文摘

背景。瞬时外向钾电流(我来)和超速的延迟整流钾电流(我科尔)是主要的钾电流参与窦房结细胞的复极化过程(snc)。方法和结果。新生儿的snc老鼠分为控制、缺血/再灌注(I / R), I / R +空白血清,和Tongyang活血配方(TYHX)血清组。我来和我科尔使用全细胞膜片钳技术记录,和电流电压(电流-电压),稳态激活(SSA)稳态失活(SSI)和恢复从失活(RFI)曲线绘制,分别。与对照组相比,峰值电流密度和电流密度的电压我来和我科尔明显降低在snc模拟I / R, SSA曲线向右转动,SSI曲线移动。TYHX后添加到snc的胞外溶液,峰值电流密度和电流密度的电压我来和我科尔显著增加,SSA曲线向左转动,SSI曲线移动的显著差异 。经济复苏的我科尔RFI曲线略恢复,我来曲线并没有改变。结论。TYHX峰值电流密度增加,加速活化,减少的失活我来和我科尔。这可能是TYHX机制在缩短动作电位复极化的持续时间,加速自发的脉动。

1。介绍

窦房结(SAN)是主要的心脏起搏器和源的内部电刺激推动协调心脏的节律性收缩(1]。圣产生有节奏的心脏脉动由于其独特的生理特征自主最高的窦房结细胞(snc)和生成一个自发动作电位(AP),不同于周边心房细胞。snc的活动节奏的细胞反应迟缓可能与小美联社,小休息的潜力,没有平台,只有0,3和4阶段。SNC的第四阶段,也叫舒张去极化,SNC节奏活动,关键是不稳定的复极化后自发的去极化。

动作电位的产生在snc通过结合参与各种跨细胞膜离子电流,包括超极化激活阳离子电流(我f)、钾电流(我K)、钙电流(我Ca),/钙交换电流(我NCX)[1,2]。SNC的复极化过程确保圣的自发兴奋性重复周期。这种固有的内部循环使圣为心脏的节奏。瞬时外向钾电流(我来)和超速的延迟整流钾电流(我科尔)临界电流参与snc的复极化过程(3,4]。都是4-aminopyridine (4-AP)敏感性电流的特点是快速激活和失活5]。离子通道异常SNC和电流会导致严重的窦性心动过缓或逮捕[6,7]。

Tongyang活血配方(TYHX)是一种有效的处方治疗bradyarrhythmias,发展到今天,中医的主人。它由五个传统草药:黄芪,人参,地黄,当归,甘草(8]。黄芪是一种传统的中药用于治疗心血管疾病。它含有类黄酮、皂苷和多糖有抗氧化和消炎作用[9]。人参是一种最广泛使用和使用植物从东到西10]。它有完善的药理性质,包括心脏保护,血管舒张,抗凝和反应力的活动11]。地黄在中国常用的防衰老,防病。当归具有广泛的生物活性,如造血,抗衰老的,抗炎(12]。传统的药用甘草是一个很受欢迎的在欧洲和中国食品工厂,可以加强效果或降低其他成分的毒性(13]。在中医处方,这些药材的合理的兼容性心率在调节过程中发挥作用。然而,很少有人知道如何TYHX参与动作电位复极化阶段。因此,本研究探讨TYHX的影响我来和我科尔snc和闸门动力机制的阐明细胞电生理机制增强节奏的TYHX snc的函数。

2。材料和方法

2.1。道德声明

本研究证实了护理的指导原则和使用实验动物国家委员会颁发的中国科学技术和被批准的机构动物保健和使用委员会,光在医院(IACUC问题没有。iacuc - gamh - 2021 - 006)。

2.2。实验动物

二十雄性Wistar鼠(体重300 - 350克)是由实验动物中心提供的军事医学科学院(牌照号码SCXK(军队)2007 - 004年,北京,中国),和200年纯种新生儿的老鼠(男性或女性)从SiBeiFu购买实验动物科技有限公司有限公司(许可证数量SCXK (E) 2011 - 0004,北京,中国)。

2.3。实验材料和解决方案

Tongyang活血配方,提供了大批制药有限公司有限公司(批号20091210,湖南、中国),被用于制造药物血清。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)从英杰公司购买(美国);的边后卫和胰蛋白酶从GIBCO购买。0.08%胰蛋白酶溶液(0.8 g / L)胰蛋白酶,NaHCO 8氯化钠,0.35330.298,0.991葡萄糖,氯化钾,2羟乙基哌嗪ethanesulfonic酸(玫瑰)。模拟脑缺血的解决方案包含(更易/ L) 98.5氯化钠,10氯化钾,0.9不2阿宝46 NaHCO31.8 CaCl21.2 MgSO420、40乳酸钠和玫瑰(pH值6.8,调整与1%盐酸)。模拟再灌注的解决方案包含(更易/ L) 129.5氯化钠,氯化钾,0.9不2阿宝4,20 NaHCO3、1.8、1.2 MgSO4,55葡萄糖,和20玫瑰(pH值7.4,调整1更易与L氢氧化钠)。内部吸管的解决方案包含130氯化钾(更易/ L), 1 MgCl25.0 Na2ATP 5乙二醇四乙酸(EGTA), 10个玫瑰,和10个葡萄糖(pH值7.2,调整与KOH),和浴缸的解决方案包含140氯化钠(更易/ L), 1 MgCl21、4氯化钾,10个消息灵通的,5葡萄糖与KOH (pH值7.36,调整)。

2.4。分离、纯化和snc的文化

snc是孤立的从五个纯种新生儿老鼠(< 1天)为每一个过程、识别和培养如前所述[14,15]。老鼠在75%乙醇浸泡5 - 10秒,然后固定在一个无菌的长椅上仰卧位。前胸壁与直眼剪刀被割开,暴露心脏。组织块(0.7毫米3)收集的静脉窦在中间部分冠terminalis和根的前腔静脉解剖显微镜下放置在没有胎牛血清的DMEM。有力的移液后,组织块抓住了弯曲眼科镊和洗磷酸盐(PBS)。组织块然后沉浸在PBS,切成乳糜微粒。上层清液是吸气,剁碎组织块用胰蛋白酶消化(0.8 g / L,σ,美国)5分钟37°C水浴下不断的颤抖,用移液器吸取积极为1分钟,沉淀。上层清液的收集和转移到50毫升离心管包含20毫升的DMEM 15%的边后卫。沉淀组织块再次消化,遵循同样的步骤所述,直到他们完全消化。然后样本400 -网状金属筛子过滤。滤液转移到离心管,离心940 r / min17分钟。离心后,上清液被丢弃,细胞被resuspended中等密度的培养皿 细胞/ L。单个细胞悬液接种到六小培养皿,分为对照组、I / R组,空白血清组和TYHX血清组(100μL)。然后,他们为孵化器95% O2和5%的公司2在37°C细胞附着,DMEM定期更改。成纤维细胞是通过微分坚持速度和剩余的细胞纺锤状,将圣细胞。

2.5。建立在snc模拟I / R模型

I / R模型构造根据该方法开发的小山et al。16),我们的前期研究。缺血被剥夺oxygen-glucose (OGD)模拟,模拟了而再灌注恢复供应氧气和糖分。培养基是presaturated取代模拟缺血的解决方案在95% N2+ 5%股份有限公司2然后培养细胞中包含95% N的孵化器2和5%的公司2一小时。之后,模拟与模拟再灌注缺血的解决方案是更换解决方案看看含有10%的边后卫培养了三个小时。然后,圣细胞受到膜片钳实验。所有五个其他组收到上述I / R程序除了正常组。

2.6。Tongyang活血Recipe-Medicated血清的制备

20只成年雄性Wistar鼠分为两组,对照组血清组和TYHX-medicated血清组,每组十只老鼠。Wistar鼠接受胃内的政府连续七天,一天两次,根据等效剂量的老鼠(200克的身体表面积)和成人(在70公斤的身体表面积)[17]。每日剂量体积TYHX提取的成年人是14.5克;这是1.3克/公斤转换提取到一只老鼠的等效剂量。十倍的剂量当量TYHX配方使用剂量的老鼠,所以老鼠收到每日填喂法卷13 g提取/公斤。TYHX提取是悬架与蒸馏水混合,和空白血清组收到同等体积的蒸馏水。腹主动脉血液收集的方法。在2500 r / min离心机血液25分钟获得血清。然后在56灭活血清在水中使用0.22°C 30分钟和消毒μ微孔膜过滤器。无菌空白血清和TYHX药血清在-80°C冰箱冷冻保存应用程序。

2.7。记录在snc钾电流

膜片钳实验中描述(18- - - - - -20.]。全细胞膜片箝技术被用来记录使用Axopatch 700 b钾电流放大器(轴突仪器,美国)pCLAMP 9.2软件(轴突仪器,美国)。硼硅玻璃块吸量管( )将使用一个垂直吸管拉(Narishige pp - 830、日本)。所有的记录都是在室温下进行(35°C)在25分钟,以避免当前的纲要。使用手册全细胞细胞膜电容计算电容控制Axopatch放大器。

的我来和我科尔记录电压钳模式在预定义的协议。记录我来目前,细胞外的解决方案是添加dofetilide (5 nmol / L), CdCl2(100μmol / L),河豚毒素(TTX, 100年μmol / L), 4-aminopyridine (50μmol / L)我基米-雷克南,我卡尔,我Na,我科尔渠道,分别。我来被记录在300毫秒脉冲电压钳模式从一个持有-80 mV的潜力测试潜力-40至+ 50 mV步骤10 mV。记录我科尔目前,细胞外的解决方案是添加dofetilide (5 nmol / L), CdCl2(100μmol / L),河豚毒素(TTX, 100年μmol / L), BaCl2(200μmol / L)我基米-雷克南,我卡尔,我Na,我K1渠道,分别。我科尔被记录在2000毫秒脉冲电压钳模式从一个持有-80 mV的潜力测试潜力-50至+ 50 mV步骤10 mV。每个电压脉冲我来和我科尔之前是去极化的潜力-40 mV 20灭活Na女士吗+电流。了解更多关于闸门机制我来和我科尔稳态激活(SSA)和稳态失活(SSI)曲线生成的玻耳兹曼函数, ,在哪里 是归一化电流, 是膜电位, 在中点电压可用的通道被激活或灭活,然后呢 是曲线的斜率因子。经济复苏的曲线拟合时间进程的数据获得的失活的一个简单的指数函数。

2.8。统计分析

获得的数据处理使用Clampfit 10.4版(轴突工具)和起源version 8.0 (Micocal软件),以及测量数据表示为 。多组比较进行使用单向方差分析(方差分析)和连续使用学生的单变量的数据进行了分析 测试。稳态激活和失活曲线符合玻尔兹曼函数来获取斜率因子( )和中点( )。失活的时间恢复是一个一阶指数函数配合使用。 值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。TYHX对我来及其控制snc的属性
3.1.1。TYHX的峰值电流的影响我来

的峰值电流我来SNC的发现。探索的影响TYHX SNC的钾电流,我们应用空白血清和SNC TYHX-medicated血清。显著减少我来当前可观测到的I / R组峰值密度(图1(一))。后增加100μL空白血清,没有明显的变化我来电流密度的峰值。TYHX-medicated血清应用的峰值密度增加我来目前从 来 ,重大变化(图1 (b))。结果表明,模拟I / R的峰值电流密度降低我来在圣细胞。TYHX可以增加的峰值电流密度我来和反向I / R-induced我来圣细胞的变化。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
TYHX的峰值电流的影响我 来。 , ,和 。
3.1.2。TYHX对电流和电流电压(电流-电压)的曲线我来

图2(一个)显示了我来当前记录后刺激之间的电压-40 mV, + 70 mV (10 mV去极化步骤)持有-80 mV的潜力。的我来值对应于上面的每组电压测量,和电流-电压建立了曲线。结果显示(图2(一个)),电流密度增加的刺激脉冲朝着去极化和特点显露出整改。图2 (b)显示的功能TYHX外电流电压关系的瞬态电流。模拟I / R后,电流密度在snc在每个电压下降,与统计显著性高于+ 20 mV的电压( )与对照组相比。100年的电流密度μL TYHX血清在每个电压增加到不同程度,尤其是电压之间的+ 10 mV和+ 70 mV与统计学意义( )相比I / R组。没有统计学差异空白血清组和I / R组。结果表明,TYHX recipe-medicated血清可能电压依赖性增加的电流密度我来在snc。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
TYHX在电流电压关系的影响我 来。(一)当前的痕迹我 来电流。(b)的电流电压曲线我 来。
3.1.3。TYHX对SSA和SSI曲线的影响我来

我们调查的影响TYHX稳态激活。与对照组相比,SSA曲线的我来通道I / R组去极化的方向移动。除此之外, 值(玻耳兹曼曲线的陡峭)被改变 从 (图3 (b)); ,50%的通道被激活,改变了 从 (图3 (c))( )。SSA曲线的差异不显著, ,和 观察值之间的I / R组和100μL空白血清。后增加100μL TYHX血清,SSA曲线(图3(一个))和 是 相比有统计学意义的I / R组( )(图3 (c));然而,斜率因子( 值) 无差异( )(图3 (b))。结果表明,模拟I / R减速的激活我来在snc。相比之下,TYHX血清可以加速激活的我来电流密度和恢复。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
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图3
TYHX在稳态激活和失活的影响我 来。(一)TYHX在稳态激活的影响我 来。(b) 撒哈南的非洲。 I / R组显著上升,TYHX逆转它。(c) SSA的价值。 三组值也不例外。(d) TYHX在稳态失活的影响我 来。(e) SSI。(f) SSI的价值。 SSI的值显示在三组没有区别。 , ,和 。

在稳态失活档案、SSI的左倾趋势I / R组表明,模拟I / R加速失活。I / R组的陡度SSI曲线变化 来 (图3 (e))( )和half-maximal失活电压( )被改变的 来 (图3 (f))( )。SSI和没有显著差异 变化之间的I / R组和空白血清。TYHX血清产生了显著变化(图3 (d)), 的 ( )(图3 (f))。斜率因子 值之间没有不同I / R,空白血清,TYHX血清组(图3 (e))。我来通道失活导致加速度降低电流密度下的渠道去极化电压相同。结果表明,TYHX血清能减缓的失活我来电流密度和恢复。

3.1.4。TYHX对经济复苏的影响从失活(RFI)的曲线我来通道

恢复从失活是评估标准的双脉冲协议使用一个复苏的潜力-100 mV。数据恢复时间是配备了一个简单的指数函数。而我来增加在TYHX应用程序中,我们观察到所有组之间没有差异复苏从失活(图4)。


图4
失活的TYHX对经济复苏的影响我 来。
3.2。TYHX对我科尔
3.2.1之上。TYHX的峰值电流的影响我科尔

当前的我科尔在SNC被发现。我们决定通过测量峰值峰值电流密度我科尔电流(图所示5)。的峰值电流我科尔在I / R组显著降低,100μL空白血清组和峰值电流增加后增加100μL TYHX血清(图5(一个))。没有发现显著差异在I / R组和100之间μL空白血清组。TYHX血清应用的峰值密度增加我科尔目前从 来 ,有显著变化( )(图5 (b))。上述结果表明,模拟I / R的峰值电流密度降低我科尔在圣细胞。TYHX配方可以提高的峰值电流密度我科尔在圣受损细胞和反向I / R-induced我科尔圣细胞的变化。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
TYHX的峰值电流的影响我 科尔。 和 。
3.2.2。TYHX的影响电流-电压曲线的我科尔

图6显示了我科尔当前记录后刺激之间的电压-40 mV, + 70 mV (10 mV去极化步骤)持有-80 mV的潜力。结果显示(图6),电流密度增加的刺激脉冲朝着去极化和特点显露出整改。模拟I / R后,电流密度在snc在每个电压降低,有显著统计学差异电压+ 10 mV和+ 70 mV ( )与对照组相比。后增加100μL TYHX血清,我们发现所有不同电流密度下每一个电压增加到度,特别是在电压+ 20 mV和+ 70 mV,有统计学意义( )相比I / R组。然而,没有统计学差异空白血清组和I / R组。结果表明,I / R会导致电流密度下降。TYHX血清可能增加的电流密度我科尔在snc压敏电阻器的方式。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
电流-电压曲线的我 科尔。(一)影响我 科尔当前在火车的刺激。(b)的影响电流-电压曲线的我 科尔。
3.2.3。TYHX对SSA和SSI曲线的影响我科尔

拟合曲线产生的稳态激活和失活的玻耳兹曼函数。在I / R组,SSA曲线我科尔通道移动(图7(一))。在细节,斜率因子 值从 来 ( )(图7 (b))和半峰激活电压( )被改变的 来 ( )(图7 (c))与对照组相比,统计差异。后增加100μL TYHX血清,SSA曲线移动, 值更改为 ,和 更改为 ,两者相比有统计学意义的I / R组( )(数据7 (b)和7 (c))。结果表明,模拟I / R减速的激活我科尔降低电流密度。和TYHX血清可以加速我科尔激活和恢复电流密度,从而可能缩短SNC动作电位复极化的时间,最终提高SNC的自律性。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
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(e)
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(f)
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图7
TYHX在稳态激活和失活的影响我 科尔。(一)TYHX在稳态激活的影响我 科尔。(b) 撒哈南的非洲。(c) SSA的价值。(d) TYHX在稳态失活的影响我 科尔。(e) SSI。(f) SSI的价值。 , ,和 。

在稳态失活曲线,SSI曲线移动的I / R组,加速失活我科尔(图7 (d))。对比I / R组和空白血清组没有表现出不同坡度因素 价值和 。添加TYHX之后,SSI曲线向右转动,这就意味着失活我科尔放缓(图7 (d))。斜率因子 值从 来 后增加100μL TYHX血清( )(图7 (e))。数据拟合波尔兹曼方程 的值 和 为I / R组TYHX应用程序之后,分别(图7 (f))。结果表明,模拟I / R加速的失活我科尔,导致了SSI曲线左移。相反,TYHX食谱可以缓慢失活我科尔和恢复复极化电流密度加速。

3.2.4。经济复苏从失活(RFI)的曲线我科尔

康复失活失活和批判性的判断密切相关我科尔通道功能。我们观察到慢复苏失活在I / R组与对照组相比,尤其是在前3000毫秒的时间。TYHX显示的应用更快deinactivation比I / R组和空白组(图8)。


图8
失活的TYHX对经济复苏的影响我 科尔。

4所示。讨论

病窦综合征(SSS)是一种有机疾病圣及其周围组织,从而导致一系列的临床表现节奏和冲动传出干扰造成的。这是一个重要的心血管疾病临床耐火材料,表现为心动过缓和传导阻滞,这会导致对心脏的血液供应不足,大脑、肾等重要器官。SSS的患病率已经被报道在成人45年(1/100021)和1/600的成年人在65岁(22]。心脏骤停造成了严重威胁病人的生命,预计新SSS患者的数量在2060年到172000年止每年增加为在美国(21]。全球SSS代表超过50%的永久起搏器植入(23]。

天然产品已经被全球认可的具有广阔的临床应用前景的优势对多目标,疗效优势,和安全。飞速发展的现代科技,膜片钳等,我们可以评估各种中国抗心律失常的药物或其有效成分。天然化合物广泛应用于中药和被验证作用于离子通道对心律失常(改变离子通道的门控24]。以前,我们阐明的天然产品套可以缩短新生儿兔子的美联社持续时间在圣受损细胞,从而增加HCN4的表达和我f电流密度压敏电阻器的方式(25]。组件TYHX被确定之前的高效液相色谱法(HPLC)研究,和五个重要组件被证实,包括阿魏酸、人参皂苷Rb1,第四套,薯蓣皂苷配基,catalpol [8]。这些组件TYHX有很大的潜在的治疗和预防多种心血管疾病,包括抗氧化、抗凋亡、抗炎作用[26,27]。此外,它可以起到保护作用,有各种各样的细胞(心肌细胞、窦房结细胞和内皮细胞)在压力条件下(28- - - - - -30.]。

血清药理学方法经常用于研究中药体外的影响和机制,因为它消除了干扰的物理和化学特性的原油草药在实验过程和体内环境提供了类似的实验条件。结果表明,空白血清从老鼠没有明显影响我来和我科尔电流密度或激活和失活的过程比I / R组。因此,我们使用血清药理学的方法,在体外实验和观察的影响调节血清的规定我来和我科尔。

snc的离子通道电流的异常会导致SSS (31日),我来和我科尔临界电流参与动作电位复极化snc的32]。的变化我来和我科尔影响动作电位持续时间影响脉动的频率,具有重要意义在snc的规定动作电位。我来在哺乳动物心室和心房细胞已被证明是由K+向外离子的形成,很大程度上有助于美联社在早期复极化阶段(第一阶段)33]。大量的分子调节我来,包括Kv1.4 Kv4.2, Kv4.3频道。一些研究人员认为,美联社的第一阶段在圣无法识别。然而,其他研究显示我来大大促进了兔窦房结细胞的复极化(34),和动作电位持续时间(adp)是长期的,电流强度是在起搏细胞减少我来敏感的拦截器4-aminopyridine (4-AP)阻塞我来(32]。我科尔也会导致快速的动作电位复极化和平衡的内在的去极化电流Na +和l型2 +渠道(35]。块我科尔导致延长39% AP和周期长度增加了27%36]。Kv1.5 (KCNA5)编码的造孔单元我科尔(37),位于或接近细胞桥粒的窦房结组织(36]。的年龄相关性降低Kv1.5被发现在老鼠的窦房结38),这可能部分解释了现象,美联社的持续时间增加而老化(39]。作为瑞士是一种衰老疾病,老年性重构的具体证据正在增加的离子通道在圣40]。

我来和我科尔发挥重要作用在调节自发的心脏节律和心率。本研究的结果表明,TYHX增加了我来和我科尔电流密度在受损的圣细胞压敏电阻器的方式。SSA曲线的我来和我科尔渠道转移到左边,表明TYHX治疗加速通道激活。SSI的曲线我来和我科尔通道转移到正确的,它说明了TYHX放缓的失活我来和我科尔通道。结果估计TYHX的可能性做空的去极化阶段圣细胞的动作电位,提高自律性。

5。结论

我们的研究阐明了TYHX治疗SSS的机理方面的细胞电生理学。结合之前的研究,我们小组系统和强烈的临床疗效和机理研究TYHX治疗瑞士从不同层次,如理论基础、动物实验,整体效果,细胞分子和基因表达。它证明TYHX有多个目标和方式,发挥着至关重要的作用提供科学依据的研究方法和思想与中医对疾病的治疗,可以深化著名中医经验的科学内涵。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

信息披露

延利提供王先生和吴Qiaomin co-first作者。

的利益冲突

我们声明,没有利益冲突有关的出版。

确认

我们感谢老年心血管疾病研究所的技术支持,中国人民解放军总医院。作者感谢中国国家自然科学基金的支持,北京自然科学基金。这项工作得到了国家自然科学基金(81873293号和81904045号)。