文摘

背景。心肌梗死后,抗炎巨噬细胞发挥了重要的自我平衡的功能,促进心脏复苏和重建。多项研究表明,乳酸可作为一个修饰词影响巨噬细胞的表型。然而,乳酸钠的治疗作用在心肌梗死(MI)尚不清楚。方法。MI建立了永久性结扎冠状动脉左前降枝的注入生理盐水或乳酸钠紧随其后。通过超声心动图心脏功能评估。心脏纤维化区域被马森评估三色的染色。巨噬细胞表型检测通过qPCR、流式细胞仪和免疫荧光。信号蛋白被西方墨点法测量。结果。乳酸钠治疗心肌梗死后心脏性能改善,增强抗炎巨噬细胞比例,减少心肌细胞凋亡,并增加新血管形成。Flow-cytometric分析结果报道,乳酸钠压抑的il - 6 +, il - 12 +, TNF -α+ LPS-stimulated骨骨髓来源中巨噬细胞巨噬细胞(BMDMs)和增加的mRNA水平Arg-1, YM1 TGF -β,il - 10。机械的研究表明,乳酸钠增强P-STAT3的表达。此外,STAT3抑制剂消除钠lactate-mediated促进巨噬细胞极化。结论。乳酸钠促进抗炎M2巨噬细胞极化和防止通过调节P-STAT3 MI。

1。介绍

缺血性心脏病是最常见的死亡原因,全球和频率增加。尽管急性治疗和长期护理改善急性冠脉综合征(ACS)的临床表现、心脏病仍然是最常见的死因的词,和治疗也是一个挑战1- - - - - -3]。越来越多的证据表明,炎症反应是至关重要的事件在愈合过程和心脏postinfarction重建。心脏修复心肌梗死(MI)后由健壮的组织炎症,其次是积极的抑制和决议。大量的细胞和分子因素影响mi后伤口愈合和修复(4]。组织再生是高度依赖于巨噬细胞的表型或极化状态。此外,巨噬细胞通常分为两个主要的表型,促炎(M1)和抗炎巨噬细胞(M2)。M1巨噬细胞分泌等多种促炎细胞因子il - 1β、il - 12、il - 1α、il - 6、IL-23 TNF -α,cyclooxygenase-2 (cox - 2),所有这些都有助于炎症。相比之下,M2巨噬细胞表达下调炎性细胞因子和移植抗炎细胞因子il - 12和大量的il - 10, TGF -β,VEGF促进抗炎作用和修复(5,6]。初期mi后,受伤的心是由炎性巨噬细胞、几天后,抗炎巨噬细胞。此外,死亡的心肌细胞释放有关分子模式(抑制),如纤连蛋白片段,核chromatin-binding蛋白质高机动组盒1,低分子透明质酸,心脏肌凝蛋白、线粒体DNA和RNA分子,细胞外循环和热休克蛋白,导致系统性炎症反应和招募当地反应循环单核细胞进入梗塞的网站(7- - - - - -9]。因此,巨噬细胞中发挥非常重要的作用开始,发展,解决MI后免疫反应。巨噬细胞还显示功能异质性,指导正确的伤口愈合。高效的凋亡细胞的清除和修复纤维反应心肌梗死后组织修复至关重要。然而,这些进展是策划的M2巨噬细胞(9- - - - - -11]。此外,针对巨噬细胞极化是一种新型的治疗心肌梗死的治疗策略。

代谢副产物——乳酸以前认为,越来越多的证据表明,乳酸代谢调节的关键,在调节不同的生物过程中起着举足轻重的作用12,13]。Colegio等人发现,肿瘤相关巨噬细胞(TAM)偏振依赖tumor-derived乳酸,机制是由低氧诱导因子1α(HIF1α)[14]。此外,一些研究还表明,乳酸足以诱导巨噬细胞极化的方式取决于酸性pH值在一些肿瘤微环境(15- - - - - -17),强调机制是不确定的。此外,肿瘤微环境中的细胞乳酸的反应非常不同的上下文中发生慢性炎症。因此,新的研究在这种背景下存在多个潜在的临床应用。此外,最近的证据显示,巨噬细胞的发展,表型和功能展示非凡的异构性和可塑性在心脏和其他组织(9,10,18]。因此,乳酸钠是否参与炎症条件下巨噬细胞极化和乳酸钠是否有潜在治疗效果尚不清楚。在我们的研究中,我们发现乳酸钠加速骨骨髓来源的巨噬细胞的极化(BMDMs)在脂多糖(LPS)。此外,乳酸钠也提供了心血管效应通过促进巨噬细胞极化MI小鼠模型。

2。材料和方法

2.1。动物和治疗

所有动物实验根据实验动物的使用和护理指南发布的生物医学研究由美国国立卫生研究院(85 - 23号,1996年修订),经动物实验的伦理委员会批准的华西医院(2019189号),四川大学。雄性C57BL / 6小鼠年龄在8到10周和3%异氟烷麻醉。然后,老鼠被放置在正确的横向卧位的位置。借助手术显微镜、左冠状动脉前降的(小伙子)可以可视化和永久的结扎7丝缝合在2毫米以下附件。乳酸钠(2 g /公斤/天。美国Sigma-Aldrich)或生理盐水治疗腹腔手术后一天。

2.2。组织学制备

3天或14天治疗后与乳酸钠或生理盐水,心肌梗死(MI)小鼠麻醉和心中被暴露。病理检查,心被逮捕通过脑室注射1毫升1 mol / L氯化钾后跟5毫升PBS和10毫升4%多聚甲醛灌注。然后,一夜之间,心被仔细解剖和固定在4%多聚甲醛。生化和分子分析,心中灌注了PBS然后snap-frozen在液氮和储存在-80°C。

2.3。流式细胞术

评估巨噬细胞极化MI后3天,雄性小鼠麻醉,8-10-week-old intracardially灌注与冰冷的PBS排除血液细胞。然后,心被解剖,保持酶的消化与125 U /毫升胶原酶XI的鸡尾酒,60 U /毫升DNase我,450 U /毫升胶原酶,60 U /毫升透明质酸酶(Sigma-Aldrich) 1 h在37°C与温和的风潮。消化后,组织被磨碎,经过70年μm细胞的过滤器。Percoll Leukocyte-enriched分数被孤立的37 - 70%(通用电气医疗集团)密度梯度离心法。数据分析FACSCalibur仪器(美国BD生物科学,圣何塞,CA)使用NovoExpress软件,控制策略检测浸润免疫细胞的不同子集。免疫细胞被封闭在一个向前散射(FSC) /散射(SSC)的阴谋。活细胞进一步的确定白细胞(CD45 +细胞),然后进一步的确定单核细胞(CD11b + Ly6Glow)和巨噬细胞(CD11b + Ly6G-F4/80 +)。CD11b +细胞然后进一步的确定M1 (F4/80 + CD206low)和M2 (F4/80 + CD206high)巨噬细胞。从BioLegend获得使用的抗体。

2.4。超声心动图

超声心动图分析红外手术后14天。老鼠与异氟烷麻醉,心脏功能评估使用超声心动图机(Vevo3100,富士胶片)。图像的获得左心室测量心脏功能的情况。

2.5。组织化学和免疫荧光

组织学为免疫组织化学染色进行心脏组织,已经收获,固定在4%多聚甲醛,嵌入在石蜡,切成部分,和阻止5% BSA为0.5 h,之后的部分与PBS洗。样本覆盖5% BSA为0.5 h和孵化与抗体(anti-CD31, 1: 200;Abcam anti-Arg-1 1: 100;ProteinTech集团anti-CD206 1: 100;一夜之间ProteinTech集团)在4°C。组织化学,然后样本应用HRP-conjugated抗体(Abcam)在室温下4 h。免疫荧光,组织孵化后抗体一夜之间,然后用PBS洗了三次,与适当的二次孵化的部分抗体Alexa萤石594 AffiniPure驴anti-rat在室温下2小时。与PBS 3倍额外的洗涤后,部分是用DAPI Fluoromount-GTM (Yeasen)来识别核。荧光显微镜图像被用显微镜(IX83;蔡司)。 Masson’s trichrome staining was performed for cardiac fibrosis analysis. Staining was observed using fluorescence microscope (IX83; Zeiss). Quantification of all data was performed with the ImageJ software.2.2.

2.6。末端转移酶的dUTP尼克结束标签(TUNEL)染色

心脏组织是收获,固定在4%多聚甲醛,嵌入在石蜡,切成部分,和阻止5% BSA为0.5 h,后部分是用PBS,分为3μ片,permeabilized Triton x - 100 20分钟,0.3%和阻塞30分钟5%牛血清白蛋白。这是使用TUNEL FITC染色细胞凋亡检测设备(Beyotime生物技术、中国)根据制造商的指示。核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1μg / ml)。最后,用蔡司IX83显微镜捕获图像。

2.7。细胞培养和药物治疗

骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)用于本研究获得男性8-10-week-old老鼠骨髓。总之,老鼠牺牲;酒精消毒后股骨和胫骨被移除;骨髓是收集,过滤70μ过滤器(BD猎鹰),在1000转离心5分钟;获得的细胞培养皿在RPMI 1640培养基培养(HyClone;通用电气医疗集团生命科学)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco;热费希尔科学公司),20 ng / ml巨噬细胞集落刺激因子(csf;PeproTech;400 - 28),1%的青霉素和链霉素(HyClone;通用电气医疗集团生命科学)。3天之后,相同的介质被新的取代介质- csf的浓度。BMDMs分化5 - 7天是用于实验。 For macrophage polarization, the BMDMs were incubated with 100 ng/ml LPS (Sigma; L2880) for 24 hours and then treated with sodium lactate (20 mmol/L) for another 24 hours, and 20 μM SH-4-54 (Selleck化学品)和乳酸钠被添加在中在同一时间。细胞流式细胞仪的细胞培养板和0.25%胰蛋白酶消化,F4/80是用来描述巨噬细胞,促炎被确认为TNF -α分别、il - 6和il - 12。

2.8。实时定量rt - pcr(存在)的分析

总rna分离用试剂盒试剂按照制造商的指示(表达载体、钙、美国)和转化为互补使用热科学RevertAid RT工具包(表达载体、钙、美国)。mRNA水平的il - 6、il - 10 Arg-1, Fizz-1, 18岁决定SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒、Venlo、希尔登,德国)。目标mRNA水平正常化的几何平均18岁mRNA水平。中存在的引物是列在表中1。

2.9。免疫印迹分析

短暂,蛋白质被孤立和解决SDS-polyacrylamide凝胶电泳在10%,转移到一个聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。经过2小时的孵化与0.1% Tween-20三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBST)和5% BSA,膜被孵化与特定一夜之间主要抗体。主要抗体,GAPDH P-SATA3、DRP-1和P-AKT从细胞信号技术(美国波士顿)。从Abcam LC3B得到。细胞膜随后被孵化与HRP-conjugated山羊anti-rabbit或山羊anti-mouse免疫球蛋白二次抗体2 h。过氧化物酶的活性保留在这些墨迹与增强化学发光测定(ECL)检测试剂从通用电气医疗集团(乌普萨拉,瑞典)根据制造商的指示。

2.10。统计分析

统计分析是使用GraphPad棱镜8执行软件。所有数据了 。正态分布进行了测试使用Shapiro-Wilk测试。两组之间的差异未配对比较 - - - - - -测试。超过两组是由单向方差分析,然后事后图基的多重比较检验。所有值是双尾,值<。05年被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。乳酸钠对心血管效应MI小鼠模型

首先,我们调查了乳酸钠在心肌损伤的保护作用。手术后的一天,乳酸钠是由腹腔内注射连续14天。超声心动图进行,检验表明,乳酸钠减毒mi后心脏功能障碍通过改善射血分数(EF)和部分缩短(FS)(数据1(一)和1 (b))。此外,免疫组织化学结果报道,乳酸钠减少心肌细胞凋亡,抑制心肌纤维化和增加新的血管密度mi(数据1 (c)- - - - - -1 (e))。这些结果表明,乳酸钠能改善心肌梗死后心脏功能。

3.2。乳酸钠通过增强巨噬细胞极化减弱心肌梗死损伤

先前的研究发现,肿瘤微环境(乳酸促进巨噬细胞极化16],它激励我们是否巨噬细胞极化参与钠lactate-mediated MI的心脏保护。此外,心脏组织的免疫荧光分析显示Arg-1和CD206积极的增强巨噬细胞(M2-like)比例相比saline-treated MI老鼠(数字2 (c)和2 (d))。另一个,我们测量Arg-1蛋白表达在缺血性心脏组织乳酸钠治疗后3天。值得注意的是,乳酸钠治疗明显增加Arg-1 MI小鼠的心脏与生理盐水治疗(图2 (e))。Flow-cytometric分析表明,乳酸钠调节巨噬细胞极化和心肌梗死后早期炎症反应(数字2(一个)和2 (b))。

3.3。乳酸钠治疗疗效M2巨噬细胞极化,抑制炎性巨噬细胞

乳酸钠改善心脏表现MI小鼠模型通过增加M2巨噬细胞比例。乳酸钠是否有同样的效果在体外也探索。因此,BMDMs孵化了有限合伙人(100 ng / ml)诱导巨噬细胞极化。探讨乳酸钠在巨噬细胞极化的作用,我们检查了TNF的表达α+、+ il - 6和il - 12 +巨噬细胞流仪分析;Arg-1的mRNA水平,il - 10, YM-1, TGF -β乳酸钠(M2)标志是刺激。乳酸钠降低TNF -α+、+ il - 6和il - 12 +阳性巨噬细胞比例(数字3(一个)- - - - - -3 (c)),同时增加Arg-1, il - 10, YM-1 TGF -β表达式(图4 (b)),这表明乳酸钠抑制促炎的巨噬细胞,促进了M2巨噬细胞极化。

3.4。通过P-STAT3乳酸钠增强巨噬细胞极化

阐明底层机制、LC3B P-AKT, dynamin-1-like蛋白质(DRP-1)在心脏缺血组织检查(数字5(一个)和5 (b)),这些蛋白质不受上下文中的乳酸钠MI的影响。此外,我们研究了乳酸钠的影响phosphorylation-signal换能器的表达水平和转录激活3 (P-STAT3)小鼠模型。有趣的是,P-STAT3表达增加腹腔内注射乳酸钠(图4(一))。验证P-STAT3是乳酸钠的一个目标,一种STAT-3抑制剂,我们发现STAT-3抑制剂成功抑制P-STAT3表达式在BMDMs(图4(c))。然后,STAT3抑制剂是管理与乳酸钠LPS-stimulated BMDMs。正如所料,STAT-3抑制剂抑制P-STAT3 upregulation和逆转的影响巨噬细胞极化乳酸钠(数字4 (d)和4 (e))。总之,我们的结果表明,乳酸钠增强巨噬细胞极化P-STAT3信号通路。

4所示。讨论

最近,越来越多的研究已经开始显示出新的乳酸和意想不到的生物功能,以前认为是副产品。直到现在,乳酸被公认为细胞代谢的主要碳源和作为信号分子都在正常,慢性炎症组织和癌组织(19- - - - - -23]。有趣的是,诺尔特等人发现,高渗乳酸钠液防止心脏功能障碍在脓毒症和同时减少炎症(24]。另一项研究也报道,注入half-molar乳酸钠能改善急性心力衰竭患者的心脏性能没有任何对器官功能产生不利影响。此外,研究表明,后处理lactate-enriched血液提供了潜在的心脏保护的st段抬高心肌梗死患者主要接受经皮冠状动脉介入(25- - - - - -27]。越来越多的证据表明,乳酸心脏病(可能是一种有前途的治疗方法28]。这里,我们用乳酸钠治疗小鼠心肌梗死后,两周后,小鼠心肌梗死与乳酸钠治疗表现出改善EF和FS与车辆组,显著增加微血管密度在边境地区。我们确定的百分比M2巨噬细胞占总细胞数的利用免疫荧光和流量仪MI心脏组织的分析,结果表明,乳酸钠增加M2巨噬细胞比例三天后MI。此外,在体外,乳酸钠也抑制il - 6 +,白介素、肿瘤坏死因子-α+巨噬细胞LPS-stimulated BMDMs和健壮的il - 10的表达,诱导Fizz-1 Arg-1, TGF -β,表明乳酸钠促进炎性巨噬细胞抗炎巨噬细胞极化。进一步验证机制相关的乳酸钠在巨噬细胞极化,LC3B, P-AKT, DRP-1测定和蛋白的水平没有显著改变。结果显示,LC3B、P-AKT DRP-1没有参与钠lactate-mediated巨噬细胞极化MI。此外,我们发现乳酸钠增强P-STAT3在缺血性心脏组织的表达。基于这些结果,我们得出的结论是,P-STAT3可能乳酸钠的目标在MI, STAT3在七STAT成员之一,日益引起了人们的关注由于其重要的角色在不同的生物过程,包括细胞增殖、细胞生存、炎症、免疫和血管生成和在诱导巨噬细胞极化也起着重要的作用。STAT3已经证明扮演的角色在一些心血管疾病,包括心肌梗死、动脉硬化、心脏肥大,心脏衰竭(29日- - - - - -31日]。一项研究证明了STAT3信号参与lactate-mediated TAM极化(15]。在这里,我们发现P-STAT3参与LPS-induced M2巨噬细胞极化。此外,乳酸钠也增强心肌梗死后P-STAT3水平,表明P-STAT3可能的关键目标乳酸钠介导巨噬细胞极化。值得注意的是,钠lactate-activated M2巨噬细胞的功能被抑制STAT3信号废除。这些数据表明,乳酸钠参与M2巨噬细胞极化通过激活STAT3信号通路,这可能有利于小说的发展和MI的有效治疗方法。

然而,仍然有限制在我们的研究中。微环境信号驱动巨噬细胞极化的MI和特定的M2巨噬细胞表型参与钠lactate-mediated巨噬细胞极化也仍未确定。基于这些发现,进一步的调查是高度要求演示巨噬细胞的表型和功能在体内平衡和MI,以及巨噬细胞极化的详细机制在MI (32,33]。综上所述,我们的研究结果表明,乳酸钠改善mi后治疗和心脏功能,有利于巨噬细胞极化,尤其是通过增加P-STAT3通路。因此,我们认为,应该进一步研究乳酸钠作为潜在的治疗心肌梗死。

缩写

小姐:	心肌梗死
有限合伙人:	脂多糖
BMDMs:	骨骨髓来源的巨噬细胞
SL:	乳酸钠
P-STAT3:	Phosphorylation-signal换能器和转录激活3
Arg-1:	Arginase-1
IL:	白介素
DRP-1:	Dynamin-1-like蛋白质
P-AKT:	磷酸化threonine-protein激酶。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从提交作者((电子邮件保护))要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

古时张和Fangyang黄同样对本文亦有贡献。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号。8197020724,81600347,81600347,81800433),四川科技项目(批准号。2019 yfs0349, 2020 yfs0246, 2017 sz0054),博士后研究项目,四川大学(授予数量:2020 scu12029),博士后研究项目,华西医院,四川大学(授予数量:2019 hxbh016)和中国博士后科学基金会(授予数量:2019 m663521)。