mir - 142 - 5 - p作为CXCR4-Targeted微变弱SDF-1-Induced软骨细胞凋亡和软骨退化通过灭活MAPK信号通路

文摘

骨关节炎(OA)是一种慢性关节功能障碍的特点减少软骨细胞和细胞外基质(ECM)成分的破坏。小分子核糖核酸(microrna)和SDF-1 / CXCR4轴软骨细胞凋亡和ECM退化的重要因素。然而,很少有研究调查microrna和SDF-1 / CXCR4轴之间的关系到目前为止在骨关节炎。通过microrna芯片和生物信息学分析,我们发现mir - 142 - 5 - p CXCR4-targeted和大幅下调microrna在软骨OA患者,以及SDF-1-induced OA软骨细胞在体外。SDF-1-treated主要人类OA软骨细胞,转染mir - 142 - 5 - p模仿或抑制剂,趋化因子受体CXCR4的表达被发现反向相关的表达mir - 142 - 5 - p。双荧光素酶报告实验进一步验证了目标之间的关系mir - 142 - 5 - p和趋化因子受体CXCR4。超表达mir - 142 - 5 - p缓解OA病理学通过抑制软骨细胞凋亡,即使在趋化因子受体CXCR4中也是OA软骨细胞。这是与减少软骨基质降解,减少软骨炎症,和灭活MAPK信号通路。我们的研究表明,调节CXCR4-targeted mir - 142 - 5 - p的表达可以抑制细胞凋亡、炎症、矩阵分解代谢和灭活在OA软骨细胞MAPK信号通路。我们的工作提供了重要的见解针对mir - 142 - 5 - p和SDF-1 / CXCR4轴OA疗法。

1。介绍

骨关节炎(OA)是最常见的关节功能障碍,主要症状包括严重疼痛和关节僵硬,也在全球老年人残疾的主要原因(1]。OA的病理变化表现为滑膜炎症,减少软骨细胞和细胞外基质(ECM)组件破坏(2]。尽管如此,OA的有效治疗方法是限制抗炎药物,物理治疗主要症状缓解,为后期阶段OA患者膝关节置换手术(3,4因为有限的OA发病机制的理解。

越来越多的证据表明,SDF-1 / CXCR4(基质细胞衍生因子- 1 /科学家主题趋化因子受体类型4)通路在关节软骨OA发展密切相关5]。趋化因子受体CXCR4是一个G protein-coupled受体,参与导航和趋化性造血和免疫系统,和趋化因子受体CXCR4的配体是SDF-1(也叫CXCL12),这是与干细胞迁移(6]。趋化因子受体CXCR4在几种疾病中发挥作用,包括人类免疫缺陷病毒(HIV)感染,癌症、免疫缺陷、肺动脉高血压(PAH),肌萎缩性脊髓侧索硬化症,肺损伤(7]。最近,积累的研究也表明,趋化因子受体CXCR4在OA发病机制中扮演重要角色。例如,趋化因子受体CXCR4表达被调节的滑膜组织(OA患者的生物信息学分析8]。此外,早期的研究表明,显著增加SDF-1水平被发现在从OA和类风湿性关节炎患者滑液9]。许等人证明了SDF-1水平与OA的射线严重性(10]。王等人表示,Celastrol减毒治疗关节疼痛和OA软骨损伤的老鼠的抑制SDF-1 / CXCR4途径[11]。此外,SDF-1-induced软骨退化和矩阵Metalloprotease-3 (MMP-3)和MMP-9表达式可以被管理的减毒趋化因子受体CXCR4拮抗剂如TN14003和AMD3100在活的有机体内(12,13]。

值得注意的是,SDF-1 / CXCR4信号轴已经瓦解能够抑制aggrecan表达和减轻创伤后骨关节炎大鼠软骨退化,这在很大程度上是依赖于像NF -典型的下游通路的激活κ核因子B (kappa-light-chain-enhancer激活B细胞)和MAPKs增殖蛋白激酶通路。因此,靶向抑制SDF-1 / CXCR4轴可以减弱发生和发展办公自动化的一个重要战略。

小分子核糖核酸很小,单股的非编码rna(约17-24核苷酸长度),起着关键的作用在调节基因表达在转录后的级别通过绑定3′未翻译区(3′UTR)目标mrna通过种子序列,这常常会减少目标基因的表达(14]。小分子核糖核酸的各种重要的生物学过程起着至关重要的作用,和他们的异常表达与多种人类疾病有关,包括办公自动化(15]。例如,mir - 204引发的异位表达自发软骨损失和办公自动化的发展,而mir - 204抑制导致前列腺素合成和抑制炎症伴随的复苏senescence-associated分泌表型(SASP)因素在实验OA (16]。它已经表明,针对IGF1 miR-15b调节软骨细胞增殖和细胞凋亡,IGF1R, BCL2患者髁突增生(17微- 203)和可拆卸的减轻LPS-induced伤针对mcl1 C28 / I2软骨细胞(18]。最近在体外研究表明,mir - 449 a抑制促进软骨再生,防止骨关节炎的进展19]。自从SDF-1 / CXCR4轴中起关键作用的损伤和修复软骨,探索参与调节的microrna SDF-1 / CXCR4轴的功能可能是非常有用的理解深入OA的发病机理。然而,很少有研究调查microrna和SDF-1 / CXCR4轴之间的关系到目前为止在骨关节炎。

在目前的研究中,我们旨在探索某些microrna与OA软骨组织中的异常表达是否也可以目标趋化因子受体CXCR4和算出的有益作用的潜在机制microrna在OA发病机理。由于先前的研究已经表明,软骨细胞功能失调在关节软骨OA发展通常被认为是不可或缺的20.),我们测试的影响的过度CXCR4-targeted microrna mir - 142 - 5 - p在体外培养SDF-1-induced OA软骨细胞和调查潜在的分子机制在衰减软骨细胞凋亡和退化。

2。材料和方法

2.1。临床标本

关节软骨标本收集从4女OA患者(62.1±6.8岁),全膝关节置换术收到。这些患者被诊断为OA根据美国风湿病学院标准(21]。正常软骨组织收获从3创伤患者(2女性和1男,27.4±5.4岁,没有办公或RA历史),接受了截肢。所有的手术都是在昆明医科大学第一附属医院2017年至2018年之间。从每个参与者获得书面知情同意,所有的程序都是经伦理委员会批准在昆明医科大学第一附属医院(中国昆明)。

2.2。RNA提取和微阵列分析

从软骨中提取总RNA样本OA患者和健康人使用试剂盒RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国;猫。74106号)根据制造商的指示。RNA产量和纯度测定使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(Nanogen Inc .)、圣地亚哥、钙、美国)和一个安捷伦2100 Bioanalyser(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。microrna是隔绝总RNA使用microrna的隔离设备(Macherey-Nagel、Dü任、德国),根据制造商的协议。microrna的表达谱和mrna决定使用一个miProfile™人类炎症microrna qPCR数组(GC08017K18014P;GeneCopoeia公司,美国马里兰州罗克维尔市)根据制造商的指示。每一个基因的表达水平在骨关节炎组与对照组相比,2^−ΔΔCt方法被用来计算相对microrna的表达。筛选差异表达microrna的阈值设置为> 2.0和褶皱变化值< 0.05。

2.3。CXCR4-Targeted microrna的预测和生物信息学分析

使用以下数据库:人类CXCR4-targeted microrna预测TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/),miRDB (http://mirdb.org/index.html),miRWalk (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de),miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)和RNAhybrid (https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)。候选人microrna是使用“趋化因子受体CXCR4”作为关键字查询。所有TargetScan的预测结果,miRDB miRWalk, miRTarBase选择在当前的研究中。的值计算了单边确切概率法和纠正错误发现率(罗斯福)。一个值< 0.05和罗斯福< 0.05被认为是具有统计学意义。

2.4。软骨细胞隔离和文化

所有OA关节软骨样本是从胫骨高原或股骨髁,而主要软骨细胞分离(如前所述12]。软骨细胞在DMEM维护(Gibco;热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,妈,含5%胎牛血清(美国)的边后卫;Gibco;热费希尔科学、penicillin-streptomycin Inc .)和1%(二性霉素b;Gibco;热费希尔科学,Inc .)。在培养期间,软骨细胞被孵化的气氛在37°C公司为5%₂每2天,媒介改变了。

2.5。逆转录和定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

的微环境模拟膝关节OA患者和健康的个体,主要软骨细胞分为以下两组:对照组和SDF-1治疗组。软骨细胞是治疗100 ng / ml SDF-1(美国新泽西PeproTech,落基山)为24小时。总RNA分离试剂盒(表达载体;热费希尔科学,Inc .)。MicroRNA的提取后,进行逆转录TaqMan微rna逆转录工具包(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。RNA数量和质量NanoDrop nd - 1000分光光度计测定(美国Nanogen Inc .)。RNA被RevertAid reverse-transcribed成cDNA合成第一链cDNA工具包(K1622, Tiangen生物科技、北京、中国)和miRcute + microrna的合成第一链cDNA工具包(KR211-02, Tiangen生物科技、北京、中国)根据制造商的协议。使用以下循环条件:45变性的周期在94°C 20年代和放大60°C 34 s。所有反应进行了一式三份和规范化使用microrna的看家基因U6或mRNA管家GAPDH基因。使用2计算相关基因的表达^−ΔΔCt方法(22]。以下引物被使用:mir - 150 - 5 - p,意义上,5′-TCGGCGTCTCCCAACCCTTGTAC-3′,反义,5′-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAGGT-3′;mir - 142 - 5 - p,意义上,5′-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3′,反义,5′-UAGUGCUUUCUACUUUAUGUU-3′;mir - 622感觉5′写明atcc CAGGGAGACAGAGATCGAGG-3′,反义,5′-AAGCTTGGTGGTGGACTT TTGGTTGT-3′;mir - 513 - 5 - p, 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGT CGGC-3′,反义,5′-AATTGCACTGGATACGACATGACA-3′;U6,意义上,5′- t GCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′,反义,5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGG条t - 3′;伯灵顿感5′-AAGAAGCTGAGCGAGTGT-3′,反义,5′-GGCGGCA ATCATCCTCTG-3′;矩阵metalloproteinase-13 (MMP-13)向前5′-GTGGTGATGAAGATG ATT-3′,相反,5′-TTGTAGGATGGTAGTATGA-3′;Bcl2向前5′-TGCC TTTGTGGA ACTGTA-3′,相反,5′-GAGCAGAG TCTTCAGAGA-3′;GAPDH向前5′-AAAGGGTCATCATCTCTG-3′,相反,5′-GCTGTTGTCATACTTC TC-3′。

2.6。免疫细胞化学

中被删除后,软骨细胞与显示处理洗3次磷酸盐(PBS)。与正常山羊血清细胞被封锁(ZsBio zli——9021年,中国北京)在室温下60分钟。样本孵化与主anti-CXCR4抗体(ab124824 Abcam,妈,美国;1:300稀释)一夜之间在4°C。之后,标本处理顺序与二次抗体(pv - 9000 anti-rabbit抗体,ZsBio、北京、中国)30分钟的37°C。与PBS洗3次后,幻灯片是在轻拍(3、3′-Diaminobenzidine)发色体(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 5分钟。然后用苏木精复染色标本的标本(美国阿拉丁,卡尔斯巴德,CA) 2分钟。彩色图像的软骨细胞采集标本用显微镜(奥林巴斯BX53;日本东京新宿)。

2.7。细胞转染

软骨细胞培养在6量板的密度1×10⁵细胞每口井。当细胞融合达到大约60%,软骨细胞转染表示microrna的模仿,microrna的抑制剂,或哺乳动物表达质粒使用Lipofectamine 3000(英杰公司)根据制造商的指示。细胞被分成以下组:控制(未经处理的细胞),mir - 142 - 5 - p模仿,miR-NC(负控制microrna), mir - 142 - 5 - p抑制剂,抑制数控(负控制抑制剂)。在一些实验中,细胞转染和microrna一起模仿CXCR4-expressing哺乳动物表达载体或控制规定。在转染后24小时内,细胞培养与重组中补充SDF-1 (100 ng / ml;PeproTech,落基山,美国新泽西)另一个24小时。化学合成的序列都是购自RiboBio有限公司有限公司(广州)。

2.8。细胞凋亡检测

SDF-1-treated软骨细胞的凋亡率分析了Annexin-V / FITC凋亡检测设备(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)根据制造商的指示。细胞凋亡检测用流式细胞分析仪(CyFlow®空间;Partec GmbH,德国)。数据分析与FloMax®软件(德国Partec GmbH)。

2.9。免疫印迹分析

软骨细胞显示治疗后收获,总蛋白提取细胞溶解产物。蛋白质样品的数量在每一个标本是由BCA试剂盒(Beyotime生物科技、南京、中国)根据制造商的指示。蛋白质样品被sds - page分离(钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳)60 V 25分钟,然后90 V 3 h。蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔,Billerica的)传输电压120 V 50分钟。膜被封锁的5%牛血清白蛋白(BSA)在室温下1 h,然后是孵化主要抗体,包括anti-collagen II(马剑桥Abcam 1: 1000年,美国ab34712), anti-aggrecan (Abcam 1: 1000年,美国ab36861), anti-bax (Abcam 1: 2000年,美国ab32503), anti-Bcl-2 (Abcam 1: 1000年,美国ab32124), anti-cleaved caspase-3 (Abcam 1: 2000年,美国ab2302), anti-cleaved PARP1 (Abcam 1: 1000年,美国ab32064), anti-P65 (Abcam 1: 1000年,美国ab16502), anti-p-P65 (Abcam 1: 2000年,美国ab86299), anti-IKBα美国(1:1000年,Abcam ab32518), anti-p-IKBαAbcam(1: 10000年,美国ab133462), anti-MMP-13 (Abcam 1: 1000年,美国ab39012), anti-CXCR4 (Abcam 1: 100年,美国ab16502), anti-p-ERK(1: 1000年,细胞信号技术(CST),丹弗斯,妈,美国、4370 t), anti-ERK (CST 1: 1000年,美国、4695 t), anti-p-JNK (Abcam 1: 5000年,美国ab76572) anti-JNK (Abcam 1: 2000年,美国ab208035), anti-p-p38 (CST 1: 1000年,美国、4511 t), anti-P38 (CST 1: 1000年,美国、8690 t),和anti-GAPDH (Abmart 1: 2000年,伯克利的高度,新泽西,美国P30008)。所有主要的抗体稀释0.5% TBST (Tris-buffered生理盐水、0.5%渐变20)缓冲区和孵化一夜之间在4°C。膜的清洗和孵化与辣根过氧化物酶- 1 h在室温下(合)与anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(CST 1: 2000年,美国,7074)在室温下1 h。蛋白质乐队被增强化学发光(ECL)可视化工具包(美国Billerica的微孔,MA)和带强度是决定Bio-Rad图像实验室5.0系统。所有结果都至少重复三次。

2.10。酶联免疫吸附试验(ELISA)

显示治疗后,文化上层清液收集从24-well盘子和il - 1的浓度β、il - 10和TNF -α分别是衡量使用人类白介素酶联免疫试剂盒(ab46052;美国Abcam),人类il - 10酶联免疫试剂盒(ab46034;美国Abcam),和人类肿瘤坏死因子-α酶联免疫试剂盒(ab181421;美国Abcam)根据制造商的指示。

2.11。免疫荧光染色

免疫荧光染色法进行评估的表达在软骨细胞胶原蛋白II和aggrecan指定治疗。在PBS样本冲洗三次使用4%多聚甲醛固定,这是其次是渗透使用0.2% tritonx - 100在PBS稀释了20分钟。然后,5%的细胞被封锁山羊血清白蛋白在室温下60分钟。与PBS冲洗后,样本孵化与初级抗体胶原蛋白II(1: 300)或aggrecan一夜之间(1:400)在4°C。然后,盘子在PBST冲洗5次(PBS 0.5%渐变20)和孵化DyLight®488 -标记二次抗体(1:1000;美国KPL、达拉斯、TX) 2 h在37°C。样本与DAPI复染色(4′,6-diamidino-2-phenylindole;热费希尔科学)在室温下5分钟。最后,是奥林巴斯显微镜拍摄的图像(奥林巴斯公司(日本东京)。

2.12。双荧光素酶报告基因分析

片段对应于野生型(WT)或突变体(傻瓜)趋化因子受体CXCR4 3ʹutr包含潜在的结合位点mir - 142 - 5 - p是插入一个记者向量Dual-Luciferase记者试验系统的工具包(WI Promega E1910,麦迪逊,美国)。软骨细胞被播种在96 -孔板和cotransfected记者质粒和mir - 142 - 5 - p模仿或消极的控制(NC) microrna使用Lipofectamine 2000(表达载体,11668)。荧光素酶活性测定通过Dual-Luciferase记者分析系统(Promega)后48 h。萤火虫和Renilla荧光素酶活动的比例计算。mir - 142 - 5 p模仿,NC-miRNA,和DNA片段的趋化因子受体CXCR4 3ʹ-UTR-WT和趋化因子受体CXCR4 3ʹ-UTR-MUT买来Ruibo生物技术有限公司有限公司(广州)。

2.13。统计分析

数据分析使用SPSS 17.0统计软件(美国、IBM、纽约Armonk)。结果给出了意味着±标准差(SD)或±均值的标准误差(SEM)指定。分析两组是通过使用一个学生的t以及。从多个组的统计显著性差异是使用方差分析计算(方差分析)。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。microrna的芯片和生物信息学分析发现,mir - 142 - 5 - p表达式表达下调的软骨细胞OA患者和SDF-1-Treated软骨细胞

探索的潜在角色microrna在OA发病机理,我们进行了关节软骨的microrna的微阵列分析OA患者和健康人(n为每个组= 4)并试图找出microrna与异常的表情。我们的数据表明,70年microrna已经显著改变表达水平在OA患者与健康对照组相比,这些microrna包括53个显著下调microrna(图1(一))和17显然调节microrna(图1 (b)在OA软骨组织(FC)≥2,值< 0.05)。为了识别潜在的目标趋化因子受体CXCR4 microrna,前15名调节和前15名表达下调microrna在70个microrna表达异常的被选为进一步预测四个数据库(TargetScan人类7.2,米兰达,miRTarBase RNAhybrid)。这导致了四个假定的CXCR4-targeted microrna: mir - 150 - 5 - p, mir - 142 - 5 - p, mir - 513 - 5 - p和mir - 622。

由于以前的研究已经表明的内容SDF-1 OA患者的关节液比正常人要高得多(9和趋化因子受体CXCR4的表达,SDF-1的受体,在OA软骨细胞显著调节SDF-1 (11),与我们的免疫化学染色数据(数据一致1 (c)和1 (d)SDF-1),我们用于治疗OA软骨细胞模拟OA软骨细胞体内的长期环境并检查是否上述候选小分子核糖核酸的表达在OA软骨细胞受到SDF-1治疗。如图1 (e),mir - 150 - 5 - p的表达和mir - 513 - 5 - p表达式之间没有显著不同的控制和SDF-1治疗组(和 ,分别)。与此同时,mir - 142 - 5 - p ( )和mir - 622 ( )表达下调在SDF-1治疗,mir - 142 - 5 - p显示更多的减少。这些结果表明,mir - 142 - 5 - p的表达明显减少SDF-1的刺激下,这减少了mir - 142 - 5 - p的抑制作用在靶蛋白趋化因子受体CXCR4的表达。

3.2。趋化因子受体CXCR4的直接目标mir - 142 - 5 - p和负受mir - 142 - 5 - p在关节软骨软骨细胞

为了证实mir - 142 - 5 - p的绑定到目标趋化因子受体CXCR4,荧光素酶的记者化验与野生类型或应承担的变异版本3ʹutr CXCR4的存在与否进行mir - 142 - 5 - p超表达(图2(一个))。结果表明,mir - 142 - 5 - p模仿显著抑制向量的相对荧光素酶活性与野生型趋化因子受体CXCR4 3′UTR绑定网站( ),而绑定序列的突变阻止mir - 142 - 5 - p的绑定和超表达消极的控制模拟导致荧光素酶活性(图基本未变2(一个))。这些结果支持这样的观点:mir - 142 - 5 - p可以直接绑定到3′UTR CXCR4负调节趋化因子受体CXCR4的表达。

此外,我们与负控制模拟转染OA软骨细胞,mir - 142 - 5 - p模仿,负控制抑制剂,mir - 142 - 5 - p抑制剂操纵的表达水平mir - 142 - 5 - p(图2 (b))。我们证实,mir - 142 - 5 - p过度表达下调趋化因子受体CXCR4表达( ),在趋化因子受体CXCR4 mRNA水平显著调节mir - 142 - 5 - p抑制剂治疗( )(图2 (c))。免疫印迹显示一致的结果与实时PCR检测:趋化因子受体CXCR4蛋白表达是调节mir - 142 - 5 - p模仿组,而mir - 142 - 5 - p抑制剂组相比降低了趋化因子受体CXCR4表达控制( )(数据2 (d)和2 (e))。

3.3。mir - 142 - 5 - p下调SDF-1-Induced软骨细胞趋化因子受体CXCR4表达和减毒软骨细胞凋亡

软骨细胞凋亡是OA发病的主要病理改变之一(23]。评估mir - 142 - 5 - p是否影响SDF-induced调节软骨细胞凋亡,我们进行了流式细胞术分析使用Annexin-V和π染色。OA软骨细胞转染有负控制microrna的模仿,mir - 142 - 5 - p模仿,或一起microrna的模仿CXCR4-expressing质粒和治疗100 ng / ml SDF-1额外的24小时在转染后24小时。与控制模拟和控制向量组相比,mir - 142 - 5 - p模仿降低细胞凋亡率,同时CXCR4超表达的细胞凋亡率增加( )。然而,趋化因子受体CXCR4的负面影响软骨细胞凋亡是削弱了mir - 142 - 5 - p超表达( ),与该集团同时mir - 142 - 5 - p和趋化因子受体CXCR4表达细胞凋亡率明显低于单一超表达趋化因子受体CXCR4集团(数字3(一个)和3 (b))。此外,我们分析了apoptosis-related蛋白质的表达包括伯灵顿,bcl - 2, caspase-3裂解,裂解PARP。如数据所示3 (c)- - - - - -3 (e),upregulation mir - 142 - 5 - p抑制mRNA和蛋白表达的伯灵顿和bcl - 2表达增强SDF-1-treated软骨细胞( )。相比之下,趋化因子受体CXCR4过度增加了伯灵顿的表情,caspase-3裂解,裂解PARP和bcl - 2表达下降( )。此外,趋化因子受体CXCR4的积极影响细胞凋亡被缓解mir - 142 - 5 - p超表达( )。这些数据表明,mir - 142 - 5 - p过度抑制细胞凋亡抑制趋化因子受体CXCR4在SDF-1-treated软骨细胞。

3.4。mir - 142 - 5 - p中和SDF-1-Induced软骨细胞炎症和矩阵退化

为了更好地理解的角色mir - 142 - 5 - p在OA的发病机制,炎症生物标记和软骨退化,包括il - 1βil - 10, TNF -α,aggrecan MMP-13和胶原蛋白II (24测量),在这项研究中。mir - 142 - 5 - p过度导致显著降低il - 1的含量β(图4(一))和肿瘤坏死因子-α(图4 (c))和il - 10的水平增加(图4 (b)),而控制软骨细胞治疗SDF-1 ( )。然而,超表达的趋化因子受体CXCR4明显增加释放il - 1β(图4(一))和肿瘤坏死因子-α(图4 (c))和减少释放il - 10(图4 (b)减毒的),mir - 142 - 5 - p超表达。

此外,mir - 142 - 5 - p超表达显著减少MMP-13的表达,就是明证qPCR化验(图4 (d))和免疫印迹分析(数据4 (e)和4 (f))。也明显增加胶原蛋白的表达II和aggrecan,陶醉的免疫荧光染色(数字4 (g)和4 (h))和免疫印迹分析(数据4(我)- - - - - -4 (k))。相比之下,趋化因子受体CXCR4超表达显著调节MMP-13水平和表达下调胶原蛋白II和aggrecan的水平。值得注意的是,趋化因子受体CXCR4表达降低的负面影响SDF-induced软骨细胞被同时upregulation逆转mir - 142 - 5 - p,和没有显著差异的趋化因子受体CXCR4 / mir - 142 - 5 - p co-overexpression组和对照组观察。综上所述,这些研究结果证实,mir - 142 - 5 - p可以减少炎症,减少ECM组件(胶原蛋白II和aggrecan)损失减轻SDF-1-exposed软骨细胞的退化。

3.5。软骨损伤的减少mir - 142 - 5 - p SDF-1-Induced软骨细胞与抑制MAPK信号通路有关

探索额外见解趋化因子受体CXCR4超表达介导的机制相反的负面影响,mir - 142 - 5 - p,我们也调查了mir - 142 - 5 - p的影响MAPK途径,这是一个典型的通路下游SDF-1 / CXCR4信号(25]。进一步验证监管关系mir - 142 - 5 - p和MAPK通路,我们测量的水平- 38,p-P38 MAPK、ERK, p-ERK,物,p-JNK SDF-1-induced软骨细胞与操纵的表情mir - 142 - 5 - p和趋化因子受体CXCR4。免疫印迹结果(图所示5(一个)),mir - 142 - 5 - p的超表达明显减少的比率p-P-38 MAPK / p - 38 MAPK(图5 (c)),p-ERK / ERK(图5 (d)),和p-JNK /物(图5 (e)),而超表达的趋化因子受体CXCR4有相反的影响。再一次,同时过度mir - 142 - 5 - p逆转趋化因子受体CXCR4单一超表达这一途径的影响。总的来说,这些数据证实,mir - 142 - 5 - p的过度抑制MAPK通路的激活,这是与能力相关mir - 142 - 5 - p的表达下调趋化因子受体CXCR4表达。

4所示。讨论

最近,一些异常的microrna表达发挥重要作用在OA发病机制已经收到了越来越多的关注(14,15]。在目前的研究中,我们表明,mir - 142 - 5 - p明显表达下调与OA软骨组织的病人,以及SDF-1-treated软骨细胞在体外。通过microrna的模仿transfection-mediated OA软骨细胞中过度表达,我们发现mir - 142 - 5 - p目标趋化因子受体CXCR4和办公自动化(OA)过程中起着至关重要的作用,其中包括增加II型胶原蛋白的表达和aggrecan,减少细胞凋亡,减少炎症因子释放。此外,我们的结果表明,调节mir - 142 - 5 - p表达有效地阻止MAPK信号通路是由SDF-1 / OA软骨细胞趋化因子受体CXCR4轴。

据报道,SDF-1表达OA患者的血浆和滑液与射线严重的骨关节炎(10]。因此,SDF-1水平可以作为一种有效的生物标志物对OA的严重程度(26的软骨组织,软骨细胞OA患者可能会经常暴露于高水平的SDF-1。因此,为了模拟膝关节的骨关节炎的环境,我们把孤立的软骨细胞与100 ng / ml SDF-1每组(27]。的受体SDF-1 [7),趋化因子受体CXCR4已被证明是一个关键的因素密切参与OA的发病机制(25,27,28]。绑定的SDF-1趋化因子受体CXCR4诱发OA软骨变性(28),它还坐标之间的串扰软骨下骨和关节软骨在OA发病机理29日]。此外,阻塞SDF-1 / CXCR4信号轴报道能够抑制在骨关节炎软骨变性趋化因子受体CXCR4拮抗剂(13,25,30.,31日]。在最近的研究中,mir - 142 - 5 - p是筛选通过生物信息学预测大幅下调microrna在软骨OA患者相比健康的软骨,以及实验验证CXCR4-targeted下调microrna与SDF-1软骨细胞的诱导。类似于我们的结果,最近的一份报告从贾等人也发现mir - 146 - 5 - p作为CXCR4-targeted microrna,及其在OA软骨细胞是调节表达的趋化因子受体CXCR4拮抗剂TN14003 [12]。作为趋化因子受体CXCR4 / SDF-1轴抑制剂,mir - 146 - 5 - p也明显变弱SDF-1-induced软骨退化在过度OA软骨细胞(12]。总的来说,我们和其他人的结果突出一些赏识microrna的关键作用在调节通过调节趋化因子受体CXCR4 / OA发病机理SDF-1轴。

先前的研究显示之间的联系趋化因子受体CXCR4表达和受损的矩阵分解代谢增加,升高滑膜炎症,和进步在OA软骨细胞数量减少发展(8,11]。符合这个概念,趋化因子受体CXCR4抑制可以导致OA-associated软骨变性(衰减12,30.,31日]。我们发现mir - 142 - 5 - p作为趋化因子受体CXCR4抑制剂和软骨细胞凋亡的调节。我们目前的研究表明,upregulation mir - 142 - 5 - p导致明显减少OA软骨细胞凋亡率随着伯灵顿的重要表达水平的变化,bcl - 2, caspase-3裂解,和一些炎症反应的因素包括il - 10、il - 1β和肿瘤坏死因子-α。据报道,mir - 142 - 5 - p充当主调节器的破骨细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡32,33]。在胰腺癌细胞,mir - 142 - 5 - p被发现目标Ras-related蛋白质Rap-1A (RAP1A)下调p-ERK1/2和磷酸盐p38增殖蛋白激酶(p-p38)和控制细胞增殖和细胞凋亡33]。因此,mir - 142 - 5 - p可以施加antiapoptosis函数通过针对趋化因子受体CXCR4以外的其他分子。我们还发现,ECM组件的蛋白质含量(胶原蛋白II和aggrecan)明显增加后mir - 142 - 5 - p的过度表达,甚至条件下的趋化因子受体CXCR4 coexpression。这些结果表明,miR-42-5p减轻软骨细胞凋亡、炎症因子释放,甚至ECM沉积在软骨细胞活跃SDF-1 / CXCR4信号,为临床实践提供理论基础的治疗OA患者与外部mir - 142 - 5 - p。另一方面,由于mir - 142 - 5 - p是参与等途径调节FoxO1 / PI3k / Akt通路通过针对PTEN在骨骨髓来源的巨噬细胞32),需要更多的调查,揭示了全机制的有益影响mir - 142 - 5 - p在OA软骨细胞,这可能不是局限于针对趋化因子受体CXCR4。

我们的研究结果也支持OA开发和激活MAPK信号之间的联系,这两个主要营运风险因素。MAPKs,包括物、ERK和p38,炎症过程中起着至关重要的作用,建议广泛参与调节OA (34,35]。例如,趋化因子受体CXCR4击倒可以抑制SDF-1-induced人类脐静脉血管生成细胞,这是MAPK / ERK的差别取决于对这些PI3K / AKT, Wnt /β连环蛋白通路(36]。MAPK一直被认为是有吸引力的目标药物介导的炎症过程的调制OA (37]。我们的结果表明,趋化因子受体CXCR4激活MAPK信号传导的过度表达,而upregulation mir - 142 - 5 - p明显减少趋化因子受体CXCR4的表达和灭活MAPK信号通路。MAPK信号通路以来涉及细胞凋亡调节(38,39),这些发现进一步巩固的antiapoptosis功能mir - 142 - 5 - p在OA软骨细胞。

5。结论

总之,通过microrna的芯片和生物信息学分析,我们发现mir - 142 - 5 - p作为显著下调microrna在人类OA软骨组织,也是CXCR4-targeted microrna的表达在SDF-1-treated OA软骨细胞表达下调。超表达mir - 142 - 5 - p缓解OA病理学通过抑制软骨细胞凋亡,这是与减少软骨基质降解和灭活MAPK信号通路可能通过趋化因子受体CXCR4的直接目标。尽管积极的有生力量的验证在体外mir - 142 - 5 - p在衰减模拟政府办公自动化的发展仍然需要额外的动物和临床调查,我们的工作提供了重要的见解针对mir - 142 - 5 - p和SDF-1 / CXCR4轴开发OA患者潜在的治疗策略。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这个工作是由中国国家自然科学基金(81760403)。

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