影响酶促降解血管内皮Glycocalyx的渗透率在清醒仓鼠模型

文摘

背景。内皮的内部由glycocalyx覆盖层,和酶促降解这一层诱发血管渗漏体外。我们假设酶降解glycocalyx的在活的有机体内整个身体模型,引起血浆泄漏和微循环的影响。方法。金色的叙利亚仓鼠被分为酶(透明质酸酶)和对照组。平均动脉压(MAP)、心率(HR)、红细胞比容(Hct),基地过剩(是),得到了等离子体体积,45和120分钟后酶/生理盐水治疗。计算了等离子体体积分布的吲哚菁绿量和微循环功能毛细血管密度(FCD)。酶的效果是由测量等离子体的透明质酸(HA)水平。结果。没有地图的差异,人力资源,Hct,在两组之间。酶治疗没有诱导等离子体体积的变化但减少FCD。有50 - 100倍增加等离子体哈,但是没有HA水平之间的关系被发现和等离子体体积或FCD。结论。血管渗漏是一个没有证实在活的有机体内后,整个身体模型内皮glycocalyx的退化。微循环的影响,但没有等离子体水平的HA和FCD之间的关系。

1。介绍

增加血管通透性通常被认为在外科和重症监护病人1),等机制,是由于内皮glycocalyx的损害。的重要性,一个完整的glycocalyx层防止血管渗漏已被实验证明这一层退化在孤立心脏或血管,和在活的有机体内使用转基因小鼠倾向于动脉粥样硬化(2- - - - - -5]。在这些实验模型,不同的方法来保护glycocalyx也被评估(6,7]。高血糖、缺血、炎症与内皮glycocalyx退化(8,9]。基于这些知识,临床建议得到保护的glycocalyx在手术过程中,为了避免病理液体和蛋白质变化(10]。据我们所了解,增加血管通透性,降低等离子体体积或组织水肿后酶促降解glycocalyx尚未证明的在活的有机体内整个身体(野生型)模型。执行一项研究在我们实验室没有发现降低等离子体体积后的酶促降解glycocalyx仓鼠,而微循环的影响,证明了减少功能性毛细血管密度(FCD) [11]。透明质酸酶的影响在内皮glycocalyx没有评估,研究和等离子体体积示踪剂使用,右旋糖酐40 kDA,被批评12]。

本研究的目的是评估等离子渗漏和微循环的损伤酶降解的内皮glycocalyx清醒仓鼠模型。等离子体体积示踪,吲哚菁绿(ICG)适合重复测量,血管渗漏是依赖于时间,延长观察期。等离子体体积变化和FCD可以相关酶的影响来衡量透明质酸(HA)的总量释放进入血液循环。

2。材料和方法

2.1。动物

男性黄金叙利亚仓鼠,6 - 7周大,体重58 - 66 gr(查尔斯河实验室,波士顿,MA)被用于一个仓鼠窗口室模型。当地动物学科委员会批准的协议,并按照指南的护理和使用实验动物(国家研究委员会,1996)。仓鼠窗口室模型允许皮肤微循环的研究,注入药物和收集血液样本没有麻醉的影响(13]。室窗口和导管植入的颈动脉和颈静脉(PE50 / PE10)在两个不同的程序进行麻醉(腹腔内注射戊巴比妥钠,50毫克/公斤,雅培,雅培公园,IL)。以前描述的完整的手术技术(13]。实验进行的植入导管后48小时,没有任何麻醉药物的影响。

2.2。血流动力学参数和血液学

连续血压从颈动脉导管获得实验期间,给予平均动脉压(MAP)、心率(HR) (Biopac,圣芭芭拉分校;Spectramed压力传感器)。血红蛋白水平测定spectrophotometrically (B-Hemoglobin Hemocue,斯德哥尔摩,瑞典)和红细胞比容测定离心机使用毛细管肝素化动脉血液样本。分析PaO₂,帕₂,基地过剩,从动脉血液pH值确定,收集在肝素化毛细管(血液化学分析仪248、拜耳、诺伍德,MA)。

2.3。血浆白蛋白水平

血管渗透性也曾用transcapillary逃跑率测量放射性标记的白蛋白(14]。泄漏的增加白蛋白由于退化内皮glycocalyx可以减少血浆白蛋白的总量。血浆白蛋白水平的测定(Abaxis Inc .联盟城市Vetscan VS2, CA)之前和酶或生理盐水后45分钟,在一个单独的组仓鼠()。

2.4。吲哚菁绿量分布

协调小组已被用来作为一个方法来测量等离子体体积(15]。协调小组与毒性较低的优势,快速分布和间隙允许重复测量(16]。全血是用来确定染料的吸收。校准曲线是由两个已知浓度的染料在血液从一个仓鼠。协调小组的循环时间是基于多个样本的飞行员。通过10基线吸收了μ从动脉行L样本在每个测量。0.1毫克的协调小组,在0.1毫升无菌水稀释,静脉注射。10μL从动脉行血液被收集在3、4、5、6分钟注射后的染料和放置在一个试管100μL在每个测量之前去离子水。减少染料污染和减少失血,动脉线的长度调整,以便采取2滴血在每个样本将确保样品是取自循环,而不是从导管。另外,导管的尖端每个样本之间打扫干净了。在能谱仪分析了试管(λ20,珀金埃尔默,沃尔瑟姆,MA),吸收以800和880海里。混合的试管,定时获取样本分析同样每一次。进行monoexponential外推计算吸收在时间为零。测量包括只有。

2.5。功能性毛细血管密度(FCD)

FCD评估显微镜下毛细血管的数量与红细胞通过视野在一分钟。10视觉领域的统计和计算平均值。每个视野被确认的方式重复测量可以获得在同一位置。

2.6。等离子体的透明质酸水平

等离子体水平的透明质酸是由hyaluronan-Enzyme联Immunsorbent测定工具包(HA-ELISA)(雁行生物科学公司,盐湖城,UT)。动脉血液收集基线,45岁,60岁,120分钟后透明质酸酶,使用肝素化毛细管。使离心后,10μL获得了等离子体的微量吸液管,然后转移到一个埃普多夫管和存储在−80°C,直到分析。

2.7。实验装置和协议

14动物被分成两组,接收链霉菌属透明质酸酶(Sigma-Aldrich、圣露易丝、钼)或生理盐水。在一个单独的组动物()、透明质酸酶或生理盐水给确定对白蛋白水平的影响。当天实验,仓鼠是放置在一个抑制管室窗口的纵缝。麻醉动物是为30分钟适应新环境。基线值的映射,HR,血液学,包括等离子体的体积分布的HA水平协调小组被获得。丸100单位的透明质酸酶(0.1毫升)或类似的体积的生理盐水注入后基线测量。这是时间为零,在图中所示的时间线1。协调小组的分布容积测量45和120分钟。FCD在30和60分钟,得到的体积分布协调小组在120分钟。血流动力学参数和血液学得到在45岁,60岁,120分钟,一起为HA测量血液样本。

2.8。数据分析和统计

平均值和标准偏差值,除非,否则,所述。数据分布的协调小组,FCD给出作为基准的相对价值。值为1.0然后从基线是指零变化。在数据2 (b)和3、数据显示为箱形图。盒内的水平线代表中值。盒子的上、下限代表75和25日%百分比和上下线代表了第95届和第五%。用单向方差分析比较群体内部进行,事后分析Bonferroni多重比较的测试执行。比较两组在每个时间点进行一个未配对以及。所有统计计算使用GraphPad Prism 4.01 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。变化被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

总共20动物被用于这项研究。一种酶组(、体重g)收到Streptomyses透明质酸酶和对照组(、体重g)给予等量的生理盐水。估计是有失血0.35毫升,每个测量之间和0.6毫升的注入生理盐水的体积分布协调小组。酶促降解的影响glycocalyx的血浆白蛋白水平测试在一个单独的组动物()。

3.1。血流动力学参数和血液学

两组之间没有显著差异在三个不同的时间点。组内没有pH值的差异,阿宝₂,PCO₂。有降低趋势地图从基线到120分钟酶组和一个类似的,但在对照组显著减少。人力资源是减少在对照组60至120分钟。Hct从基线值显著降低到120分钟两组。数据如表所示1。

3.2。透明质酸酶/生理盐水后的白蛋白水平

在单独的一组仓鼠(),没有差别的血浆白蛋白水平在45分钟前和组酶治疗(通用汽车/ dL和通用汽车/ dL)或动物接收盐水。

3.3。吲哚菁绿量分布

没有发现组间差异的基线值。酶或生理盐水治疗后45分钟,没有发现分布体积变化(相对基线值与)。120分钟后,有一个趋势减少协调小组分布体积酶组,但两组之间没有显著差异(相对基线值与。数据显示为绝对值和相对值基线在图2。

3.4。功能性毛细血管密度

FCD酶组显著低于对照组的30 - 45分钟。有无足轻重的趋势(在120分钟)。数据相对于基线值,如图所示3。

3.5。等离子体水平的哈

有50 - 100倍增加HA透明质酸酶治疗后的水平。等离子体水平的哈图所示4。

3.6。透明质酸和体积分布协调小组之间的关系

没有明显关系等离子体体积和FCD 45和120分钟(数字5(一个)和5 (b))作为回归的置信区间线路没有显著不同于零。

3.7。等离子体水平的HA和分布之间的关系协调小组和FCD

没有显著水平的HA和体积的分布之间的关系协调小组在45和120分钟(数字6(一)和6 (b)与FCD)或(数字6 (c)和6 (d))。所有回归的置信区间线路没有显著不同于零。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,酶促降解内皮glycocalyx的在活的有机体内,全身模型,没有诱导等离子体泄漏或白蛋白。微循环的影响,证明了FCD的显著减少。然而,没有明显的HA释放到循环量之间的关系和体积分布协调小组或FCD。

增加血管通透性的临床后果组织水肿和血容量减少,降低组织的氧化和器官功能障碍。因此,增加血管通透性代表了一个重要的临床挑战。增加注意力都给了内皮glycocalyx及其在调节血管通透性作用[17]。先前的研究已经完成了各种实验的设置,从培养细胞,体外孤立的器官或船只,转基因动物,主要集中在蛋白质和示踪剂的渗透性在glycocalyx层。冲突的结果glycocalyx厚度在体外和体外研究还表明,这种结构的完整性取决于实验条件(18]。令人惊讶的是,很少有研究涉及的临床后果增加血管通透性,如等离子渗漏和组织水肿。尽管如此,实验研究已被用作临床证据建议液体疗法(10,19]。有趣的是,这两个评论的作者画不同的结论基于相同的实验文献关于胶体的使用。

酶促降解这一事实没有影响协调小组是由实验室的体积分布和血流动力学数据。没有差别的血压、心率、Hct或酶组和对照组之间的指示增加透明质酸酶治疗后血管渗漏。

按照先前的研究我们发现在我们的实验室,使用相同的动物模型,但由于不同的等离子体体积示踪,右旋糖酐40 kDA [11]。这两个研究是与血管渗漏导致心肌水肿体外(4)或降低等离子体体积和蛋白尿的透明质酸酶治疗4周后载脂蛋白E-deficient老鼠(5]。透明质酸酶治疗的强度孤立心脏或治疗的持续时间的转基因血管壁可以解释这些相互矛盾的结果。

我们发现FCD酶治疗后减少。FCD是最重要的一个指标,组织灌注和已被证明预测冲击后生存在临床和动物实验(20.- - - - - -22]。减少循环等离子体的体积是许多因素会影响FCD之一。然而,在我们的研究中,没有关系FCD和分布的协调小组(图5)。以前,几个机制之间的关系FCD和退化的内皮glycocalyx已经提出。损伤的转导与血管收缩有关,主要是由于损失的透明质酸内皮glycocalyx [23)是最可能的机制的研究Zuurbier et al。24]。然而,当microcirculatory血管直径和流量测量之前和之后的透明质酸酶治疗,这是不确认11]。在一项由Luquita et al。25),增加红细胞刚性水平升高的血浆公顷。尽管没有明确FCD和HA水平之间的关系在当前的研究中,HA的含量是所有动物50 - 100倍。高浓度的HA也与增加粘度(11]。因此,HA水平上升可能导致减少FCD看到在我们的研究中。

从glycocalyx检测组件,如syndecan、硫酸乙酰肝素,和哈,曾被用作酶促降解[证据9,26]。通过测量HA在动物分布的协调小组和FCD,我们评估这些参数之间的关系。协调小组的分配卷45分钟后两组相似,但更大的变化在酶组与生理盐水组相比。标准差是近两倍。这种模式也在FCD,虽然不清楚。FCD大变化,小动脉和小静脉的直径,和速度,也看到了在先前的研究11]。见图6,没有协调小组的体积分布之间的关系,或者FCD和HA水平。因此,变化在这两项研究发现不能用不同的透明质酸酶反应来解释哈。

还有其他几个因素可以影响我们的观察。内皮glycocalyx受到广泛的刺激。两步手术,植入窗口的室一天,然后导管前两天实验可以诱发术后反应损害整个内皮glycocalyx两组,从而减少酶治疗后的区别。

HA在我们研究的许多基线值很高,但合理的基于仓鼠年轻年龄和术后减少食物摄入量。手术后仓鼠通常滴3 - 5克(27]。手术和术后改变也可以贡献。等离子体的增加水平的透明质酸酶治疗后是实质性的。即使别人发现脱落后大幅增加glycocalyx组件(9),有可能增加循环公顷可能来自其他来源的内皮glycocalyx (28]。大多数存在于细胞外基质,和透明质酸酶分子的大小将允许渗透毛细管壁。因此,很有可能大量的HA发现可能是细胞外基质的产物。高血浆水平的HA 2小时后酶丸可能反映没有reincorporation HA glycocalyx,和等离子体水平超过肝脏代谢的能力哈(29日,30.]。

透明质酸酶只glycocalyx降解的部分,其余的结构可以防止等离子渗漏的能力。慢慢的内皮glycocalyx再生(31日),和等离子体和蛋白质泄漏与时间有关,本研究的时间,虽然时间比前一研究[11),可能是太短。因此,延长的时间框架,结合几种酶(32),包括额外的实验方法检测泄漏等协调小组进入血管周的空间使用活体荧光显微镜,可以是一个证明血管渗漏的方法在活的有机体内在未来,全身模型。

5。结论

酶促降解透明质酸酶不诱导的内皮glycocalyx等离子渗漏在清醒仓鼠两个小时的时间,但降低了FCD。没有等离子体体积的变化之间的关系或FCD的HA释放到循环酶治疗后被发现。

总结报表

酶促降解的内皮glycocalyx透明质酸酶不降低等离子体体积的清醒仓鼠模型。

利益冲突

没有任何作者的利益冲突。部分在美国麻醉医师学会2010年年会,圣地亚哥,CA。

资金

这项研究是由国家卫生研究院HLBI R01基金062354年HL064395 Helsesorost,挪威。

确认

作者感谢Froilan p . Barra和辛西娅·皮尔泽手术准备的动物,和Manoj a Jivani ELISA分析。

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