 6在未经处理的TNBS-induced结肠炎组明显高于健康控制和thalidomide-treated组( )。IL-23的蛋白质和信使rna表达水平,IL-17,和高剂量萨力多胺组的il - 6在低剂量低于萨力多胺组,显示效果(存在剂量依赖的相关性 )。这些结果表明,蛋白质和IL-23 mRNA表达水平,IL-17, il - 6在TNBS-induced结肠炎大鼠结肠组织增加。萨力多胺显著剂量依赖性降低蛋白质和IL-23 mRNA表达水平,IL-17, il - 6在TNBS-induced结肠炎大鼠结肠组织。免疫组织化学结果表明,与健康对照组相比,显著增加ROR的表情γt TNBS之后滴剂( )。未经处理的TNBS-induced结肠炎组ROR的表达水平显著升高γt与thalidomide-treated组( )。此外,高剂量萨力多胺组棕色颗粒分布有显著低于低剂量萨力多胺组( )。根据免疫印迹和存在的结果,ROR的表达γt蛋白mRNA在未经处理的TNBS-induced结肠炎结肠组织组显著高于健康对照组( )。此外,RORγt蛋白mRNA表达明显降低干预后两种不同剂量的镇静剂(所有 ),与高剂量萨力多胺组显示表达水平低于低剂量萨力多胺组( )。因此,目前的结果表明,萨力多胺剂量依赖性降低Th17细胞的分化通过减少蛋白质和ROR的mRNA表达γt,放缓CD的发展和促进愈合的粘膜炎症。

5。结论

总之,我们的实验结果表明,萨力多胺可以剂量依赖性降低戴,CMDI,和TDI分数TNBS-induced结肠炎的老鼠,表达的差别可能是通过对这些细胞因子il - 6, IL-17, IL-23, ROR和转录因子γt,抑制Th17细胞的分化和力量,减轻肠道的炎性反应。目前的研究只表明萨力多胺影响Th17细胞的分化和功能;然而,其潜在的机制需要进一步研究。有一种Th17和亚群之间的关系;因此,探索亚群的相关机制需要评估萨力多胺的治疗效果,并提供更充分的理论依据萨力多胺治疗CD。

总之,萨力多胺能有效缓解症状和TNBS肠道炎症损伤诱导的老鼠,这是剂量依赖性的影响。的机制可能与降低IL-23的表达,IL-17, il - 6和RORγt在结肠组织,其次是抑制Th17细胞的分化和功能,从而进一步减轻肠道炎症反应。

数据可用性

免疫组织化学、免疫印迹和中存在数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者要求通过电子邮件(tfdoc1088@163.com)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究得到了沈阳科技局(没有。f13 - 220 - 9 - 50)。

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