低浓度乙醇促进内皮祖细胞能力和修复功能

文摘

背景。内皮祖细胞(epc)招募了受伤的内皮和促进其再生。有证据表明,摄入适量的乙醇可以防止动脉粥样硬化的发展和发展各种各样的在体外和在活的有机体内模型和增加祖细胞的动员。此外,有研究发现在低浓度乙醇作为一种治疗工具动员外周血祖细胞。同时,内皮祖细胞的细胞数量代表了心血管系统构成和功能联系密切,导致心血管疾病的风险。本研究的目的是评估低剂量乙醇的影响内皮细胞克隆形成的典型特征(ECFCs),内皮祖细胞的增殖亚型。方法和结果。我们测试了乙醇是否影响ECFC的功能能力(例如,迁移、管的形成和扩散)在体外化验,ECFC的内部通信探索细胞表面分子通过流式细胞术,和的表达(反)血管生成分子通过ELISA。低浓度的乙醇浓度促进迁移、扩散和小管ECFC的形成。VE-cadherin细胞表面标志的表达,一种蛋白质中起着重要的作用和信息交互,提高了乙醇,而(反)血管生成分子表达没有影响。结论。乙醇在中等浓度增加内皮祖细胞的血管生成能力从而可能导致vasoprotection。

1。介绍

心血管疾病(CVD)是世界范围的一个主要的死亡原因。大多数心血管病是基于动脉粥样硬化,动脉血管的退化过程引起的内皮细胞氧化应激和慢性炎症状态。经典的风险因素包括吸烟,糖尿病,动脉高血压、总胆固醇的变化、肥胖、乙醇和过度消费。多项研究表明,强劲的乙醇消费在成人与心血管疾病的发生1- - - - - -4]。相反,适度的酒精消费相关的发病率和死亡率减少缺血性心脏病(5- - - - - -7]。乙醇对心血管系统的保护作用已被归因于血液脂蛋白的调制和降低血小板活化,从而减少血栓的形成。此外,其他研究表明,乙醇对心肌有直接的保护作用[5,8,9]。

组织再生的焦点是治疗心血管病的治疗。在这种情况下,适当的血管的形成是至关重要的。内皮祖细胞(epc)特别是他们的内皮细胞克隆形成增生性亚型(ECFCs)是内皮细胞内稳态的关键重要性和血管重建。此外,他们代表一个有前途的受损组织的血管再生的细胞来源。EPC生物学概念,改变影响内皮细胞功能支持最近的研究表明,减少循环内皮祖细胞的数量与内皮功能受损(10,11]。既减少了循环内皮祖细胞数量和功能受损的患者曾被观察到心血管疾病(12]。循环内皮祖细胞的数量预测心血管事件的发生,可以帮助确定病人风险增加(13]。ECFC可以从脐带血分离或外围成人血液和血管形成的迁移到网站,拥有能够分化为成熟内皮细胞,参与血管修复,形成新创内皮(14]。

血管生成蛋白质和血管细胞粘附蛋白血管健康的重要决定因素。血管内皮生长因子(VEGF)已被证实能促进动脉粥样硬化斑块进展(15]。此外,VEGF和胎盘生长因子(PIGF)刺激内皮细胞增殖和迁移以及调节血管生长和血管生成。VEGF及其可溶性fms-like可溶性受体酪氨酸激酶1 (sFlt-1)与血管损伤和修复在心血管疾病16]。血管细胞粘附蛋白1 (VCAM),血小板和内皮细胞粘附分子1 (PECAM1)和血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)发挥重要作用在白细胞外渗,炎症过程,血管通透性和主要参与细胞归巢的内皮修复和血管新生的网站17]。

在群组研究适量乙醇暴露与降低心血管发病率(18),底层pathomechanisms是知之甚少,特别是对EPC生物学。因此,在在体外模型,我们研究了乙醇是否有助于一个贫穷的EPC响应或者说具有保护心血管作用。

2。材料和方法

2.1。ECFC隔离和文化

ECFCs从脐带血被孤立如前所述19]。短暂,脐带静脉血液收集后立即交付到无菌EDTA-coated管。的收集血样离心机在3 h 2000 g为5分钟。单核细胞(MCs)被密度梯度离心法分离。等离子体被收集,取而代之的是同样体积的等离子体替代磷酸盐组成的缓冲盐溶液(PBS)补充0.025 EDTA (Sigma-Aldrich、Steinheim、德国或圣路易斯,密苏里州)和1% ( )青霉素、链霉素(Sigma-Aldrich)。通过添加隔离缓冲样本成交量翻了一番(PBS, 2% ( ),胎牛血清(德国柏林的边后卫,Biochrom公斤,或生活技术,卡尔斯巴德,CA),和1%的青霉素、链霉素),样本轻轻混合。样本分层聚蔗糖+(通用电气医疗集团,英国白金汉郡或皮斯卡塔韦,NJ)和在400 g 40分钟旋转桶离心制动在关闭的位置。MC分数被收集和清洗两次,一个隔离缓冲区。单核细胞在内皮生长培养基培养2(瑞士巴塞尔EGM-2 Lonza,或Walkersville, MD),补充了supplier-recommended浓度的重组人表皮生长因子,VEGF,抗坏血酸,氢化可的松,肝素,和重组胰岛素样生长因子、青霉素、链霉素的边后卫10%和1%。MCs镀的密度 细胞/在collagen-coated 6-well板块(BD生物科学、海德堡、德国或Billerica MA)和孵化37°C, 5%的公司₂。媒介改变了每天10天,然后每隔一天。第一次出现ECFC殖民地被指出是真皮及单层膜> 50迅速增殖,cobblestone-appearing细胞。殖民地被确定通过目视检查使用一个倒置显微镜(奥林巴斯、东京、日本;蔡司,纽约Thornwood)。定义良好的殖民地被释放从盘子使用克隆环和trypsin-EDTA和收集。细胞从每个独立的殖民地被置于一个好collagen-coated 6-well板和后汇合的80 - 90%,随后通过collagen-coated T25培养瓶。达到80 - 90%融合后,细胞T25烧瓶通道到gelatin-coated T75烧瓶血压得到较好的控制。在80 - 90%融合,这些细胞被收获,表型,在制冷剂和冷冻包含92% FCS和8% DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim,德国)。

流仪分析确认ECFC表型进行使用表面标记CD31, CD34, CD133, VEGFR-2, CD45以及适当的同形像控制。

所有实验与ECFC通道运行3 - 5在80 - 90%的融合。在这项研究中使用的乙醇浓度(0.5%(17毫米)和1%(34毫米))是不会引起中毒的剂量在活的有机体内和对应于2 - 4标准饮料。

2.2。在体外血管生成试验

我们使用了一个在体外血管生成试验(内皮小管形成基底膜基质)测试ECFC形成毛细管tubule-like网络的能力。在96孔板,每150年被播种17000细胞μ30 l治疗中μl生长因子减少人工基底膜(BD生物科学,贝德福德,MA)。ECFCs要么是0.5%和1%乙醇处理试验的持续时间或经过24 h和0.5%和1%乙醇。相应的控制w / o乙醇在串联运行。16 h 37°C和5%的孵化有限公司₂供应,每个被拍到与徕卡显微镜DMI 6000 B。总在每个视野小管长度测量使用ImageJ软件1.52 q(美国国立卫生研究院)。一式三份的所有实验井的平均价值( )。

2.3。细胞迁移试验

分析ECFC迁徙能力,50000年ECFCs被播种在每个12-well板生长培养基含有2.44%的补充剂,青霉素和链霉素FCS 5%, 1.2%。达到融合后,ECFC单层使用无菌P200挠吸管提示产生像之前描述的那样巷免费的细胞(20.]。ECFCs处理0.5%和1%乙醇或预培养24小时后0.5%或1%乙醇和相应的控制w / o乙醇在串联运行。光显微图像后立即得到划痕(T0)和实验结束时经过18 h (T18)。迁移到刮伤进行了分析使用ImageJ软件和计算的百分比伤口关闭(原来面积的百分比在T0,成为被细胞迁移到伤口面积在T18)。所有实验都做一式四份井平均价值。

2.4。细胞阻抗分析

细胞阻抗由实时阻抗分析使用xCelligence实时分析仪(RTCA,罗氏,曼海姆,德国)。细胞指数(CI),这反映了细胞粘附,由xCelligence从阻抗转换测量软件(版本1.2.1)和连续监测每20分钟后直接至少72 h和特定的细胞治疗。对于实验,10000个细胞被播种在一式三份到金色涂布E-Plate看来96 -孔板(罗氏,曼海姆,德国)和扩散是通过测量计算阻抗增加。ECFCs处理0.5%和1%乙醇或预培养24小时后0.5%或1%乙醇和相应的控制w / o乙醇在串联运行。

2.5。细胞增殖实验

确定的增殖能力ECFCs治疗后用乙醇,每口井的50000个细胞被播种6-well文化板块与5%(能量补充 )青霉素、链霉素的边后卫和1%。后24小时、48小时和72小时的治疗,细胞数量是算在纽鲍尔室1:2光镜下稀释。人口倍增时间计算如下: , , ,和 。治疗后ECFCs EtOH EtOH 24小时0.5%和1.0%,相应的未经处理的控制运行。

2.6。流式细胞术

流式细胞术分析检测ECFC表面粘附分子的表达。ECFCs接受1%的乙醇和相应的控制w / o乙醇在串联运行。细胞被孵化收获Accutase(摩羯座,Ebsdorfergrund,德国)在室温下10 - 15分钟。洗后用流式细胞仪缓冲区(PBS, 2% BSA(默克公司,达姆施塔特,德国)), 细胞与正常免疫球蛋白被封锁(Grifols、巴黎、法国)为1分钟(5毫克/毫升),其次是孵化与适当的抗体(VCAM1 APC (BioLegend,圣地亚哥,CA), PECAM1 FITC (BioLegend,圣地亚哥,CA)和VE-cadherin PE (BioLegend,圣地亚哥,CA))和同形像控制在4°C 30分钟。对于每一个实验,积极控制凋亡细胞被包括排除死亡细胞分析。凋亡的诱导是通过紫外光照射透照器(Biostep Jahnsdorf,德国)30分钟,和细胞进一步孵化2 h在室温下。细胞被收获,水洗,resuspended膜联蛋白V绑定缓冲,沾膜联蛋白V FITC (BioLegend,圣地亚哥,CA)和孵化了20分钟。洗后,在测量之前,propidium碘(10μg / ml) (Sigma-Aldrich,达姆施塔特,德国)补充道。流式细胞仪测量进行BD FACSCalibur流式细胞分析仪(德国海德堡,正欲),和结果进行了分析使用FlowJo X软件V10(树明星、亚什兰或)。

2.7。rt - pcr的量化VEGF、sFLT-1 PlGF, sEng基因表达

RNA的隔离ECFC根据协议执行的Chomczynski等人略修改(21]。ECFCs接受1%的乙醇和相应的控制w / o乙醇在串联运行。每个样本的RNA浓度确定spectrophotometrically (BIO光度计,埃普多夫,德国)。互补脱氧核糖核酸的合成,2μg的RNA与diethylpyrocarbonate稀释(DEPC)水的体积8μ在68°C l和变性为10分钟thermocycler (PTC 200、Biozym科学GmbH德国)。然后,12μl(高容量cDNA逆转录(RT)掌握混合添加。在每种情况下,1.5μl稀释cDNA和10.5μl掌握混合用移液器吸取到适当的带管(0.1毫升)。对于每一个治疗,三胞胎创建和三个rt - pcr对每个病人进行运行。正常化,18 s rRNA担任管家基因。引物序列如下:VEGF-A底漆5-TACCTCCACCATGCCAAGTG-3, VEGF-A反向引物5-GATGATTCTGCCCTCCTCCTT-3, sFlt1底漆5-AATCAGAGGTGAGCACTGCAAC-3, sFlt1反向引物5-TGGTACAATCATTCCTTGTGCTTT-3, PlGF底漆5-CCTACGTGGAGCTGACGTTCT-3, PlGF反向引物5-CCTTTCCGGCTTCATCTTCTC-3, sEng底漆5-ACCTTTGGTGCCTTCCTCAT-3, sEng反向引物5-CAATCCCTCAGAGGCTTCAC-3, 18 s rRNA正向引物5-ACATCCAAGGAAGGCAGCAG-3, 18 s rRNA反向引物5-TTTTCGTCACTACCTCCCCG-3。ECFC的相对表达水平控制车辆和孵化与乙醇终于相比。

2.8。免疫印迹的量化VEGF、sFlt-1 VE-Cadherin

分析蛋白质的VEGF, sFlt-1 VE-cadherin, ECFCs增长到50%融合在100毫米菜(Sarstedt、Numbrecht、德国)内皮生长介质与2.5% FCS各自的添加剂。ECFCs被播种到100毫米菜,只接受要么…(C =控制)或临时加1%乙醇。细胞治疗6毫升介质和培育为24小时37°C,其次是收获的细胞,细胞溶菌作用,蛋白质量化。

蛋白溶解产物分离通过sds - page和转移到硝化纤维素膜(通用电气医疗集团,布伦瑞克,德国)。后阻塞1 h和PBS-T干奶粉5%,膜是孵化一夜之间在4°C PBS-T + 5%干奶粉和适当的抗体:1:1000年抗vegf (Abcam,剑桥,英国),1:400年anti-sFlt-1 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和1:2000 anti-VE-cadherin (Abcam,剑桥,英国)。与PBS-T三次洗涤后,增加了二次抗体(1:5000只山羊anti-rabbit;通用电气医疗集团,德国布伦瑞克)在5%干奶粉在PBS-T在室温下2 h。可视化的免疫印迹乐队是由使用ECL化学发光(皮尔斯)和x射线。与ImageJ x射线进行扫描和分析软件。

2.9。ELISA量化的分泌蛋白质含量PlGF和生

PlGF sEng浓度测定,酶联免疫吸附试验(ELISA) (PlGF & sEng Quantikine酶联免疫试剂盒的研发系统,美国)根据制造商的建议。简单地说,100年μl (PlGF或50集中细胞培养上清液μl sEng添加/。标准和控制在重复化验和样品一式三份并孵化后适当的配合测量通过使用微型板块读者(热费希尔科学)450海里。

2.10。统计分析

收集到的个人测量值( )从实验分析了GraphPad Prism7 (GraphPad软件Inc .)的统计相关性Mann-Whitney - - - - - -测试或未配对 - - - - - -测试后确定数据分布使用夏皮罗Wilk正常测试。数据显示为平均值和标准偏差(SD)。相当大的偏差值对的指示值(< 0.05)和一个星号( )。

3所示。结果

3.1。在体外血管生成

基底膜基质血管生成模型是用来评估的能力ECFC分化成tubule-like结构(图1)。小管组合由ECFC 24 h预处理与乙醇相比,明显高于未经处理的ECFC(控制: ;0.5%乙醇: , ;1.0%乙醇: , )。在没有预培养、乙醇小管形成没有影响(0.5%乙醇: , ;1.0%乙醇: , )。

3.2。迁移

与刮伤区域填充表示为总额的百分比可能关闭车道(100%)、迁移ECFC的存在和缺乏乙醇测试(图2)。迁移到ethanol-treated ECFC相比,明显高于未经处理的控制(控制: ;0.5%乙醇: , ;1.0%乙醇: , ;24小时预培养0.5%乙醇: , ;24小时预培养1.0%乙醇: , )。

3.3。细胞阻抗

比较细胞阻抗ECFC乙醇处理和控制,确定阻抗的变化。细胞阻抗ethanol-treated ECFC测量多达72 h和相比,明显高于未经处理的控制(值在72 h的计算与控制:0.5%乙醇: ,1%乙醇: ;预培养0.5%乙醇: ;预培养1%乙醇: )(图3)。

3.4。扩散

ECFC的人口倍增时间短ethanol-treated细胞虽然不是明显不同(控制:24.91 h;0.5%乙醇:20.75 h; 与控制,1%乙醇:17.42 h; 与控制)(图4)。

3.5。VE-Cadherin, VCAM PCAM表达式

使用流式细胞仪,我们测试了ethanol-dependent VE-cadherin细胞表面表达,VCAM, PCAM ECFC(图5)。表达式的VE-cadherin ethanol-treated ECFC相比,明显高于未经处理的控制(控制: ;1%乙醇: , )而VCAM PCAM表达式并没有不同(VCAM:控制: ;1%乙醇: , ;PCAM:控制: ;+ 1%乙醇: , )。

3.6。VEGF、sFLT-1 PlGF, sEng基因表达

没有显著差异的VEGF, sFLT-1, PlGF或生基因表达ECFC乙醇处理相比,车辆控制(图6(一)VEGF: ;sFlt-1: ;PlGF: ;生: )。

3.7。蛋白表达的VEGF水平,sFlt-1 VE-Cadherin,分泌蛋白质水平的生和PlGF

没有显著差异蛋白表达的VEGF水平,sFlT-1或VE-cadherin ECFC治疗与乙醇相比,车辆控制(图6 (b)VEGF: ;sFlT-1: ;VE-cadherin: )。生的分泌蛋白质水平和PlGF ethanol-treated细胞之间没有差别和车辆控制(图6 (c)生: ;PlGF: )。

4所示。讨论

在这项研究中,我们将演示一个促进作用温和的乙醇浓度ECFC血管生成能力。在这种背景下,我们测试能力的迁移,扩散,和小管形成,提高孵化后中等浓度的乙醇。这些功能性质代表了重要的血管生成和血管生成,细胞特征的标记血管健康。Ethanol-treated细胞显示细胞表面标记VE-cadherin表达水平升高,蛋白质在信息交互中起着重要作用。有趣的是,乙醇的积极的效果似乎不是由VEGF, PlGF,生或sFlt-1。此外,mrna的表达水平、蛋白质、或可溶性蛋白表达没有不同乙醇处理后比未经处理的控制。

我们先前的研究发现证实数据的刺激乙醇对内皮功能的影响[演示了26,27]。然而,据我们所知,这是第一次研究证明增强的功能性质ECFC乙醇处理。ECFCs内皮细胞类型有强大的内在克隆增殖潜力和能力促进新生血管的形成在体外和在活的有机体内(21,22]。ECFC招募到受损组织的循环或来自当地的血管壁(23]。血管壁的内皮完整性恢复的迁移和扩散ECFC [24,25]。综上所述,基于当前积累的证据,ECFCs是最理性和有前途的细胞来源能够纳入或形成血管直接在组织再生。

一些流行病学研究证明适量乙醇消费的好处在缺血性心脏病(5- - - - - -7]。有趣的是,这些作品的结果表明,除了降低动脉粥样硬化的速度通过定期接触乙醇多年,至少部分ethanol-induced保护可以在几分钟内诱导血管内皮短曝光。这种保护可以提供温和的乙醇剂量,这对应于一个或两个酒精饮料。在这个时刻,在这项研究中,使用的乙醇浓度。,0.5%(17毫米)和1%(34毫米),是不会引起中毒的水平在活的有机体内每天和对应于2 - 3标准饮料(28]。陈等人表明,心肌细胞的治疗与10 - 50 mM乙醇防止缺血通过激活蛋白激酶C (26]。乙醇激活蛋白激酶C的能力也被观察到在其他几个电池系统(29日,30.),据报道调解从缺血心脏的保护。在活的有机体内经过长时间的研究证明心血管保护乙醇管理25 - 50 mM也在豚鼠模型。

恢复血流后组织损伤或闭塞需要从附近的完整的血管内皮细胞的血管生成发芽,以及血管生成通过循环ECFC允许入侵新血管恢复组织灌注。短期治疗与乙醇增加ECFC的能力可能是一个可能的治疗方法使血流量恢复更快。

乙醇可以保护心脏组织的确切原因和内皮尚未完全阐明。确定乙醇可以改变细胞膜的生物物理和生物化学特性。乙醇直接与膜蛋白相互作用来调节他们的活动。在不同的细胞模型中,乙醇暴露影响的信号转导由蛋白激酶C (31日,32)和cAMP-dependent蛋白激酶(30.,33]。

在我们的研究中,我们展示了VE-cadherin膜表面分子的表达,这是重要的信息交互。流程,由粘附分子,介导激活细胞动员、迁移,通过放松内皮细胞粘附和增殖复合物。这些机制受损在心血管疾病(17,34]。威德纳等人显示的表达VE-cadherin微血管减少斑块导致血管损伤(35]。VE-cadherin的观察增加我们的研究可能有助于增加内皮的修复能力。

关于保护作用,每年有一百万名成年人和15000名儿童进行心内直视手术在美国每年心脏暴露在缺血期控制。尽管心脏保护的进步,心肌功能障碍仍然是一个在不久的术后发病率和死亡率的主要原因。预期的确切时间缺血是已知的在这种情况下。因此,有针对性的使用护心剂可以防止内皮缺血的后果,剩下的心脏组织。可以推测,适量的乙醇可以护心,这种方法可能会进一步评估。

ECFCs似乎是一种很有前途的细胞来源revasculogenesis在心血管病的受损组织。他们有良好的血管化的潜力在体外和在活的有机体内,在这项研究中,我们表明,他们的潜力是通过添加少量的乙醇进一步增加。ECFC可以从脐血中分离出足够多数量可能在新生儿如果存储长期使用可以作为修复自体来源的细胞在成年期心血管病的治疗。在年龄较大的儿童和成年人,主要是循环外周血ECFCs很少单独使用,比脐带ECFC增殖和血管生成。最后,众所周知,某些疾病如糖尿病可以减少的频率和功能孤立ECFC到了这样一种程度,这些细胞不是足够的质量作为血管再生疗法(36,37]。这里,短期治疗与乙醇可能增加的能力和扩散能力ECFC为了达到更高的这些细胞的数量和质量。

总之,乙醇在中等浓度提高ECFC的血管生成能力。VE-cadherin Ethanol-exposed细胞表现出较高的表达水平,建议增加内皮修复能力。从流行病学研究证明我们的研究结果支持数据的好处短接触乙醇(成人预防心血管损害5- - - - - -7]。然而,这里提供的数据是有限的由于使用的主要细胞在体外条件和显示短期乙醇对内皮功能的影响。进一步研究长期适量乙醇暴露对ECFC生物学的影响仍然是需要的。

数据可用性

实验数据和行数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

没有利益冲突,金融,或者作者声明的。

确认

我们非常感谢老师的支持,居民和工作人员的分工的研究单位和妇产汉诺威医学院招募参与者和收集血液样本和卡佳。技术援助。这项研究是由德国研究基金会(DFG)项目资助VE490/7-1 (f·冯·Versen-Hoynck)。

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