克隆之间的亲缘Imipenem-Resistant铜绿假单胞菌隔绝ICU-Hospitalized病人

文摘

Imipenem-resistant铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌)已成为一个越来越重要的问题在全球医疗保健设置。本研究的目的是评价克隆imipenem-resistant之间传播铜绿假单胞菌隔绝ICU-hospitalized病人。完全150伤口标本进行了分析。抗生素耐药性的概要文件和克隆多样性进行评估使用Kirby-Bauer磁盘扩散法和随机扩增多态性DNA (RAPD) PCR,分别。隔离显示对meropenem抗生素耐药性的高频率,和imipenem(100%),其次是环丙沙星,和头孢他啶(90%);同时对多粘菌素B没有被观察到。18 (40%)铜绿假单胞菌隔离是MBL-positive通过乙二胺四乙酸(EDTA)磁盘测试相结合。我们的研究结果显示遗传多样性高,37个不同的RAPD类型检测。RAPD结果显示cross-acquisition的打字铜绿假单胞菌在医院调查,显示失败的感染控制措施。MBL-positive隔离高发病率和住院病人应当被视为威胁。

1。介绍

铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌)是一个著名的医院病原体,经常孤立等不同类型的感染伤口感染,尿路感染(尿)、呼吸道感染和血液感染(BSI),特别是在重症监护病房(ICU)患者(1- - - - - -3]。自从抗生素耐药性铜绿假单胞菌对不同种类的抗生素正在迅速增长,其治疗变得更加具有挑战性的一年又一年过去了(4]。

碳青霉烯抗生素如imipenem和meropenem非常有效的治疗铜绿假单胞菌感染,当首次引入;然而,在不到十年——金属的使用这些抗生素耐药性β内酰胺酶——(MBL)生产菌株出现在临床的设置。耐碳青霉烯的多种机制已经观察到,包括MBL-enzymes、射流泵过度,OprD突变和类Dβ-lactamases [5,6]。

imipenem-resistant引起的感染的治疗铜绿假单胞菌是困难的,由于这一事实imipenem抗性基因通常位于转移基因元素,如质粒和整合子与其他抗生素耐药基因(7,8]。这些观察是一致的高死亡率和患病率观察患者感染imipenem-resistant铜绿假单胞菌。此外MBL-enzymes赋予抵抗几乎所有的生产β内酰胺抗生素,除了monobactam [9]。

分子流行病学方法如随机扩增多态性DNA (RAPD) PCR非常适合于确定的传播途径铜绿假单胞菌在医院病房(10,11]。评估imipenem-resistant的发病率铜绿假单胞菌在医院及其传播尤为重要医院感染的有效管理。本研究的目的是评估imipenem-resistant的发病率铜绿假单胞菌在ICU-hospitalized病人和记录克隆传播的潜力。

2。方法

2.1。标本收集和细菌鉴定

总共有150伤口拭子从烧伤病人的ICU病房转诊医院在伊斯法罕,2013年1月至2014年7月,被评估。伤口感染被确定基于临床症状,前面描述的(12]。每个病人中只有一个孤立的研究。伦理委员会批准的这项研究是伊斯法罕大学的医学科学(编号为392063)。

假定的识别铜绿假单胞菌是由使用标准的常规生化试验包括革兰氏染色法、过氧化氢酶、氧化酶、颜料生产、oxidative-fermentative(的)测试,和增长42°C (13]。随后,种特异的PCR是使用以前设计的引物对其(16 s-23s rRNA内部转录间隔区)(14]。聚合酶链反应混合物(25μL)是由200组成的μM核苷酸,2.5毫米MgCl₂DNA, PCR缓冲1 x Taq波尔1.5单元(Cinna Gen、伊朗),每个引物的10点(Metabion、德国)和40 ng DNA样本。以下循环条件应用:初始变性在95°C 5分钟,1周期,35周期组成的变性在94°C 1分钟,退火在58 45°C,在45岁72°C扩展,最终在72°C扩展了5分钟。

2.2。DNA提取

细菌新鲜殖民地(两个或三个)被移除和悬浮在300毫升的裂解缓冲包含三100毫米、氯化钠50毫米,和EDTA 25毫米,pH = 7.5,完全。然后悬挂在95°C煮15分钟。相同体积的苯酚/氯仿(pH = 7.5) 25日:24日说,彻底混合,在9000 g离心5分钟。Aqueous-viscous上层清液转换为新的微管和苯酚/氯仿(25:24)又添加了9000 g和离心5分钟。600年μL冷和纯乙醇(默克公司、德国)添加和离心机重13000克,(4°正在min)沉淀DNA。DNA在70%乙醇洗两次质量检查后储存在−20°C。

2.3。抗生素敏感性试验

抗不同的抗生素被Kirby-Bauer测试磁盘基于CLSI扩散方法(临床实验室标准协会)指南15]。下面的磁盘(桅杆,英国)应用:头孢他啶(CAZ、30μg), imipenem (IMP, 10μg), meropenem (MEM 10μg)、环丙沙星(CIP 5μ30 g), aztreonam (ATMμg)、多粘菌素B(铅、300单位)和阿米卡星(AMK 30μg)。铜绿假单胞菌标准菌株(写明ATCC 27853)是作为质量控制。

2.4。MBL的检测

铜绿假单胞菌隔离,抵抗imipenem和/或meropenem受到MBL-producing隔离的表型检测imipenem-EDTA磁盘测试相结合,如前所述[16]。差≥7毫米之间的抑菌圈直径imipenem-EDTA和imipenem-only磁盘被视为MBL-positive [16]。我们用EDTA磁盘本身的应变铜绿假单胞菌已知VIM-1金属-β-内酰胺酶的正面和负面的控制,分别。

2.5。随机扩增多态性DNA (RAPD) PCR

所有铜绿假单胞菌隔离是提交给RAPD-genotyping使用引物272 - agcgggccaa如前所述[17]。简而言之,优化PCR 2.5混合使用μMgCl L 10 x PCR缓冲,2.5毫米₂,300年μ米的核苷酸,1.7 U Taq DNA聚合酶(Cinna Gen、伊朗),和3μ在25 L基因组DNA (40 ng)μL最后的体积。以下thermocycler项目使用,(1)变性5分钟在95°C,退火5分钟在36°C,并延长5分钟在72°C, 4周期和(2)31日周期组成的94°C 1分钟,1分钟45°C,并为2分钟72°C,紧随其后的是最后一个在72°C扩展了10分钟。为了确保再现性,每个反应是重复三次。分离株之间的相似性评估未加权两组根据骰子相似系数和平均法(UPGMA),使用FreeTree和TreeView软件(18,19]。被认为是唯一可再生的乐队无论强度相似矩阵计算(20.)截止值≥80%被用于确定潜在克隆亲缘(21,22]。

3所示。结果

150测试标本,45例(30%)患者积极的文化铜绿假单胞菌。只有一个隔离每个病人又招募了研究。45岁的患者,女性30(66%)和15(34%)是男性。隔离显示对meropenem抗生素耐药性的高频率,和imipenem(100%),其次是环丙沙星,aztreonam,和头孢他啶(90%),而电阻率最低的61.6%被认为对阿米卡星。多粘菌素B阻力并没有观察到。18(40%)的imipenem-resistant MBL-positive隔离,使用IMP-EDTA磁盘测试相结合。本研究显示高RAPD类型的多样性,37个不同的RAPD类型(图1)。29株铜绿假单胞菌显示独特的模式,而其余的菌株(16)形成8个不同的集群。组1和3是由2隔离;这些隔离也MBL-positive。

4所示。讨论

住院病人,特别是那些承认ICU,主要的风险铜绿假单胞菌危及生命的感染(23]。由于事实imipenem抗性基因通常位于转座的遗传成分,连同其他抗生素抗性基因(24),imipenem-resistant分离株的出现铜绿假单胞菌在医疗环境中是一个严重的问题。

在目前的研究中,比例最高的抗性分离被认为对aztreonam meropenem、头孢他啶、环丙沙星。虽然这一发现是由其他研究进行精工省(头孢他啶92.6%)和德黑兰省(imipenem和meropenem 94.7%,头孢他啶89.4%,环丙沙星96.2%)的伊朗,抗生素耐药性率报告哈马丹省(imipenem 7.5%, meropenem 13.2%,环丙沙星4.7%)显著低于我们的抵抗频率(25- - - - - -27]。此外,我们的抗生素耐药性率明显高于报道从一些欧洲国家28- - - - - -30.]。这个高电阻率可能是由于滥用抗生素。根据独立研究,存在的风险因素,包括导管的使用,抗生素的通风机,以前的消费与抗生素耐药性较高利率(31日]。

MBL在18(40%)的45 imipenem-resistant隔离。MBL的发病率远低于其他地区的报道伊朗(德黑兰省94%,桑姜省87.8%),但明显高于报告从瑞典(1%)32- - - - - -34]。在MBL-negative隔离,可能其他机制,如OprD突变,射流泵过度,或类Dβ内酰胺酶负责耐碳青霉烯(35]。如果使用EDTA MBL抑制剂由于细菌生长的抑制作用,患病率MBL-positive隔离应与预防措施报告,因为它可能导致假阳性结果。

自从决定细菌遗传相似度对相互传染的评价至关重要,不同的基因分型方法建立了(36- - - - - -39]。尽管一些限制等困难的解释乐队在某些情况下,RAPD-PCR的优点是快速、简单,可再生的歧视性高功率(36- - - - - -39]。RAPD-PCR指纹技术收益可靠的克隆多样性评估(10,40]。我们发现遗传变异性高,37个不同的RAPD类型在45隔离多态性(82.2%)。同样,席尔瓦报道86种不同的RAPD多态性(89.6%)在96株从临床标本分离的巴西医院(41]。同意佩雷拉研究两个葡萄牙转诊医院,我们的结果并没有透露流行传播(11]。我们的研究结果表明,大多数的隔离可能来自病人自己;然而,相互传染铜绿假单胞菌患者之间可能发生,建议医院感染控制问题。

5。结论

根据我们的数据imipenem-resistant隔离的发生率铜绿假单胞菌在令人担忧的水平。我们的结果没有展示流行克隆。可能cross-acquisition发生,需要考虑未来的感染控制过程。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

研究设计是由Hamid Vaez Sharareh Moghim,纳赛尔Bahram Esfahani, Hajieh Ghasemian Safaei。资料解释和写纸由哈米德Vaez Hajieh Ghasemian Safaei。实验室程序和支持由哈米德Vaez Sharareh Moghim,纳赛尔Bahram Esfahani, Hajieh Ghasemian Safaei。

承认

本研究支持的伊斯法罕大学医学科学(批准号392063)。

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