粒细胞集落刺激因子改善肝脂肪变性与改善糖尿病大鼠的自噬

文摘

背景。我们之前报道,粒细胞集落刺激因子(g - csf)改善肝脂肪变性的增强β-oxidation-related基因表达。然而,这个过程的机制尚不清楚。本研究旨在确定改善肝脂肪变性的g - csf与自噬在糖尿病大鼠模型。方法。16 8吃普通食物的同类老鼠,老鼠喂食高脂肪饮食(HFD) 5周。所有HFD-fed老鼠然后注射链脲霉素(STZ)。一周后,HFD老鼠注射STZ被随机处理g - csf (200μ克/公斤/天;糖尿病(DM) / g - csf)或生理盐水(DM /生理盐水)连续5天。4周后,进行了血清生化和组织学分析。autophagy-associated蛋白质的表达是由西方墨点法。mRNA的表达β-oxidation-related基因是由定量实时聚合酶链反应。HepG2细胞培养在高葡萄糖(HG)条件下与g - csf治疗,其次是油红O染色量化的脂质。结果。组织学分析显示脂质积累DM / g - csf组低于DM / saline-treated老鼠。蛋白LC3和beclin-1水平更高,那些p62 DM / g - csf的老鼠都低于DM / saline-treated老鼠。mRNA的表达β-oxidation-related DM / g - csf老鼠的基因是高于DM / saline-treated老鼠。脂质水平的量化和HG HepG2细胞培养中g - csf治疗并没有发现显著差异。结论。我们的数据表明,g - csf潜在改善肝脂肪变性和自噬在糖尿病大鼠的肝脏。

1。介绍

非酒精性肝脂肪变性是一个初期的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和甘油三酯(TG)的积累被定义为没有显著饮酒在肝脏1]。严重的非酒精性脂肪肝会发展和特点是酒精性脂肪肝炎纤维化增加,它可能最终导致肝硬化,当结合其他代谢综合症(2]。非酒精性肝脂肪变性是代谢综合征的一个方面3],通常与肥胖相关胰岛素抵抗、高脂血症和糖尿病(4]。其全球患病率继续增加和不断增长的肥胖流行病影响大约有20 - 40%的成年人在发达国家(5]。

自噬是一种溶酶体降解的过程,可以降低细胞内的细胞器。它可以清除受损细胞组件维持体内平衡的细胞能量6]。先前的证据表明,自噬具有保护功能,使退化的脂质滴,而受损的自噬可能导致肝脂质积累(7]。重要的是,最近的研究表明,激活肝自噬改善非酒精性肝脂肪变性以及酒精肝病(8]。

粒细胞集落刺激因子(g - csf)是一个中性粒细胞发展和形成的监管机构,广泛用于动员骨骨髓来源干细胞在外周血9]。g - csf也提高了各种肝脏疾病,包括急性肝衰竭(10],肝病[11)、肝硬化(12]。以前,我们揭示了治疗和预防g - csf对非酒精性肝脂肪变性的影响(13,14]。虽然我们确定这些影响的g - csf有关lipogenesis-related基因的表达减少和增加的表达β-oxidation-related基因治疗的详细机制g - csf对肝脂肪变性的影响尚不清楚。

在这项研究中,我们探讨g - csf的疗效的机制是否与自噬在糖尿病大鼠模型。此外,为了确定g - csf是直接的影响,我们研究了脂质积累与g - csf HepG2细胞治疗。

2。材料和方法

2.1。动物

本研究按照执行到动物研究指南(15]。汉阳大学机构的动物保健和使用委员会批准了所有的实验。我们使用6男Sprague-Dawley老鼠(Koatech Kyungki-do,韩国)。特定的无菌条件下饲养的老鼠在汉阳大学医学院动物实验中心和居住在笼子里的条件下控制温度(23±2°C)和湿度(55±5%)与一个12小时的人造光和暗周期。

2.2。动物模型和实验设计

实验设计示意图见图1。从7周大的时候,所有的老鼠被随机分为组和被给予自由获取标准的啮齿动物的饮食(正常的控制;n= 8)与5.4%脂肪含量或高脂肪饮食(HFD;n= 16)为6周脂肪含量为60%。喂养5周后,所有的老鼠喂食HFD腹腔内注射是一个低剂量链脲霉素(STZ;30毫克/公斤)稀释在0.1 mol / L柠檬酸缓冲。正常控制老鼠注射柠檬酸等效的缓冲区。一周后,HFD-fed老鼠注射STZ随机选择接受重组人g - csf(糖尿病(DM) / g - csf;200年μ克/公斤/天;Leucostim,东亚制药、首尔、韩国;n= 8)或同等体积的生理盐水(DM /生理盐水;n= 8)腹腔连续5天。每周体重的决心,和血糖水平测量基线,预处理和后处理。老鼠被牺牲在有限公司₂组织学和生化研究麻醉后4周治疗的开始。

2.3。血清生化分析

从尾静脉血样采集禁食8小时后,经离心和血清和存储在−70°C。血清葡萄糖水平,总胆固醇(TC)、TG、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和free-fatty酸(远期运费协议)是衡量使用模型AU400自动分析仪(奥林巴斯GmbH,汉堡,德国)16]。胰岛素抵抗(IR)是定义为一个稳态模型评估胰岛素抵抗(HOMA-IR)胰岛素(μU /毫升)×空腹血糖(更易/ L) / 22.5 (17]。

2.4。组织学分析

检查肝脏形态学、肝脏组织在10%福尔马林溶液固定,嵌入在石蜡,然后切成3μ米厚的部分苏木精和伊红染色())。评价脂质积累,冷冻4μ米厚的部分肝脏组织是沾油红O如前所述[14]。五个字段随机选择的个体。油红O-stained面积进行了分析使用Image-Pro +软件(美国马里兰州银泉的媒体控制论),通过计算的百分比的比值石油红色区域总组织区域的好心人。组织所有数据由一个独立的盲估计研究员。

2.5。实时定量PCR (q-PCR)

总RNA分离的肝组织使用QIAzol试剂(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)后,制造商的指示。RNA (3μg)和逆转录酶reverse-transcribed(英杰公司有限公司,卡尔斯巴德、钙、美国)。信使rna表达水平量化使用光周期计®480系统(罗氏、巴塞尔、瑞士),由于“快速上手”项目DNA主人SYBR绿色我工具包(罗氏)。包括那些感兴趣的基因活化蛋白激酶(AMPK) 1α,AMPK-2α肉碱palmitoyltransferase (CPT) 1,过氧物酶体proliferator-activated受体γ共激活剂,(包括)1α。使用的引物如表所示1。每个样本的交叉点是自动计算的光周期计®程序。q-PCR分析中的所有样本进行重复。每个基因的转录水平测定标准化对glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)。

2.6。西方墨点法

从肝组织获得蛋白质样本和均质冰蛋白裂解缓冲(Pro-prep;基因内区,凭借韩国)蛋白酶抑制剂(爱视宝蛋白酶抑制剂鸡尾酒的解决方案,GenDEPOT,巴克,TX,美国,1:10 0)。40毫克的蛋白质是解决10% sds - page和转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。与5%牛血清白蛋白阻塞后,细胞膜是孵化一夜之间在4°C主要抗体LC3, beclin-1, p62, GAPDH(美国细胞信号技术,波士顿,MA)。GAPDH被用作蛋白质加载控制。蛋白质的乐队是可视化和量化使用一个图像实验室5.0图像分析仪(Bio-Rad)。

2.7。细胞培养和治疗

HepG2细胞从美国获得类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和培养在DMEM(美国纽约生活技术)与正常葡萄糖(5.5毫米)含有10%的边后卫(技术)和1%链霉素/青霉素(生命技术)。细胞培养在37°C在湿润的气氛中低于5%的有限公司₂条件。细胞内脂质积累的细胞模型是由暴露在高葡萄糖(HG;45毫米)36小时。药理研究HepG2细胞与正常葡萄糖(5.5毫米)或孵化HG(45毫米)中补充表示浓度的g - csf(1、10和100 ng / mL)。

2.8。细胞生存能力

HepG2细胞培养过夜,然后孵化增加浓度(1、10、100和1000 ng / mL)的g - csf 36小时。随后,细胞治疗methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium溴化(MTT)解决方案(0.5毫克/毫升)稀释介质和孵化为一个额外的另一个2小时。培养基被和胞内甲瓒产品是溶解在二甲亚砜(DMSO)。吸光度的测定波长595 nm使用iMark™微型板块吸光度读者(Bio-Rad)。MTT检测进行了一式三份。

2.9。量化的脂质油红O染色

准备油红O解决方案,0.35 g油红O (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)每100毫升的100%异丙醇混合产生的异丙醇浓度60%;该解决方案被过滤掉。短暂,PBS的HepG2细胞被洗,紧随其后的是有10%福尔马林固定30分钟。与蒸馏水洗涤后,固定细胞用60%异丙醇洗净,然后不久沾油红O溶液在室温下30分钟。随后,用蒸馏水洗涤后,油红O筛选了与100%异丙醇在室温下15分钟,并量化通过测量吸光度的波长490 nm使用iMark™微型板块吸光度读者(Bio-Rad)。

2.10。统计分析

所有使用SPSS 21.0统计分析进行了Windows(美国、IBM、纽约Armonk)。结果表现为±标准差,除了组织学分析的结果,提出了意味着±标准错误的意思。执行的参数组间比较采用单向方差分析(方差分析),后跟一个事后图基的测试。值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。体重和血清生化分析

老鼠的身体重量每组没有显著不同(图2)。在实验的最后,循环血糖水平显著高于在HFD-fed比老鼠大鼠注射STZ形式之间的正常对照组,但类似的DM / g - csf和DM /生理盐水组(方差分析:F₍₉₎= 15.682, )。HOMA-IR DM / g - csf组显著低于DM /生理盐水组和正常对照组没有差异和DM / g - csf组(方差分析:F₍₉₎= 13.494, )。最后,循环TG水平,AST、ALT,远期运费协议类似的组织。DM / TC水平显著高于生理盐水组比正常对照组(表2)。

3.2。肝脂质积累

肝脂肪变性的发展验证了)和油红O染色。在实验的最后,DM /生理盐水组的肝组织显示严重微和微小脂肪和许多不断膨胀的肝细胞。相比之下,DM / g - csf组的肝组织表现出没有脂肪堆积;这不是不同的老鼠的肝脏组织从正常对照组(图3(一个))。脂滴的积累的油红O染色DM / g - csf组显著低于DM /生理盐水组和明显不同DM / g - csf组和正常对照组(数字3 (b)和3 (c))(方差分析:F₍₈₂₎= 79.387, )。

3.3。自噬相关蛋白的表达

确认改善g - csf对肝脂肪变性的影响是否与自噬相关,我们研究了自噬标记的蛋白表达,包括LC3 beclin-1, p62西方墨点法。LC3的蛋白质水平,由计算LC3转换(LC3-II / LC3-I), DM / g - csf组显著高于在DM /生理盐水组和正常对照组(图4(一))(方差分析:F₍₈₎= 15.552, )。的蛋白质水平beclin-1 DM / g - csf组显著高于在DM /生理盐水组和正常对照组(图4 (b))(方差分析:F₍₇₎= 16.446, )。p62的蛋白质水平显著低于DM / g - csf组比DM /生理盐水组,它没有明显不同于正常对照组(图4 (c))(方差分析:F₍₁₀₎= 16.457, )。

3.4。mrna的表达相关β氧化

调查的表达的改变β-oxidation-related g - csf基因的mRNA水平β-oxidation-related基因,包括AMPK-1α,AMPK-2α、CPT1 PGC-1α,在肝脏被q-PCR检查。AMPK-1的mRNA水平αDM / g - csf组显著高于在DM /生理盐水组和正常对照组(图5(一个))(方差分析:F₍₁₃₎= 8.615, )。AMPK-2的mRNA水平αDM / g - csf组显著高于在DM /生理盐水组和正常对照组;有AMPK-2的mRNA水平之间的显著差异αDM /生理盐水组和正常对照组(图5 (b))(方差分析:F₍₁₄₎= 20.619, )。的mRNA水平CPT1 DM / g - csf组显著高于在DM /生理盐水组和正常对照组(图5 (c))(方差分析:F₍₁₁₎= 17.477, )。PGC-1的mRNA水平αDM / g - csf组显著高于在DM /生理盐水组和正常对照组(图5 (d))(方差分析:F₍₁₁₎= 11.673, )。

3.5。g - csf对HepG2细胞脂质积累的影响

不同浓度的g - csf(1、10、100和1000 ng / mL)被添加到HepG2细胞的培养基。36小时后,细胞生存能力用MTT试验测量。治疗与g - csf含量高达100 ng / mL没有对HepG2细胞细胞毒性的影响。然而,治疗与g - csf 1000 ng / mL的浓度减少细胞生存能力,所观察到的比较治疗组(图6(一))。决定是否直接参与HG-induced脂质积累,g - csf HepG2细胞处理noncytotoxic浓度的g - csf(1、10和100 ng / mL)在36个小时,HG的存在条件和脂质积累量化了油红O染色。细胞内脂质积累明显高于HepG2细胞暴露于汞条件比HepG2细胞暴露于正常葡萄糖条件。然而,cotreatment HG和越来越多的g - csf(1、10和100 ng / mL)没有影响脂质积累的HepG2细胞(图6 (b))。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查了g - csf治疗对肝脂肪变性的影响在老鼠模型中。我们表明,g - csf emeliorated治疗β氧化以及肝组织的肝脂肪变性。此外,g - csf诱导自噬的激活,它提供了一种分子的解释治疗g - csf对肝脂肪变性的影响。我们还证实,g - csf并不影响脂质积累HepG2的肝癌细胞,这表明g - csf对肝脂肪变性可能没有直接的有益影响通过g - csf受体信号。

越来越多的证据表明自噬的贡献在脂类代谢的调节。已经有研究,激活自噬可以减少脂滴的数量导致对非酒精性脂肪肝疗效[18),而有缺陷的自噬可能引发脂类的积累导致非酒精性脂肪肝的发展(19]。在目前的研究中,自噬被激活大鼠肝脏的处理g - csf, beclin-1水平较高的蛋白质和LC3-II / LC3-I (LC3转换)和低水平的表达中p62蛋白质的老鼠接受g - csf。Beclin-1自噬活动是一个主要的指标;它形成与第三类磷脂酰肌醇激酶复杂3-kinase [20.]。LC3的标志是一个代表自噬的激活。它位于特别自噬小体的外膜,形成phagophore和引起溶酶体降解21]。LC3的表达可以报道LC3转换因为LC3-I共轭磷脂酰乙醇胺形成LC3-II,这对自噬体的形成是至关重要的,当自噬是发起22]。P62链接LC3和ubiquitinated基质交付自噬小体,这是有效地降解溶酶体酸性水解酶在正常的自噬活动(23]。因此,有人建议p62与抑制自噬水平,增加和减少p62水平与自噬激活(24]。最近的一项研究表明,自噬激活后治疗与多酚的分数可以防止酒精性肝脂肪变性的upregulation自噬标记,如beclin-1和LC3转换与降低p62水平食堂的饮食喂养的大鼠的肝组织25]。因此,对于我们的研究的结果,g - csf治疗可能会降低脂滴的形成,增强自我吞噬,这可能被认为是一个有益的g - csf治疗对肝脂肪变性的影响。

自噬对脂肪酸的生成通过分解脂滴和自吞噬泡的形成,这是一个自噬体与溶酶体相结合(7,26]。生成的脂肪酸的脂质滴被线粒体自噬β氧化过程,对脂肪酸的处理至关重要27,28]。β氧化的发展有重要作用的脂肪肝和酒精性肝病(29日]。条件的过度流入肝细胞的脂质缺陷β氧化会导致脂肪酸的积累,导致非酒精性脂肪肝(30.]。此外,除非脂肪酸产生激活自噬被迅速,他们也可能损害肝细胞由于其毒性(31日]。因此,并发增加β氧化和自噬活动将非酒精性脂肪肝治疗的理想目标。目前,g - csf的表达增加β氧化基因,如AMPK-1α,AMPK-2α、CPT1 PGC-1α的自噬,伴随着增强大鼠肝脏。还需要进一步的研究来确定是否增加β氧化是依赖G-CSF-induced自噬,这些基因的蛋白表达水平是否类似于相应的mRNA的表达。

非酒精性脂肪肝是一种常见的慢性肝病,是与2型糖尿病(T2DM)病人体内密切相关(32]。非酒精性脂肪肝和2型糖尿病是组件相关的代谢综合征和分享一些临床特征如红外、血脂异常、内脏肥胖(33]。非酒精性脂肪肝患病率估计有大约70%患者2型糖尿病(34]。在我们的研究中,非酒精性脂肪肝大鼠模型被开发使用HFD喂养和低剂量STZ注入。模型模拟人类代谢特点和自然历史的2型糖尿病(35]。我们确定了通过组织学评价肝脂肪变性的肝组织从我们的老鼠模型,表明这些老鼠与2型糖尿病也有非酒精性脂肪肝。此外,我们表明,g - csf治疗降低大鼠肝脂肪变性,显示潜在的g - csf对肝脂肪变性的治疗2型糖尿病。

以往进行的调查显示,一些潜在的机制g - csf对各种肝脏疾病的治疗效果,包括诱导骨骨髓来源的细胞动员和直接影响g - csf受体介导的信号通路(12,36]。我们之前的研究也证实存在g - csf受体在大鼠肝组织14]。然而,g - csf治疗没有对HepG2细胞脂质积累的影响。综上所述,我们的数据支持这个想法,g - csf的治疗效果可能与诱导骨骨髓来源的细胞由g - csf动员而不是直接影响产生的g - csf受体激活在肝脏。

本研究也有一些局限性。首先,我们无法治疗的作用机制研究g - csf对肝脂肪变性,与它对骨骼的影响来源于由g - csf动员。这将需要进一步调查的骨头marrow-dependent g - csf的影响。第二,治疗方案包括剂量、时间和持续时间的g - csf需要建立。最后,我们的研究没有分析其他的表达水平自噬标记或组织学证据与自噬相关。需要额外的研究来更精确地评价自噬的机制。

总之,我们的研究表明,g - csf改善肝脂肪变性和诱导激活的β氧化和自噬在老鼠模型中。我们推测自噬的激活g - csf可与降低肝脂肪变性的upregulationβ-oxidation-related基因。此外,我们发现,g - csf没有减少细胞内脂质积累,这意味着g - csf的治疗效果可能与骨髓动员。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Hyun-Woo Joo和Yi-Sun歌同样这项工作。

确认

作者感谢汉阳大学。

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