电针减轻了糖尿病胃病大鼠Caal间质细胞中的抑制

抽象的

背景．糖尿病胃病（DGP）的发病率主要归咎于CAJAL（ICCS）的间质细胞异常。自噬可降解受损的蛋白质和细胞器以保持细胞内稳态，并且可以直接影响细胞的结构和数量。在这项研究中，我们旨在弄清楚DGP与ICC的自噬之间的关系。方法．60只SD大鼠随机分为正常对照组(NC, 10只)和造模组(50只)。造模组大鼠注射2%链脲佐菌素(STZ)，高糖高脂饲料喂养8周，建立DGP大鼠模型。造模成功的大鼠30只，随机分为糖尿病胃轻瘫组(DGP, 10只)、GDP大鼠电针组(EA, 10只)、GDP大鼠胃复安组(MP, 10只)。干预结束后，用ONE TOUCH血糖仪测量血糖，通过测量光密度检测胃肠道推进率。透射电镜下观察自噬体。Western blot检测LC3蛋白和P62蛋白的表达。用GFP-RFP-LC3质粒转染ICCs后，用激光共聚焦显微镜观察自噬通量。结果．(1)干预后，与NC组大鼠血糖比较，DGP、EA、MP组大鼠血糖均显著升高( ）;与DGP组比较，EA组和MP组血糖明显降低( )．（2）与NC组大鼠的胃肠道推进率相比，无论胃排空率或肠道推进率，EA和MP组明显减少（ ）;与NC组比较，EA组胃排空率、肠推进率明显降低( 那 ）;与DGP组相比，EA和MP组显着增加（ )．（3）与NC组相比，DGP组中RFP和GFP的强度明显增加（ 那 ），换句话说，伴随着抑制自噬的DGP组;与DGP组相比，EA组中RFP和GFP的强度显着下降（ 那 )．（4）NC组没有自噬体，在DGP组中存在自噬体。EA和MP组都发现了自噬。（5）当达到LC3 II / LC3 I时，与NC组相比，DGP和EA组中的比例增强了（ 那 ）;与DGP组相比，在MP和EA组中，LC3 II / LC3 I显着降低（ )．（6）作为降解底物，其他三组P62的表达显着增加（ ）与NC组相比;与DGP组相比，EA和MP组中P62的量大大减少了（ )．结论．ICCS中受损的自噬助体是糖尿病胃病的病理学依据，致力于融合自噬体和溶酶体和溶酶体，电针（EA）可以缓解自噬抑制以改善胃动力。

背景

糖尿病胃术（DGP）是持久的持久控制糖尿病的常见并发症，显示出胃排空的延迟，没有任何机械阻塞[1那2］.与胃术相关的症状包括恶心，呕吐，腹胀，早期饱腹感，腹痛和丰满。据报道，76％的糖尿病门诊患者至少有一个胃肠道（GI）症状[3.]女性发病率比男性更高[4.］.卡哈尔间质细胞(ICCs)是慢波的起搏器，通过触发节律性电活动来启动收缩[5.那6.］.ICCS的异常是DGP的一个重要因素，ICC是DGP的治疗目标[7.］.越来越多的发现表明，ICC的结构和定量异常是GI疾病的关键[8.-10.］.自噬是一种高度保守的方法，可降解和回收真核生物中的细胞器和蛋白质[11.，因此它在细胞存活和内稳态中起着重要作用。适当的自噬可以保护营养缺乏的细胞;过度自噬可诱导II型程序性细胞死亡。研究表明，高糖可抑制糖尿病性心脏病的自噬[12.]但没有关于自噬在DGP中的作用的相关报告。

DGP常用的治疗方法是胃复安(metoclopramide, MP)，但长期疗效不够好，易出现口干头晕等耐药现象[13.］.近年来，针灸治疗胃肠道消化不良的治疗吸引了越来越多的学者的关注。临床研究表明，针灸对功能性消化不良有良好影响[14.]术后胃肠功能障碍[15.］.我们的团队已经确认了Zusanli（ST36）的电针（EA），梁门（ST21），三阴胶（SP6）在治疗DGP时都有效。一方面，EA减少了血糖水平，并改善了胃肠动力和致残症状。另一方面，EA改善了ICC的超微结构，调整了ICC的上游调节因子，例如SCC，INS，IGF 1和GHRELIN [16.-19.]，增强了CA的当前²⁺-Activated Cl.^-ICCS的频道[20.］.

基于以上研究，我们假设EA改善ICC的起搏功能与调节自噬有关。因此，本研究建立大鼠DGP模型，通过双荧光mRFP-EGFP-LC3观察ICCs的自噬。本研究旨在探讨自噬在DGP中的作用以及EA治疗DGP的机制。

2.方法

2.1。伦理声明

本研究严格按照国家卫生研究院实验室动物的照顾和使用实验室动物指南的建议进行的，并通过湖南SJA实验动物的动物研究研究伦理委员会批准的所有业务（道德号码）：iacuc-sja18081）。

2.2。动物

Sixty Sprague-Dawley rats weighing 220–240 g, half male and half female, were provided by Hunan SJA Laboratory Animal (certificate number: scxk (Xiang) 2016-0002). The rats were housed at the Experimental Animal Center of Hunan SJA Laboratory Animal, with the temperature at 20–22°C, relative humidity of 65%–70%, and free access to water. Following adaptation for 1 week, all the rats were randomly allocated to the normal control group (NC, 10) and modeling group (50). After modeling, 30 successfully modeled rats were randomly selected and separated into the diabetic gastroparesis group (DGP, 10), GDP rats with the electroacupuncture group (EA, 10), and GDP rats with the metoclopramide group (MP, 10).

2.3。动物模型

造模组大鼠禁食12 h后，快速单次腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ, Sigma, S0130-1G, USA) (55 mg/Kg)。STZ溶于0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(广州化学试剂厂，中国广州)，配制2%溶液(4°C, pH 4.5)。NC组大鼠同时注射枸橼酸钠缓冲液。72小时后，用美国强生公司ONE TOUCH UltraVue血糖仪测量尾静脉血糖。血糖≥16.7 mmol/L并持续2周为成功模型。高糖高脂日粮(常规日粮:猪油硬脂:蔗糖:奶粉:鸡蛋= 58∶15∶20∶5∶2)不规律(奇数天上午，偶数天下午)喂养模型大鼠8周。

尽管有血糖水平，但在模型和对照组大鼠之间，GI推进指标存在显着差异，例如胃排空率和肠道推进率。就比较用STZ注射到正常大鼠的大鼠，被认为是DGP模型成功建立。此外，粪便和皮肤颜色的特征也是重要的参考指标。事实上，43只大鼠符合成型标准。因此，30只大鼠从43只大鼠随机选择并分成DGP组，EA组和MP组。

2.4。治疗方法

NC组和DGP组中的大鼠用弦捆扎并施用0.9％甘蔗。Rats in the MP group were bond for 20 min and intragastrically administered 1.7% of MP (Shanxi Yunpeng Pharmaceutical Co. Ltd, China), 1.0 ml/100 g, once a day, 15 days. Rats in the EA group received intragastric administration of 0.9% normal saline and acupunctured on Zusanli (ST36), Liangmen (ST21), and Sanyinjiao (SP6). Zusanli (ST 36): it is posterolateral to knee joint and about 5 mm away from the capitulum fibulae. Liangmen (ST 21): tummy-button is considered the junction of the upper 3/4 and lower 1/4 of the connection line between the upper edge of the sternum and external genitalia. Liangmen (ST 21) is away from the midpoint of the connection line between xiphisternal synchondrosis and the tummy-button to the midpoint of the medioclavicular line. Sanyinjiao (SP 6): it is vertically 10 mm above medial ankle tip of hind legs. The selection method of acupoint was based on the Experimental Animal Acupoint Map [21.］.采用稀密波(稀密波10 Hz，密波50 Hz)的电刺激仪(SDZ-II，中国苏州医疗器械制造厂)，连续15天进行电刺激。电流设置为2 mA，每次20 min，每天1次。根据下肢的轻微抖动来保证电流。干预15天后，对大鼠进行胃排空、标本采集、分离和原代icc培养。

2.5。胃排空率和肠道推进率

夜间剥夺食物后，给予大鼠灌胃酚红溶液2ml (50 mg/dL，中国天津光复精细化工研究所)。20分钟后，用异氟醚麻醉大鼠(诱导浓度:3%，维持浓度:2%，R510-22, RWD，中国)，行脊柱脱位，开腹，贲门和幽门结扎后小心取出胃。沿大曲率切开胃，将内容物倒入烧杯中，用烧杯中20 ml 0.9%生理盐水冲洗。然后将20ml NaOH溶液(0.5 mol/L)和0.5 ml 20%三氯乙酸倒入烧杯中。离心(3500 r/min, 10 min)后，用分光光度计(UV1800，成都岛津设备有限公司，中国)560nm读取上清液的吸光度。吸光度可反映胃内酚红残留量。将2 mL苯酚红溶液(50 mg/dL)与18 mL蒸馏水、20 mL NaOH (0.5 mol/L)、4 mL 20%三氯乙酸混合，制得标准苯酚红溶液，测定其吸光度。胃排空率按以下公式计算:胃排空率(%)=(1−)X/y)×100%。X表示从胃中收集的苯酚红色的吸光度20分钟，用酚红饲喂胃。y表示标准酚红色溶液的吸光度。同时，腹腔切开术后快速测量肠道推进率。将整个小肠轻轻切割并在冰上伸直，测量小肠的长度和酚醛红色的伸出量。切割小肠并滴下NaOH（0.5mol / L）后，将紫绀的放置变成紫色的距离肠道中的距离。肠道推进率=推进酚红色/总长度的小肠×100％。

2.6。ICCS的隔离和识别

用D-Hanks（4℃）洗涤3洗涤后，快速切割胃窦组织，血管小心分离。用10ml含有1％青霉素 - 链霉素（Gibco，15140-122，USA）的10ml D-Hank的溶液冲洗苯腔标本，脱掉胃粘膜层。将胃窦组织切割成111毫米^3.那和type II collagenase digestive solution (pH 7.0, type II collagenase 1.3 mg/ml, Sigma C7806, USA) was added, digested at 37°C for 30 min, and centrifuged at 1500 r/min for 5 min. And supernatant was discarded, and pellets were resuspended and passed through cell strainer. The cells were inoculated into a six-pore plate with DMEM/F12 (Sigma-Aldrich, USA) and then put into the incubator for culture under the condition of 37°C, 5% CO₂．24小时后，培养基被DMEM / F12培养基取代，没有青霉素和链霉素。之后，每3天改变流体，并在倒置显微镜下观察细胞的生长。为了确定培养的细胞是否是ICC，使用国际公认的C-kit免疫荧光用于培养。将培养基倒出并用0.01mol / L PBS冲洗3次，每次5分钟，并在室温下用4％多聚甲醛溶液固定20分钟。PBS漂洗3次，每次5分钟，5％山羊血清（Sigma，G6767，USA）在室温下密封30分钟。然后加入3ml标记的兔抗大鼠C-kit单克隆抗体（用0.01mol / L pbs稀释，在1：100，eBioscience，CD117，USA）中，置于37℃的环境中30分钟，然后放在4°C冰箱中过夜。第二天，将细胞取出并在37℃下置于37℃，然后用0.01mol / L PBS漂白3次，每次5分钟。观察细胞并在荧光显微镜下拍摄。

2.7。质粒转染和自噬通量

当ICC的P2在六孔板中生长密度达到60%-70%时，用Lipofectamine 2000转染质粒(图2)1），根据转染试剂的说明。在转染6小时后，用培养基替代含有转染化合物的培养基。对数生长阶段的细胞接种在6孔板上，细胞密度为2×10^5./好。完全培养基为dmemf12，含10%胎牛血清(SH30084, Hyclone, USA)和5 ng/ml干细胞因子(SCF, 400-22, USA)。转染24 h后，用激光共聚焦显微镜观察细胞，拍照，保存。每组随机选取5个电场，测量每个通道的荧光强度。

2.8。透射电镜下的自噬

当获得胃窦组织（1mm×1mm×1mm）时，将试样在4℃下迅速将电子显微镜的固定溶液溶液2-4小时。用0.1M磷酸盐缓冲液冲洗样品3次，每次15分钟。它们在室温（20℃）下将它们固定在1％锇-0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4）中2小时。用磷酸盐缓冲液冲洗3次试样，每次15分钟。将组织衍合50％-70％-80％-90％-100％-100％醇-100％丙酮-100％丙酮，每次15分钟。在渗透后切片并在室温下嵌入并干燥过夜。切片组织（60-80nm）后，将组织用铀双染色，铅（分别为乙酸2％乙酸铀饱和醇溶液并分别柠檬酸铅，15分钟）并在室温下干燥过夜。然后在TEM下观察，收集并分析图像。

2.9。Western Blotting.

用PBS洗涤细胞两次，用细胞刮刀刮擦，并以13000×g离心。将含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解物缓冲剂加入到细胞沉淀物中，重新悬浮细胞并使其在冰上裂解10分钟。通过BCA进行蛋白质量化。加入蛋白质电泳缓冲液并在100℃下煮沸10分钟。电动转移到PVDF膜后，将5％的脱脂乳密封1小时。LC3，P62和β加入-Actin抗体并在1：1 000下稀释，并在4℃下孵育过夜。随后用三个TBST洗涤，加入稀释的二抗并在室温下温育30分钟。在TBST洗涤三次后，通过与增强化学发光剂的化学反应可视化带。蛋白质相对表达由靶蛋白表达β-Actin。

2.10。统计分析

所有数据采用SPSS 22.0软件(SPSS, Inc.， Chicago, IL, USA)进行分析。数据以均数±标准差表示。各组间比较采用方差分析(ANOVA)t以及。被视为统计学意义差异。

3.结果

3.1。血糖

建模后（图2）除NC组外，其他三组明显增加血糖（ )．完成干预时，与DGP组中的大鼠相比，EA和MP组中的血糖显着降低（ )．但上述两组与NC组仍有较大差距。

3.2。胃肠道推动率

如图所示3.，DGP组有急剧下降，无论胃排空率还是肠道推进率（ )．它建议已经完成了成功的模型。与DGP组相比，EA和MP组中的胃肠道推进率大大增加。EA组和MP组对胃肠道推进率相当。此外，它似乎电针对胃有更好的影响而不是小肠。

３．３．确定可以

培养2周后，通过免疫荧光鉴定细胞。在荧光显微镜下，显示红色荧光的细胞被认为是C-kit阳性（图4.)．通过免疫表型分析，我们可以确定c -kit阳性细胞是ICCs而不是平滑肌细胞(SMCs)。此外，根据细胞形态，排除了以细胞圆、核小为特征的肥大细胞。

3.4。自噬助焊剂

GFP（绿色荧光）在自噬肌瘤的酸性环境中淬灭，代表未与溶酶体融合的自噬体。RFP（红色荧光）对酸有抗性，并存在于自噬的所有阶段，使自噬作用显示为红色。当绿色和红色荧光同时存在时，它是黄色的。如果黄色荧光显着提高，则有两种可能性。一种可能性是诱发自噬的;另一种是自噬助焊剂受损。如图所示5.和6.，DGP组中的黄色荧光强度增强，而在EA组和MP组中，削弱了。具体情况应与后续结果相结合，以得出结论。

3.5。透射电子显微镜下的自噬

NC组未见自噬小体，线粒体丰富，结构清晰。DGP组出现自噬体。EA组观察到1个自噬体和2个自噬溶酶体。在MP组中观察到内质网(内质网，ER)形成两个吞噬体，延伸和包裹线粒体，标志着自噬的开始(图)7.)．

3.6。LC3和P62的表达

分析Western Blotting（图8.），我们可以清楚地看到DGP组的LC3 II / LC3 I显然高于NC组，EA组高于MP组。同时，我们检测到自噬 - P62底物的相对表达。当抑制自噬通量时，p62的含量增加。DGP组中P62蛋白的表达是最高的，第二是MP和EA组，NC组最少。它提醒我们，ICC中的自噬受到DGP的状况。

4。讨论

在本研究中，我们发现EA可以显着降低血糖水平，并改善DGP大鼠中的胃肠运动，这与先前的研究一致[22.-24.］.更重要的是，我们发现DGP大鼠的自噬助剂有受损，主要关注自噬体和溶酶体的融合障碍。ea可能会减轻自噬磁通量。

所有真核细胞中的自噬广泛存在，溶酶体依赖型降解途径，将细胞内蛋白质和受损的细胞器损坏到溶酶体中以降解。自噬保持正常功能和稳态，可以为细胞本身的生存来创造稳定的环境。自噬助焊剂受损影响细胞的数量和结构。许多研究表明糖尿病心脏病和糖尿病肾病的抑制抑制自噬[12.那25.］.涉及到DGP时，在ICCS中有更多的关注以细胞器变性和松散的间隙结。很少有报道专注于在EA治疗期间在DGP中发挥的自噬作用及其监管机制。为了探讨上述问题，我们采用了RFP-GFP-LC3自噬指示器系统，LC3 II / I和P62的比率与TEM相结合。RFP-GFP-LC3双荧光型指示系统的最大优点是它可以在视觉上判断自噬活动和自噬助焊剂的变化，而无需额外的药物干预。在诱导自噬后，融合表达的荧光蛋白-1C3蛋白在自噬体的膜上锚定，并用自噬核糖组合用溶酶体。其中，GFP蛋白是一种酸敏感蛋白质，溶酶体中的酸性环境可以导致GFP荧光信号猝灭，而RFP是稳定的荧光蛋白，其不会受酸性环境的影响。进入第二阶段后，用溶酶体熔断自动蛋白酶以形成自噬溶解组。由于溶酶体内的酸性环境，pH降低和GFP是淬火。自噬体和自噬粒组织分别用绿色和红色标记。 If autophagy flux runs smoothly, the green fluorescence would degrade in the acidic environment of the autophagolysosome, showing red fluorescence. When the fusion of autophagosomes and lysosomes was suppressed, the autophagy flux was blocked. Therefore, the green fluorescence was not quenched, and the fusion with the red fluorescence formed yellow fluorescence. In this study, the intensity of yellow fluorescence and green fluorescence in the DGP group was significantly enhanced. If the yellow fluorescence was significantly enhanced, there were two possibilities. One possibility was induced autophagy; the other was impaired autophagy flux. Combined with the results of LC3 II/LC3 I and P62, it was obvious to find the latter was the result. In other words, there was inhibited autophagy flux in DGP rats and the autophagosomes failed to fuse with lysosomes. Therefore, abnormalities of ICCs in DGP resulted from suppression of autophagy flux which contributed to the inability to degrade and recycle damaged organelles and proteins. After the intervention of EA and MP, the intensity of green fluorescence was significantly decreased, suggesting the inhibition of autophagy was effectively relieved. It was consistent with the enhanced gastric motility in the EA and MP groups.

透射电镜(TEM)是观察自噬最直接、最经典的方法。透射电镜检测自噬主要基于对自噬体和自噬溶酶体结构的鉴定。自噬体是典型的双层结构，包含未消化的细胞质成分或细胞器(如线粒体和内质网片段)，不与溶酶体融合。当自噬体融合成自噬溶酶体时，它们成为含有细胞质成分的单分子层。TEM观察只能证明自噬的存在，仅通过自噬结构的数量很难反映自噬活性的强弱，具有一定的随机性。因此，有必要结合其他检测方法进行进一步分析。本研究未发现NC大鼠自噬体。DGP组出现自噬体。EA组观察到1个自噬体和2个自噬溶酶体。MP组可见内质网(内质网，ER)形成两个吞噬体，延伸包裹线粒体，标志着自噬的开始。 Membrane structures of two phagophores in the MP group were found from ER. Besides, most of the autophagosome recognizable contents were mitochondria.

LC3涉及自噬复印体膜的形成，包括两种相互转换形式，LC3 I和LC3 II。通过泛素化改性LC3 I，然后与自噬体的膜上结合PE，转变为膜结合LC3 II。LC3 II位于PreautophagoSomes和自噬体中，自噬复印体的象征，随着自噬骨膜膜的增加而增加[26.］.P62，也称为Sqstm1，将LC3和泛素化底物连接，然后将其整合到自噬体中并最终在自噬体中降解。当诱导自噬时，用溶酶体熔化自噬细胞，并且P62被溶酶体酶降解。如果发生自噬体和溶酶体的融合功能障碍，则P62不能通过溶酶体降解，并且P62将累积并且P62的量将增加。在该研究中，通过蛋白质印迹检测LC3 II / LC3 I和P62的比率。根据图8.，DGP组的LC3 II / LC3 I远高于NC组，EA组高于MP组。DGP组中P62蛋白的表达是最高的，第二个是MP和EA组，NC组最少。四组LC3 II / LC3 I的趋势与P62的趋势完全一致。也就是说，DGP大鼠中的LC3 II / LC3 I和P62都显着增加。它表明，ICCS中自噬体和溶酶体的融合被阻断。和EA和MP有效地缓解了自噬助焊剂受损。

该实验的结果与相关研究一致。方别人。发现，通过ERK / AKT / MTOR依赖性途径抑制脂素抑制了足细胞中的自噬，这导致泛细胞凋亡和糖尿病肾病[27.］.Liu等人发现，抑制糖尿病患者足细胞的自噬通过ERK、Akt和mTOR途径促进了糖尿病肾病的进展[28.］.但Aysa Rezabakhsh还发现人类充质干细胞上调II型糖尿病血清的自噬[29.］.与本研究的这种差异可能与以下因素有关。糖尿病大鼠的调节机制比2型糖尿病血清中培养的细胞更复杂，大鼠模型中的高血糖时间（8周）比细胞培养物（7天）长得多。

总之，ICCS中抑制自噬是糖尿病胃病的病理学依据，EA可以缓解自噬疾病以改善胃动力。

数据可用性

在本研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者在合理要求。

利益冲突

关于提交本手稿没有利益冲突。

作者的贡献

YP构思并设计了这项研究。XW、DFZH、XJX、QCH、SYCH进行了实验。XW分析了数据并起草了手稿。YPL对手稿进行了修改和编辑。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金的补助金（No.8177431）。YP获得了赠款并设计了研究。

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