Bazedoxifene具有保护作用对针对CD40炎症损伤的内皮细胞

文摘

炎症反应和氧化应激在动脉粥样硬化的形成和发展上发挥了关键作用。Bazedoxifene白细胞介素6是一个新的/ GP130抑制剂被FDA建议临床使用选择性雌激素受体调节剂。然而,它在心血管疾病中的作用一直缺乏研究。在我们的研究中,我们探讨了bazedoxifene机制对炎症性损伤的保护作用的血管内皮细胞(vec)刺激TNF -α。各种方法被用来验证bazedoxifene对vec的影响,包括细胞生存能力分析、伤口愈合试验、免疫荧光染色和免疫印迹。我们的研究结果表明,肿瘤坏死因子-α可能诱发炎症vec损伤,表现为调节表达CD40, ROS增加产量,增强vec THP-1细胞的粘附,vec受损的可行性和迁移,而bazedoxifene可以显著减少内皮损伤引起的肿瘤坏死因子-α。此外,我们发现目标的siRNA CD40大大缓解VEC损伤诱导的肿瘤坏死因子-α。因此,我们探讨了潜在bazedoxifene和CD40之间的关系。我们的数据表明,bazedoxifene对VEC TNF诱导的损害有保护作用α,其潜在的机制可能与CD40的监管。

1。介绍

动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎性疾病发生在大中型动脉血管中,并可能导致进行性狭窄病变的血管。在冠状动脉和颈动脉会导致心肌梗塞、脑缺血,,在严重的情况下,死亡(1]。的发病机制非常复杂,不容易理解。的发生涉及多个环境因素和多种细胞类型,包括巨噬细胞、血管平滑肌细胞和血管内皮细胞(vec)和内皮功能障碍中起关键作用的整个过程(2]。因此,保护动脉的内膜和抑制vec的炎症损伤的预防和治疗中扮演重要的角色。

CD40,肿瘤坏死因子超家族的一员,是一种跨膜蛋白受体中发挥着重要作用(3]。根据最近的研究,CD40表达在不同的细胞类型,包括血管平滑肌细胞,vec,血小板,免疫细胞(T细胞和B细胞)。CD40在各种病理条件下信号通路被激活,可能与炎症有关,,和血栓形成4,5]。的CD40配体CD40L,肿瘤坏死因子超家族的一员,并首次发现在激活T细胞。大量的研究表明,绑定CD40L和CD40可以诱导释放炎症因子(il - 1、il - 12、引发,TNF -α干扰素-γ、il - 6等)和促进各种炎症基因的表达,包括E-selectin,单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1 (MIP-1),血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1) [6]。高水平的VCAM-1 ICAM-1加重炎症性血管内皮损伤,促进中性粒细胞和单核细胞的滚动的血管,并让他们坚持受损的内皮,进一步促进动脉粥样硬化斑块的进展(7]。越来越多的证据表明CD40信号激活多个下游通路,包括NF -κB, MAPK、JAK / STAT和PI3K / AKT通路(8]。此外,CD40L刺激生产活性氧(ROS)在vec PI3K / AKT通路(9,10]。ROS被认为是内皮功能障碍的驱动力在许多病理条件(11,12]。例如,TNF -α引发过多的活性氧产量和随后的坏死核心形成血管病变,VEC迁移,抑制单核细胞组织因子表达增加,并激活血小板聚集(13- - - - - -16]。因此,抑制活性氧的生产可以有效预防的发展。

Bazedoxifene是一种新型的白细胞介素6 / GP130抑制剂已被FDA批准的选择性雌激素受体调节剂治疗绝经后妇女的骨质疏松症(17]。林等人所做的最新研究表明,bazedoxifene抑制白细胞介素6之间的交互,通过竞争结合GP130 GP130 D1地区,导致白细胞介素6的失活/ STAT3 / AKT / ERK信号通路,从而具有抗肿瘤作用在胰腺癌17,18]。很明显,有强烈CD40 / CD40L系统之间的串扰和白细胞介素6 / GP130下游通路。一些研究报道,bazedoxifene可能对心血管系统的保护作用[19]。Bazedoxifene调节引起的过氧化物生产和MCP-1表达式AGE-RAGE vec (20.]。绝经后猴子对待bazedoxifene动脉粥样硬化进展没有经验或相关不良事件(21]。Bazedoxifene也缓解了创伤性脑损伤,抑制MAPK / NF -κB信号(22]。然而,研究bazedoxifene血管生物学和疾病的作用是有限的,和bazedoxifene的机制发挥其心血管效应,特别是在多大程度上的监管效果bazedoxifene CD40改变ROS水平生产发挥作用,内皮功能障碍,仍不清楚。在这项研究中,我们打算调查的内皮功能障碍是否可以减少bazedoxifene治疗和报告第一次bazedoxifene抑制TNF -α全身的血管内皮炎症通过瞄准CD40,表明bazedoxifene可能是一个新的治疗药物。

2。材料和方法

2.1。材料

Anti-CD40 (# 28158 - 1 - ap, 1: 1000), anti-AKT (# 10176 - 2 - ap, 1: 1000), anti-GAPDH (# 10494 - 1 - ap, 1: 10000),和anti-ERK (# 16443 - 1 - ap, 1: 1000)抗体买来Proteintech(湖北、武汉,中国)。Anti-AKT-phosphor-Ser473(# 4060,1: 1000)和NF -κB p65(1 # 8242: 1000)抗体得到从细胞信号技术(麻萨诸塞州,美国)。Anti-phosphor-ERK(# 461212082,1: 1000)收购从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。Anti-phosphor-STAT3-Tyr705 (# abs130918, 1: 1000)是买absin(中国)。和anti-STAT3 (# GB11176, 1: 1000)和anti-ICAM-1 (# GB11106 1: 1000)获得Servicebio(武汉,中国)。

2.2。细胞培养

人类脐vec从中南大学购买。vec在DMEM培养(美国纽约high-glucose, Gibco)补充10%胎牛血清的边后卫,基布兹拜特Haemek,以色列和保持在相对湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂在37°C。vec被用来执行实验从第三段。vec洗了两次磷酸盐(PBS)当培养瓶中的细胞密度达到80%以上。然后,细胞接触中断0.25%胰蛋白酶,vec随后离心后胰蛋白酶化过程。稀释了vec完全培养基进行进一步的实验。

2.3。细胞生存能力分析

MTT法是用来测试细胞的可行性。vec在96孔培养板的密度 细胞/毫升,100μL细胞悬液的添加到每个。美国使用bazedoxifene vec (MedChemExpress) 30分钟,和TNF -α(# 300 - 01,落基山,新泽西,美国)添加到媒介文化的另一个24小时。麻省理工的解决方案是添加到每个样本,这些细胞被孵化为另一个4 h。随后,蓝紫色相比晶体于150年解散μ福尔马林溶液。最后,样本测量标在490海里。

2.4。Monocyte-Endothelial附着力试验

vec被播种到96孔板24 h。预处理后的vec bazedoxifene 30分钟,TNF -α添加另一个24小时的媒介文化。THP-1细胞被沾染了5μmol / L BCECF-AM避光(Beyotime、江苏、中国)30分钟,然后,THP-1细胞被添加到vec coculture 30分钟。随后,井与PBS洗两次去除细胞没有遵守矢量。Monocyte-endothelial细胞粘附是评估和定量分析的轻歌剧含量高成像系统(PerkinElmer,麻萨诸塞州,美国)。

2.5。ROS水平的测量

vec在96孔培养板第一次镀24 h。随后,他们使用bazedoxifene 30分钟。然后,肿瘤坏死因子-α添加到培养基,细胞培养24小时。Dihydroethidium (Beyotime、江苏、中国)是一个指标的ROS渗透率、和ROS标有5μ在黑暗中g / mL dihydroethidium 30分钟。ROS的产生进行了分析的轻歌剧Cy3含量高成像系统的通道。

2.6。细胞迁移试验

vec 6-well细胞接种到培养板。划痕宽度是相同的在用吸管vec提示细胞汇合的100%。vec洗两次与PBS。vec用bazedoxifene预处理后30分钟,TNF -α添加到培养基,细胞培养24小时。24小时后,伤口被倒置荧光显微镜测量。

2.7。RNA干扰

沉默CD40, vec播种6-well盘子是暂时性的转染小干扰RNA (siRNA)针对CD40或消极控制siRNA (Nc-siRNA) 48 h。Nc-siRNA或siRNA试剂的稀释riboFECT™转染工具根据制造商的指示。的沉默效果siRNA转染后被西方墨点法评估。

2.8。西方墨点法

根据制造商的指示,总细胞溶解产物提取与里帕裂解缓冲含有0.1% PMSF (Beyotime生物技术,中国)和变性10分钟的100°C。总蛋白被SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离(Beyotime生物技术,中国),然后转移到PVDF膜在100 V 80分钟。随后,膜被封锁的TBST含有5%脱脂奶粉在室温下60分钟和孵化与相应的抗体在一夜之间在4°C,后跟一个辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:10000)60分钟。免疫反应性的蛋白质被清晰识别™西方ECL衬底(伯克利,加州,美国)。光密度分析带强度进行了使用图像实验室软件(Bio-Rad)。

2.9。实时聚合酶链反应分析

总RNA提取矢量用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。实时PCR进行使用ABI 7300实时PCR系统SYBR绿色实时PCR试剂盒(CWBIO,北京)。分析了相对表达的il - 6的2^{- - - - - -ΔΔCt}方法。引物的序列如下:列出白介素5 - - - - - -GCAATAACCACCCCTGACCCAA-3和反向5 - - - - - -GCTACATTTGCCGAAGAGCC-3 ;GAPDH向前5 - - - - - -TGACTTCAACAGCGACACCCA-3和反向5 - - - - - -CACCCTGTTGCTGTAGC CAAA-3 。

2.10。统计分析

用SPSS软件进行统计分析(版本16.0)。数据的显示 。未配对学生的 - - - - - -测试是用于直接比较两组。组之间的差异比较采用单向方差分析(方差分析)。最显著的差异 - - - - - -测试(LSD - )方差分析后用于成对比较。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Bazedoxifene改善肿瘤坏死因子α全身的vec损伤

据报道,TNF -α可以用来建立一个稳定的炎症模型vec的浓度10 ng / mL 50 ng / mL (23- - - - - -25]。在这项研究中,我们进行不同浓度的TNF -α(10、25、50、100 ng / mL)确认VEC活动的影响。如图1(一),10 ng / mL TNF -α对vec没有显著影响。当TNF -的浓度α高于25 ng / mL, TNF -α减少剂量依赖性的方式vec的活动。因此,我们选择25 ng / mL TNF -αVEC损伤和建立模型,探索的药理效应对VEC刺激bazedoxifene TNF -α。在我们的研究中,我们使用MTT试验来评估bazedoxifene的细胞毒性。如图1 (b),当bazedoxifene的浓度高于4μmol / L, bazedoxifene VEC活动减少剂量依赖性的方式,而低浓度的bazedoxifene对细胞活性没有显著影响。随后,我们试图证实bazedoxifene能否扭转vec损伤引起的肿瘤坏死因子-α。符合我们的预期,4μ肿瘤坏死因子- mol / L bazedoxifene逆转α全身的VEC生存能力下降(图1 (c))。这些数据表明,bazedoxifene TNF -后改善vec的可行性α刺激。为了测试bazedoxifene对内皮功能的影响,我们进行了单核细胞粘附实验后TNF -α治疗。在我们的研究中,我们用BCECF-AM THP-1标记细胞,然后添加vec建立coculture系统。如图1 (d)、治疗的vec 25 ng / mL TNF -α大幅提升THP-1粘附vec,预处理的vec bazedoxifene减毒这种粘连,如预期。先前的研究已经表明,VCAM-1和ICAM-1蛋白质含量相关的胶粘剂和单核细胞的趋化现象的能力26]。因此,我们测量VCAM-1和ICAM-1水平由西方墨点法确定可能的药理机制bazedoxifene影响矢量和THP-1细胞之间的交互。我们发现VCAM-1和TNF - ICAM-1表达显著增加了α治疗组与对照组相比(图1 (e))。然而,预处理的vec bazedoxifene显著降低VCAM-1的表达的增加以及ICAM-1诱导的肿瘤坏死因子-α(图1 (e))。

3.2。Bazedoxifene TNF -的影响α全身的迁移和vec的活性氧产量

研究表明,高浓度的TNF -αVEC功能,在周围环境损害的VEC迁移(减少15]。确定的角色bazedoxifene VEC迁移,在矢量是培养有或没有TNF -αVEC迁移,被抓伤试验测试。如图2(一个)VEC迁移,抑制肿瘤坏死因子-α治疗组与对照组相比,之间的更广泛的空间分离的部分细胞,和bazedoxifene对vec的迁移没有明显的影响。更重要的是,预处理的vec bazedoxifene显著增强内皮修复在TNF -α治疗(图2(一个))。暴露的vec TNF -α迅速增加细胞内ROS水平,以轻歌剧高成像系统(图的内容2 (b))。预处理的vec bazedoxifene显著减弱活性氧的水平的提高vec在TNF -α治疗(图2 (b))。此外,vec刺激与TNF -α表明CD40表达显著增加,这种现象被bazedoxifene抑制(图2 (c)),这表明通过瞄准CD40 bazedoxifene可能施加的影响。

3.3。Bazedoxifene抑制JAK / STAT、MAPK / ERK PI3K / AKT, NF -κ肿瘤坏死因子- B信号触发α

激活JAK / STAT至关重要的应激反应(27]。调查bazedoxifene是否影响TNF -αvec全身JAK / STAT通路,免疫印迹分析蛋白质的提取vec接受不同的治疗方法进行评估p-STAT3的表达。如图3(一个)的表达式p-STAT3在TNF -显著增加α治疗组与控制相比,这种效果被大大抑制bazedoxifene浓度4μmol / L,这表明bazedoxifene部分抑制JAK / STAT3信号通路。在这项研究中,我们也试图验证的作用在TNF - MAPK / ERK通路α全身的VEC损伤模型和确定bazedoxifene会影响这一信号通路。如图3 (b)后,p-ERK表达显著增加vec TNF -α治疗。然而,bazedoxifene减少upregulation p-ERK表达诱导的肿瘤坏死因子-α,这表明bazedoxifene MAPK / ERK信号通路的抑制剂在这种条件。此外,p-AKT表达式被TNF -刺激α(图3 (c)),这与先前的报道是一致的,表明PI3K / AKT通路参与活性氧的生产(9]。预处理的vec bazedoxifene显著减毒的p-AKT水平的增加vec在TNF -α治疗(图3 (c))。我们的研究结果还表明,bazedoxifene仅能抑制p-STAT3的表达,p-ERK, p-AKT。

探讨TNF bazedoxifene——的影响α全身的血管内皮炎症,我们也评估了NF -κB激活在这项研究。如图3 (d)肿瘤坏死因子-α显著诱导的核表达p65 (p-p65)蛋白水平,和bazedoxifene明显减少了upregulation p-p65表达的肿瘤坏死因子-触发α。我们的研究结果还表明,bazedoxifene仅能抑制p-p65的表达。我们也评估了使用实时PCR白介素mRNA水平。有趣的是,bazedoxifene没有抑制il - 6的增加引起的mRNA表达TNF -α(图3 (e))。这些数据表明,bazedoxifene具有抗炎作用独立于il - 6的信号通路。

3.4。Bazedoxifene抑制肿瘤坏死因子-α全身炎症针对CD40在vec损伤

CD40是一种跨膜蛋白,它的超表达可以诱导激活多个下游相关通路。因此,我们进一步证实了CD40在内皮炎症功能丧失的作用实验。如图4(一)CD40表达显著降低,siRNA-mediated CD40淘汰赛组相比,控制和TNF -α治疗组。此外,结合siRNA-CD40与bazedoxifene进一步减少的表达CD40与单一治疗(图4(一))。

在这项研究中,我们发现核针对CD40和bazedoxifene能够反向迁移的障碍引起的vec TNF -α,这表明bazedoxifene VEC功能可能发挥保护作用通过瞄准CD40(图4 (b))。我们还发现CD40击倒和TNF -后bazedoxifene VEC增加生存能力α治疗,抑制单核细胞坚持vec, TNF -后ROS水平降低α管理局(数据4 (c)- - - - - -4 (e))。然而,有趣的是,bazedoxifene治疗没有VEC迁移,进一步改变VEC可行性,单核细胞粘附,ROS生产CD40击倒后VEC TNF -α政府,这表明CD40-dependent这些bazedoxifene对vec的影响。

4所示。讨论

大量的研究表明,肿瘤坏死因子-α可以建立一个稳定的VEC炎症模型(23- - - - - -25,28]。然而,TNF -的浓度α用于建立模型可以由特定的细胞不同的条件和技术。在我们的研究中,TNF -α25 ng / mL的浓度细胞生存能力下降大约80%。因此,我们选择25 ng / mL TNF -α建立一个炎症vec模型。第三代选择性雌激素受体调节剂,Bazedoxifene是临床上用于治疗骨质疏松症。最近的研究证实,bazedoxifene也是一个有效的白细胞介素6 / GP130抑制剂(17,29日,30.]。此外,bazedoxifene可以抑制活性氧引起的生产和MCP-1水平AGE-RAGE vec (20.]。然而,bazedoxifene的心血管效应及其在心血管疾病作用还知之甚少。在这项研究中,我们关注bazedoxifene的保护作用与肿瘤坏死因子-α全身的血管内皮功能障碍。根据我们的数据,低剂量bazedoxifene对vec的可行性没有显著影响,而高剂量bazedoxifene显示一些细胞毒性。因此,bazedoxifene在不同浓度应用vec探索其潜在的药理作用。我们的数据表明,bazedoxifene显著提高vec的存活率与TNF -刺激后α。因此,我们相信bazedoxifene可能是一个有效的药物治疗炎症vec损伤和可以保护的内皮损伤引起的各种炎症性疾病,如。

CD40 / CD40L是一对互补的跨膜蛋白,主要表达在多种免疫和多发地细胞,包括血管平滑肌细胞,巨噬细胞,淋巴细胞,vec (31日]。CD40 / CD40L信号通路的激活导致的upregulation许多促炎细胞因子和proatherosclerotic基因的表达,在许多疾病是一个重要的过程,特别是在(3]。CD40、CD40L相互作用促进单核细胞的粘附内皮受损,加重炎症和氧化应激水平,进一步加速内皮损伤,并促进不稳定斑块的破裂在先进的(32]。在我们的研究中,bazedoxifene显著抑制CD40表达诱导肿瘤坏死因子-α在矢量。鉴于CD40 / CD40L系统的角色在炎症反应和氧化应激,bazedoxifene可能通过调节CD40发挥从作用。

CD40 / CD40L可能触发多个信号级联,包括JAK-STAT PI3K / AKT,和MAPK / ERK途径,导致NF -的易位κB p65单元从细胞质到细胞核;移植的表达VCAM-1 ICAM-1,和其他炎性基因;促进炎症细胞的浸润;和诱导氧化应激26,33- - - - - -36]。所有这些病变加重局部炎性损伤和加重(27]。因此,防止overactivation PI3K / AKT, JAK / STAT3和MAPK / ERK信号通路可能从治疗的一个关键战略。Bazedoxifene是白细胞介素6的新发现抑制剂/ GP130街区的磷酸化下游目标,如STAT3 AKT, ERK (37]。相应的信号转导途径的分析揭示了一个强大的白细胞介素6 / GP130之间的串扰和CD40 / CD40L系统。符合最新发现(22,37],bazedoxifene强烈抑制TNF -α全身的激活JAK / STAT3的MAPK / ERK PI3K / AKT, NF -κ在矢量。更重要的是,bazedoxifene vec从TNF -保护α全身的伤害,这表明bazedoxifene可以通过调节心血管疾病中发挥保护作用的复杂网络连接CD40, STAT3,一种蛋白激酶ERK和NF -κB信号。

增加CD40、CD40L表达在人类动脉粥样硬化斑块,并通过基因敲除小鼠的抑制CD40可以显著降低动脉粥样硬化斑块的面积,促进斑块的稳定性,减少斑块破裂的风险(38]。据报道,最近,激活CD40 VEC迁移抑制通过增加活性氧的生产(15]。VEC迁移的障碍可能严重影响内皮再生后斑块侵蚀(32]。因此,抑制异常增加CD40 VEC迁移能力能促进斑块和恢复稳定的水平,防止血栓形成。与先前的报道一致,我们的研究表明CD40表达显著调节,ROS生产大幅增强,VEC TNF -迁移明显受损α全身的VEC损伤模型。然而,这些影响被bazedoxifene逆转。更重要的是,bazedoxifene治疗没有VEC迁移,进一步改变VEC可行性,单核细胞粘附,ROS生产CD40击倒后VEC TNF -α政府,这表明bazedoxifene VEC功能的影响是通过CD40介导。

总之,我们发现bazedoxifene可能发挥内皮保护作用在肿瘤坏死因子-α全身的血管内皮损伤模型通过抗炎和抗氧化途径。我们的工作提供了证据表明bazedoxifene保护血管内皮,抑制NF -的激活κB p65 MAPK / ERK PI3K / AKT, JAK / STAT3通路诱导肿瘤坏死因子-α。Bazedoxifene减弱活性氧产量受损内皮细胞和单核细胞的粘附和恢复对TNF - vec的迁移能力α治疗。肿瘤坏死因子- inflammation-mediated的破坏性影响αvec可以被推倒CD40,表明bazedoxifene发挥其保护作用通过针对CD40部分。我们的研究是第一个调查bazedoxifene的心血管效应是否可以被用来治疗内皮功能障碍和首次证明bazedoxifene目标CD40保护vec免受炎症损伤。我们的研究也有广泛影响的诊断和治疗。然而,本研究也有一些局限性。我们的数据表明,bazedoxifene通过CD40在内皮保护过程中发挥作用,但是他们不能解释bazedoxifene的药理机制。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

没有利益冲突。

确认

这个项目是湖南省卫生委员会支持的研究项目(编号20190967)和基础研究基金为中央大学中南大学(2019号zzts827)。我们要感谢我们的同事(利华国际黄博士,中国丁博士和王向东彭博士)第三湘雅医院对于他们的帮助我们的学习。

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