文摘

细胞应激反应中发挥着重要作用的病理生理学冠状动脉疾病(CAD)。抑制细胞的压力可能会提供一个小说关于CAD诊断和治疗的临床方法。成纤维细胞占60 - 70%的心肌细胞和心血管功能有至关重要的作用。因此,本研究的目的是显示一个潜在的治疗应用的蛋白质来自heat-stressed CAD患者的成纤维细胞。从包皮成纤维细胞分离,在热应激条件下培养。令人惊讶的是,1.06%的细胞坏死死亡模式展出。此外,heat-stressed成纤维细胞产生更高层次的总比控制细胞的蛋白质。在sds - page分析,观察70 kDa蛋白质乐队强调细胞培养上清液中出现两个酸性斑点与π在二维电泳。评估fibroblast-derived热休克蛋白的免疫原性属性(休克),血清免疫球蛋白g(免疫球蛋白)的ELISA测定50 CAD患者和50名正常受试者已经通过血管造影诊断。有趣的是,anti-HSP抗体水平明显高于在专注个人相比,病人组( )。CAD的比值比为5.06 ( )的截止值30 AU /毫升anti-HSP抗体。此外,ROC分析表明,anti-HSP抗体特异性为74%,敏感性为64%,几乎是等于66%敏感性的运动压力测试(EST)作为CAD诊断方法。这些数据显示,fibroblast-derived休克蛋白适用于CAD通过抗体的诊断和管理生产。

1。介绍

发生冠状动脉疾病(CAD),主要由于动脉粥样硬化是全球死亡的主要原因1]。动脉粥样硬化可以视为双向应力对心肌细胞从外围到心脏,反之亦然。不同类型的内生和外生因素导致动脉粥样硬化的病理生理学CAD (2]。代谢综合征、遗传变异和吸烟是动脉粥样硬化的主要危险因素通过诱导氧化应激(3- - - - - -5]。此外,太阳紫外线辐射等环境刺激被认为是一个可能的不利因素可能激活氧化应激的一代的活性氧(ROS) (6]。氧化应激和活性氧产量高度相关的动脉粥样硬化斑块的形成通过生化修饰的低密度脂蛋白(LDL) (7]。基于证据,随后的慢性炎症反应在动脉粥样硬化的发展起到了关键的作用8- - - - - -10]。此外,包括interleukin-1炎性细胞因子β(il - 1β)、il - 6、il - 12和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)加速动脉粥样硬化进展11]。这主要压力来源于周组织对不同类型的细胞可能产生有害的影响,尤其是心肌细胞。部分或完整的冠状动脉狭窄导致限制血液流动以及减少左心室射血分数(LVEF) [12,13]。血管阻塞可能触发第二个压力级联细胞由于缺氧和营养不足是发生在心脏和外围组织。主要是不同形式的细胞应激,如热休克和营养/血清饥饿引起胞内信号传导网络被认为是一个集成的压力反应(ISR)在真核细胞14]。ISR包括全球减少蛋白质合成以及upregulation特定基因,如热休克蛋白(休克),发挥关键作用在细胞生存在压力条件下(15]。热休克触发免疫激活筛选容易追踪的特定抗体在血液循环16]。内质网(ER)压力是一个主要的ISR诱导物在不同的细胞包括冠状动脉内皮细胞、平滑肌细胞(smc),和巨噬细胞在动脉粥样硬化中发挥关键作用17]。此外,有越来越兴趣调查的成纤维细胞的作用,作为另一个心脏细胞,在动脉粥样硬化。成纤维细胞是无处不在的细胞,几乎存在于所有外围组织和器官特别是皮肤可以感觉到化学和物理压力(18]。此外,心肌细胞和成纤维细胞构成60 - 70%发挥重要作用在心血管系统的健康或疾病19,20.]。同时,成纤维细胞约占33%的小鼠主动脉细胞组织内稳态中发挥关键功能(21]。此外,不同数量的纤维母细胞集群曾被观察到在健康和动脉粥样硬化组织(21]。另一方面,Golpour等人表明,血清饥饿可以显著诱导生产超过90种不同的蛋白质具有促进细胞存活和细胞生长特性,人类皮肤成纤维细胞(22]。此外,血清饥饿可以被认为是一个潜在的免疫调节的工具通过upregulation转化生长因子(TGF -β)和CD4 + CD25 + FOXP3 + CD127-T-regulatory (Treg)细胞23]。这些观察启发一个细微的想法暗示强调细胞热休克和热休克直接向一种适应性反应,可能有一些治疗应用。因此,本文旨在评估纤维母细胞热休克反应可以提供新的见解更好地了解动脉粥样硬化疾病的发病机理和治疗。

2。材料和方法

2.1。主题

134例中积极的临床体征和常规检测的异常结果(包括胸痛、气短、积极的放射性同位素扫描,异常运动压力测试(美国东部时间)和超声心动图)被称为阿亚图拉的导管实验室Rouhani医院,精工大学医学科学,由冠状动脉造影明确诊断(西门子、德国),50 50%以上的冠状动脉粥样硬化狭窄患者在至少一个冠状动脉(31岁男性,19岁女性, : 年)被选为病人组。同时,五十个人没有在冠状动脉斑块被认为是健康对照组(21岁男性,29岁女性, : 年)。三十四个受试者被排除在研究基于图中描述的标准1。然后,全血收集病人和对照组;血清分离和储存在-20°C进行进一步分析。高血压者( mmg)指的是由他们的医疗记录。从每个参与者获得书面同意,证实了研究建议大学医学科学研究伦理委员会的精工(MUBABOL.REC.1394.89)。

2.2。纤维母细胞文化、热休克和决心的分泌蛋白浓度

从人类包皮成纤维细胞基于前面描述的协议(24]。关于 在章节3 - 8成纤维细胞培养在T-25烧瓶内,直到80%的融合。水瓶在43°C孵化的热应力,而其中一个停留在37°C的控制轻细胞。2 h后,细胞培养基从所有的玻璃瓶,并与PBS细胞被洗两次。新鲜血清杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)(擤鼻涕、法国)添加到烧瓶,和细胞孵化6 h标准细胞培养条件。孵化期后,收集细胞培养上清液和集中使用Amicon超离心机过滤(切断:3 kDa) 7500 g×40分钟。总蛋白浓度是由布拉德福德法(25]。DMEM溶液的吸收与布拉德福德试剂已从样本中扣除了背景颜色。

2.3。流式细胞术分析

收集细胞培养上清液后,一夜之间,heat-stressed成纤维细胞被孵化 。然后,成纤维细胞被trypsin-EDTA分离,准备与流式细胞术分析(Partec、德国)与膜联蛋白V / propidium碘染色后(π)根据制造商的协议的膜联蛋白/π(美国eBioscience)。

2.4。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)

500年μL heat-stressed集中样品已准备的纤维母细胞文化是与冷丙酮混合1:4比和孵化一夜之间在-20°C。然后,样本离心机在4°C 10000×g 30分钟。沉淀蛋白质溶解在20μL蒸馏水,示例加载到12%聚丙烯酰胺凝胶。电泳过程运行在120 V 3 h(美国Amersham)和凝胶与硝酸银染色。独立实验重复了三次。

2.5。二维电泳(2 de)

20μ克蛋白质由heat-stressed成纤维细胞与250年在一夜之间被孵化μL补液缓冲区(8 M尿素,4% M / v皮套裤,65毫米德勤,0.001% M / v溴酚蓝)。蛋白质分子是集中使用以下项目Ettan IPGphor III(美国通用电气医疗集团生命科学)20°C, 50 V 30分钟,30分钟100 V, 150 V 30分钟,30分钟250 V, 1000 V梯度1 h, 8000 V梯度2 h, 8000 V和40000 V / h。减少蛋白质平衡缓冲地带是孵化(0.05 M Tris-HCl, pH值8.8,6 M尿素、30%甘油、2% SDS)包含130毫米德勤15分钟,和烷基化过程是在一个单独的完成管包含平衡缓冲和135毫米碘乙酰胺动摇了15分钟。然后,加沙地带被转移到12% sds - page凝胶电泳过程是运行。这种凝胶被Coomassie蓝色r - 250染色。独立实验重复了两次。

2.6。评估血清Anti-HSP免疫球蛋白与ELISA

10μg / mL heat-stressed集中文化上层清液的成纤维细胞(由布拉德福德标准化方法)是涂在96 - SPL Maxisorp Immunoplates(中国)一夜之间在4°C。然后,浮层被,板被1%的牛血清白蛋白(BSA)在磷酸盐(PBS) 4 h在室温下(RT)。5次洗涤后冲洗缓冲(1 x PBS渐变20 0.1%),100年μL稀释血清样本(1:100年1 x PBS, BSA的1%,和0.1%渐变20测定稀释剂)和100年μL高积极anti-heat-stressed成纤维细胞的蛋白血清(汇集积极血清稀释测定稀释剂解决方案1:2的比例)被添加到每个。此外,100年μL分析稀释剂的解决方案是五井作为消极的控制。然后,板块在RT孵化1 h。在100年5次洗涤μL辣根过氧化物酶(合)共轭反人类免疫球蛋白g(1: 4000年测定稀释剂)被添加到每个在RT和孵化1 h。洗后彻底和攻丝,双氧水(过氧化氢)和3,3 ,5、5 - - - - - -Tetra-Methyl联苯胺(三甲)解决方案是补充道。停止的解决方案(1 m硫酸)显色后,医生会和样品的光学密度(OD)与ELISA测定读者(Rayto,中国)450海里。抗体浓度标准曲线绘制的基础上得出根据OD值高积极混合血清的成纤维细胞的热休克,这是表示为非盟/毫升。独立实验重复了两次。

2.7。统计分析

数据表示为 和中位数。正态分布的数据被Kolmogorov-Smirnov测试检查。Mann-Whitney测试和逻辑回归来比较具体anti-HSP抗体水平和人口统计变量的调整优势比,分别。所有数据由22 SPSS软件进行了分析。值< 0.05统计视为显著性水平。

3所示。结果

3.1。皮肤成纤维细胞分泌两种酸性蛋白在热休克反应

获得一个整体观点有关的蛋白质分泌heat-stressed皮肤成纤维细胞,血清总蛋白浓度以及sds - page和2 de模式是决定强调上层清液的细胞( )相比轻成纤维细胞( )。令人惊讶的是,有一个显著的上层清液的总蛋白水平强调细胞( : μg / mL)和一个几乎无法检测到的水平的上层清液中不重读的成纤维细胞。sds - page模式显示,只有一个带厚厚的70 kDa蛋白质是观察,反复(图2(一个))。这个乐队是分为两个不同的地方在2 de凝胶70 kDa的分子量和等电点(pI)(图5.3和5.52 (b))。

以确保这些蛋白质从活细胞被释放,我们注意到细胞形态以及可行性分析与膜联蛋白/ PI染色。没有突出的成纤维细胞形态区别前后热休克,除了有点heat-stressed细胞收缩(数字3(一个)和3 (b))。此外,只有百分之一的细胞表现出坏死细胞死亡的模式,而大多数heat-stressed成纤维细胞仍然活着(图3 (c))。

3.2。Heat-Stressed成纤维细胞的分泌蛋白质表现出更强的免疫反应正常受试者和CAD患者的血清

表1显示了人口统计学变量的CAD患者和正常对照组。研究免疫反应性fibroblast-derived热休克,这些蛋白质特定的免疫球蛋白g抗体的血清水平测定血清ELISA的CAD患者和正常对照组。如图4(一),控制的特定anti-HSP IgG水平明显高于在CAD患者(表2)。

anti-HSP抗体的检测下限的内部酶联免疫试剂盒获得0.5 AU /毫升。此外,接受者操作特征(ROC)曲线分析显示截止值的敏感性64%,特异性74% 30.5 AU /毫升(图4 (b))。然后,截止值,一个2乘2频率表的特定抗体浓度对热休克(> 30.5 AU /毫升或< 30.5 AU /毫升)与冠状动脉粥样硬化的存在与否是设计(表3)。的百分比anti-HSP免疫球蛋白g -科目(< 0.5 AU /毫升)的病人是高于对照组(分别为30%和4%)( )。从这个意义上说,结果显示anti-HSP抗体对冠状动脉粥样硬化的保护作用。CAD的优势比anti-HSP抗体等于5.06 ( )。调整后的优势比下降到4.64的高血压和性别anti-HSP抗体(表4)。

4所示。结论

尽管显著进步CAD的治疗和预防动脉粥样硬化的仍然是一个主要原因死亡率在全球层面(1]。可能觉察到双向应力对心肌细胞从外围到心脏,反之亦然强烈导致动脉粥样硬化CAD (26,27]。记住,动脉粥样硬化病变是更常见的在分支站点最常接触到各种类型的压力如高脂血症和血流中断(21,28]。因此,一个更全面的对动脉粥样硬化的细胞应激反应可能打开一个新地平线到更好的理解疾病的病理生理学以及新的诊断标志物的发现和有效的治疗策略的发展。虽然内皮细胞的作用,smc,巨噬细胞ER应激已经有据可查的,然而,成纤维细胞的功能在动脉粥样硬化的病因仍不清楚。事实上,针对这种类型的细胞压力通过使用天然化合物在动脉粥样硬化的治疗打开一个新窗口(17]。因此,目前的研究提供了新的见解的潜在作用antifibroblast-derived HSP抗体预防冠状动脉粥样硬化。

基于先前的报道,热休克可能是由皮肤成纤维细胞和角质细胞最丰富的和潜在的有害环境压力包括紫外线辐射(29日,30.]。休克蛋白免疫原性分子发挥重要作用在心血管健康或疾病(31日]。休克蛋白可以刺激体液免疫反应,可能诱发auto-inflammatory疾病如动脉粥样硬化(32,33]。先前的研究已经显示出显著增加循环anti-HSP60动脉粥样硬化患者的抗体(34,35]。此外,anti-HSP60抗体水平上升高度导致动脉粥样硬化性心血管疾病(36]。因此,它是合理的假设可以通过释放热休克皮肤成纤维细胞在生理条件下可能激活自然免疫系统产生抗体。当前研究的新颖性的识别是体液免疫应答的CAD患者和健康对照组heat-stressed成纤维细胞分泌的蛋白质。

在我们的研究中,一个非凡的蛋白质水平确定heat-stressed纤维母细胞的文化。流式细胞仪分析显示,近百分之一的坏死细胞死亡的特点是heat-stressed成纤维细胞表明蛋白质可以积极被活细胞分泌。此外,2 de结果证明两个黑点酸性面积与π和相同的分子量。虽然这些斑点可能称之为压力蛋白HSP70和热休克蛋白质同源71 kDa ExPASy数据库中根据生物信息学搜索,然而,免疫印迹数据需要确认结论。有趣的是,血清anti-HSP抗体检测在近83%的研究对象和在正常对照组明显高于在CAD患者。最有可能的是,基因变异以及免疫相关基因的多态性导致抗体生产之间的差异auto-inflammatory疾病患者和正常对照组。值得注意的是,il - 6基因启动子多态性与anti-HSP60显著相关抗体水平在冠状动脉粥样硬化患者37]。此外,2型糖尿病患者有一个更高层次的anti-HSP60抗体与c - 174 g多态性在il - 6基因的启动子区域38]。阳光照射和身体活动的影响可以被认为是其他因素这状态39]。此外,减少血清anti-HSP抗体可能增加5.06倍CAD的风险,这是减少到4.64倍,调整性别和高血压。张等人指出,增加anti-HSP70抗体水平显著相关的风险降低急性冠脉综合征(ACS) (40]。同时,Pockley等人报道anti-HSP70抗体的保护作用高血压受试者通过减少动脉粥样硬化的风险41]。因此,我们表明,fibroblast-derived蛋白在热休克反应可能有潜在影响,防止人类冠状动脉粥样硬化通过诱导产生抗体。据推测,这些抗体能够目标ER stress-mediated动脉粥样硬化;尽管如此,这还需要进一步的研究来确定潜在的抗体介入动脉粥样硬化预防机制。

另一方面,ROC分析显示,anti-HSP抗体的敏感性 非盟/毫升是64%。这些数据表明,anti-HSP抗体可以被认为是冠状动脉粥样硬化的诊断的生物标志物,几乎相同的运动压力测试灵敏度为66% (42]。

综上所述,人类皮肤成纤维细胞分泌免疫原性蛋白的相对分子量70 - 74 kDa热休克反应。它可能会觉察到一个适当的免疫协议与热休克作为冠状动脉粥样硬化的预防工具。此外,antifibroblastic HSP抗体可以被认为是一种新型生物标志物对冠状动脉粥样硬化。本研究也显示真皮成纤维细胞和冠状动脉血管的健康之间的关系,可以打开一个新的前景之间的相关成纤维细胞和冠状动脉粥样硬化的研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

我们声明,没有利益冲突,出版的贡献。

确认

这项工作是支持的资助大学医学科学研究委员会的精工(2642号)。我们感谢细胞和分子研究中心的人员的精工大学医学科学的协作。我们还要感谢Asgarian博士和Nattaj先生是我们的同事马赞达兰大学医学科学的流式细胞仪的技术援助。