主要绿茶儿茶素的蛋白结合特点:纯EGCG比较粗提物和药物研究gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

Label-free检测方法如石英晶体微量天平(药物)是适合分析等复杂混合物的分子相互作用的天然植物提取物。在目前的研究中,儿茶素的结合特点(EGCG)和原油绿茶提取物解决牛血清白蛋白(BSA)进行了调查。吸附质量水平上BSA-functionalized表面测量在不同浓度的解决方案。朗缪尔和弗伦德里希等温线模型被用来吸附数据。朗缪尔等温线更好地描述吸附行为的相关性为0.68和0.70的EGCG和粗提取液的解决方案,分别。更好地适应的朗缪尔模型表明,吸附发生均匀,聚合是微不足道的。质量饱和估计高出58%的原油绿茶比纯EGCG解决方案(7.9 ng /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba绿茶和5纳克/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2BaEGCG)。粗提物的吸附增加表明额外的茶化学成分具有约束力备用网站竞争结合的蛋白质分子和非惯用的效果。然而,降低了粗提取液的吸附率也观察到,表明一些竞争机制的存在。结果显示药物的效用分析的蛋白质绑定在原油混合物以及纯化合物。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

天然产物的重要来源与超过75%的现代药物治疗药物用于治疗传染病和60%的用于治疗癌症的药物组成的天然产物或合成分子药理学的启发,天然产物(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),如依托泊苷、替尼泊苷,紫杉醇(紫杉醇),吗啡,洋地黄毒苷,奎宁,阿托品gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。尽管合成化学的进步,调查复杂和多样的天然产物作为潜在药物仍然是一个活跃的研究领域。gydF4y2Ba

茶(gydF4y2Ba茶树)gydF4y2Ba被广泛使用在世界各地和水后是最受欢迎的饮料gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。茶多酚主要由儿茶素、类黄酮和酚酸。儿茶素占80%以上的内容,和茶的生物活性主要是归因于这些儿茶素(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。绿茶的儿茶素主要是表儿茶素(EC), (−) -epigalocatechin (EGC),(−)表儿茶素没食子酸盐(ECg)和儿茶素(EGCG)。图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示了儿茶素的化学结构,校长儿茶素检查在当前研究和化合物被认为是负责绿茶对健康的好处(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。区分结构特点其中儿茶素的存在与否在于galloyl一半和苯环上的羟基gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。Minoda et al。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]表明,EGCG和ECg与HSA的交互是100倍的交互galloyl儿茶素缺乏的一部分。茶多酚有各种各样的药理性质,例如,抵消有害氧化剂自由基与多种疾病有关,如心脏病和癌症(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)治疗良性前列腺增生(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),和降低胆道癌的风险(BTC) [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。应该注意的是,绿茶儿茶素容易氧化在中性水溶液碱性pH值,从而降低其生物活性。儿茶素与血清白蛋白结合使他们的组织的分布。有趣的是,有人建议,儿茶素与血清白蛋白时稳定由于自由巯基组织蛋白质的抗氧化作用[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

白蛋白是最丰富的血浆蛋白质在人类和是一个有吸引力的模型来研究药物绑定,因为它作为一个分子运输多种配体类型(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。牛血清白蛋白(BSA)是一种球状蛋白质与三个主要领域(І、II和III),每一个都由两个螺旋子域a和B (gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。深疏水口袋和带正电的入口位于相似职位的子域活动花絮和iii a,而这些口袋被认为对应各种化合物的结合位点(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。域iii a为例,结合位点是已知的能够绑定到洋地黄毒苷药物,阿司匹林和布洛芬。阿司匹林和阿司匹林碘化衍生品展示子域之间几乎相等的分布花絮和iii a,而华法林占据一个站点在花絮(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

检测和量化筛选分子的相互作用是至关重要的特征,发现新的药物。检测的主要技术可以分为基于标签或label-free。而广泛应用基于标签的检测试剂和仪器的可用性、标记策略可以改变分子的自然活动正在研究[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。相反,label-free检测方法依赖于直接产权下的分子研究的测量。Label-free技术尤其有利发展的数组描述多个分子相互作用[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。石英晶体微量天平(药物)是一个工具,使label-free检测分子相互作用通过测量压电晶体的谐振频率的变化由于吸附质。gydF4y2Ba

在当前的研究中,药物是用于研究蛋白质绑定解决方案的特点的纯EGCG和原油绿茶提取物和比较两种解决方案的吸附行为和大小相同的蛋白质(即。BSA)。结果解释的主要绑定机制,这些机制的效率,复杂的交互出现在天然植物提取物。gydF4y2Ba

2。实验gydF4y2Ba

2.1。材料、试剂、和解决方案gydF4y2Ba

牛血清白蛋白和儿茶素从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国),使用前未经纯化。绿茶提取物是准备从一个商业提取,EGCG绿茶提取物(美国现在食物,布卢明,IL)。50个胶囊的内容被溶解在500毫升的去离子水和费舍尔科学P4 medium-fine孔隙度滤纸过滤去除辅料(二氧化硅,硬脂酸镁)和水被蒸发了gydF4y2Ba在真空内gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

BSA的解决方案准备的浓度为10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}mol / L在磷酸缓冲盐溶解适当的质量。缓冲区是由溶解80 g / L的氯化钠,氯化钾2 g / L, 14.4 g / L的NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2BaKH和0.244 g / LgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在去离子水;然后使用盐酸缓冲pH值调整到4.9。EGCG的解决方案准备在浓度范围从10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}到10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}mol / L醋酸钠缓冲液溶解所需的质量。这个缓冲区由冰醋酸的10.5%,39.5%的醋酸钠,50%去离子水,缓冲的pH值也调整到4.9。虽然这pH值并不代表人体生理的pH值(7.4),之前的研究表明,pH值为4.9的调查是最优的catechin-BSA交互因为儿茶素更稳定在酸性pH值,和BSA保留其天然构象pH值4.9 [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。原油绿茶提取物溶解准备的解决方案是适当的坚实的群众在醋酸钠缓冲液浓度从2.0×10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}2.0×10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}mol / L。47% EGCG含量用高效液相色谱法证实,这些粗提取液的固体浓度对应EGCG含量从大约10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}到10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}mol / L,从而匹配纯EGCG的EGCG含量范围的解决方案。gydF4y2Ba

2.2。药物测量技术gydF4y2Ba

石英晶体微量天平(QCM200斯坦福研究系统、桑尼维尔,美国)是为了比较纯的蛋白结合特性与原油的绿茶提取物EGCG的解决方案的解决方案。该传感器由1.37厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba抛光黄金电极在一个2.54厘米直径,切石英晶体(O100RX3,斯坦福的研究系统,桑尼维尔,美国)。使用之前,晶体在食人鱼清理2.0分钟解决方案为了消除有机残留物。食人鱼的解决方案是准备在3:1的比例30%过氧化氢硫酸。清洗后,晶体在去离子水冲洗,使用压缩空气干燥。一个150gydF4y2BaμgydF4y2BaL流动池(O100FC,斯坦福的研究系统,桑尼维尔,美国)被用来介绍晶体表面的解决方案。注射泵(ne - 300泵系统公司。新时代,法明岱尔,纽约,美国)被用来解决方案介绍给水晶通过化学耐油管。注射泵操作在一个常数0.1毫升/分钟的流量。没有外部温度控制在本研究使用。然而,所有解决方案介绍了流动单元在室温下,没有明显的环境温度变化在实验中观察到。gydF4y2Ba

2.3。吸附测量gydF4y2Ba

为了创建一个protein-functionalized表面,BSA是固定到金电极的水晶,导致饱和单层(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。结合的蛋白质通过至少一个光秃秃的黄金硫醇源自其17个二硫键(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。在以往的研究中,发现直接固定BSA黄金表面足够,给类似的质量密度与表面构建链接器相比之前引入BSA (gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。EGCG的质量吸附特征和原油绿茶测量解决方案,首先介绍醋酸钠缓冲为了建立一个稳定状态基线共振频率;质量的变化与绿茶成分的吸附导致相应的晶体谐振频率的变化。频率的变化可以用来估计吸附质量通过索尔布雷方程(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba灵敏度因子(56.6 Hz-cm吗gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba·gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})5 MHz,切石英晶体在室温下。注意,索尔布雷方程只适用于刚性,均匀薄膜(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。然而,它不能准确地描述粘弹性薄膜等类型的吸附研究在当前的研究中。此外,需要注意的是,BSA绑定后改变其构象配体(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba),这将导致的共振频率变化的药物。为了考虑粘弹性和BSA构象变化,索尔布雷方程引入了一个新因素gydF4y2Ba 粘弹性的因素gydF4y2Ba可以通过比较实验数据估计的理论估计。这提供了一个简单的方法进行定量比较和绕过固有的错误的假设索尔布雷方程。gydF4y2Ba

图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示了一个特征的共振频率的变化(估计吸附单位面积上的质量)作为时间的函数。这个情节代表一个实验涉及绑定的EGCG 10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}mol / L在BSA-functionalized表面浓度的解决方案。这图显示了吸附率,定义为初始吸附曲线的斜率,平衡吸附量,在这种情况下,实现了大约30分钟后接触到测试解决方案。应该指出的是,环境温度变化会影响频率大小(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。然而,由于吸附质之间的区别是基于两个稳定的频率,并没有明显的温度变化发生在实验中,温度对结果的影响将微乎其微。没有外部温度控制在本研究利用。gydF4y2Ba

3所示。结果和讨论gydF4y2Ba

3.1。高效液相色谱法gydF4y2Ba

高效液相色谱法用于确定的EGCG含量实验样本。首次通过标准曲线分析纯EGCG的解决方案在一个样本的浓度范围从0.125到2.0毫克/毫升。线性回归分析导致了方程被用来确定的绿茶提取物EGCG含量为47% (±3.4%)。这个结果是在协议与EGCG含量声称50%的制造商。gydF4y2Ba

3.2。绿茶和EGCG绑定gydF4y2Ba

每个绿茶或EGCG实验之前,BSA是固定到金电极的药物晶体来创建一个饱和单层。基线之间的平均频率变化和BSA饱和度21赫兹,对应375 ng /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba,这与先前的研究一致(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。此外,BSA质量饱和可以被建模估计每个BSA分子作为三角棱镜壳尺寸为8.4×8.4 nm×8.4×3.2 nm (gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。使用这个模型,了解药物结晶区域,BSA的数量估计为4.5×10gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba分子/晶体,或363 ng /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。因此,可以说高信心BSA单层饱和。gydF4y2Ba

EGCG通常是采取与其他化合物的形式提取,即。、茶或膳食补充剂药丸;因此,其他绿茶成分EGCG药物动力学的影响应该被理解。在目前的研究中,药物被用于调查的BSA-binding特征纯植物提取物EGCG的解决方案和一个EGCG-containing原油(绿茶)的解决方案。结果表明其他绿茶成分不干扰分布EGCG通过竞争对血清白蛋白结合位点。gydF4y2Ba

图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba显示了EGCG的吸附质浓度的函数和绿茶的解决方案。应该注意的是,绿茶提取物显示数据点放置EGCG含量(总固体浓度的47%)。每个数据点代表一个吸附实验用干净的晶体。广泛的浓度进行了测试,并进行复制选定的浓度以确定行为等温线同时允许估计的统计变化通过确定系数的统计分析。吸附数据分析利用朗缪尔的两个一般均衡吸附模型和弗伦德里希这些曲线符合也显示在图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。朗缪尔等温线是广泛地用于描述吸附过程中有特定数量的结合位点的吸附剂。这些网站都是直到完全饱和,进一步吸附分子抑制。朗缪尔模型还假定,当一个网站是由一个分子占领,没有其他分子可以绑定到该网站(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。朗缪尔方程表示如下:gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2BaΓgydF4y2Ba是吸附质,gydF4y2BaΓgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}在饱和吸附量的质量,gydF4y2BaαgydF4y2Ba朗缪尔吸附常数,gydF4y2BacgydF4y2Ba溶液浓度。基本的朗缪尔的多个线性化方程被用来确定最适合的拟合常数获得使用Lineweaver-Burk线性化:gydF4y2Ba

由此产生的吸附常数绿茶的纯EGCG的解决方案,解决方案如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

实证弗伦德里希方程也被用来适应当前的吸附数据。这个模型假定吸附到异构表面和表达如下:gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2BakgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba是一个常数相关的吸附容量,gydF4y2BangydF4y2Ba是一个常数相关的吸附强度(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。最适合的弗伦德里希常数也表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

结果表明,吸附行为EGCG和粗提物是最好的朗缪尔所描述的模型,所表示的决心系数就越高。朗缪尔等温线行为的特点之一是质量达到饱和(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。这个饱和可以视为一个水平线的频移和浓度。在这项研究中,饱和了约3.0×10的溶液浓度gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}mol / L对绿茶和纯EGCG的解决方案。更高的浓度进行测试确认饱和度已经实现,和一个浓度范围从10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}到10gydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}被发现足以描述分子间相互作用的等温线用于这项研究。更好的适应朗缪尔等温线的数据表明,儿茶素吸附BSA上发生均匀,多层有限或分子聚合形成。这个预计具体的交互之间通过氢键的形成促进了茶多酚的酚组和脯氨酸BSA分子的羰基化合物gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。此外,实验复制被用来执行计算缺乏配合和纯粹的错误gydF4y2Ba值的线性化模型。从表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba值EGCG和绿茶是0.28和0.79,分别。表明,有95%的信心,没有证据缺乏合适的Lineweaver-Burk朗缪尔线性化模型。静态分析是提高本研究结果所示的信心和证明的结果可以用于进一步分析。总之,绿茶和EGCG吸附结果表明,粗提物和纯EGCG遵循相同的趋势,意味着没有重大变化的吸附模式绿茶和儿茶素,结果可用于进一步的分析和比较两个解决BSA的绑定。gydF4y2Ba

BSA由三个结构域(I, II, III),每一种都是由两个子域,A和b .然而,子域活动花絮和III A原则结合位点(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。因此,实现完整的saturatation,假定的朗缪尔模型中,两个分子的EGCG将在这两个子域绑定。考虑到这个,大规模饱和EGCG可以被召回,估计有4.5×10gydF4y2Ba^12gydF4y2BaBSA分子/晶体。两个分子的EGCG将绑定到每个蛋白质分子导致总6.6×10gydF4y2Ba^12gydF4y2BaEGCG分子/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。使用EGCG的摩尔质量(458.4克/摩尔),质量均匀饱和估计5.0 ng /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。这种理论质量饱和可以相比质量饱和估计使用索尔布雷方程(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba为了确定粘弹性的因素gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba使用这种方法,值为53.6时得到的gydF4y2Ba和使用规模中等gydF4y2BaygydF4y2Ba设在在图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。这个大差距的电影估计和粘性电影估计预计BSA是相对较大的球状蛋白质(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

观察BSA-binding更高质量的原油绿茶提取物(7.9 ng /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba比纯EGCG) (5.0 ng /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),这是符合事实,绿茶含有多个与BSA结合的多酚类化合物,包括电子商务、EGC、心电图,EGCG。结果表明,竞争绑定并不主要因为EGCG摩尔质量最高的绿茶儿茶素,和吸附质量会减少从纯EGCG的解决方案在巨大的竞争面前绑定。粗提取液的质量上升相比,纯EGCG可以归因于绑定二级的绿茶BSA分子。先前的研究已经表明,心电图和电子商务结合主要在子域活动花絮(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)和EGC的入口,主要结合位点结合子域名iii a [gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。此外,其他茶类黄酮也发现疏水口袋内绑定在子域活动花絮和iii a [gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),这表明每个主要绑定网站包含多个领域的多样性的分子可能同时绑定。它也表明,疏水结合位点对BSA大而被吸附物分子(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba),使BSA吸附多种配体同时、独立能力在相同的结合位点之间没有显著干扰配体(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。考虑到以上,比较绿茶和纯EGCG吸附BSA是可能的,并且它可以表示,BSA允许其他绿茶成分结合而不影响吸附模式。王等人。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]研究儿茶素的吸附BSA使用QCM-D和得出结论,BSA-EGCG交互弗伦德里希等温线所描述的要好。这表明,EGCG并不在BSA形成一个简单的单层。然而,朗缪尔模型的相关系数也很高在先前的研究中,这表明朗缪尔等温线假设特定的绑定和单层形成不应该完全排除在外,EGCG的吸附BSA可以被描述为一个复杂的吸附现象,是最好的描述方面的朗谬尔和弗伦德里希模型。Chitpan等人用类似的方法来研究绑定红茶thearubigins BSA和得出结论,绑定行为朗缪尔等温线(所描述的是最好的gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba显示了吸附率随着浓度的函数为EGCG和绿茶。每个数据点代表一个实验在一个干净的晶体。率被定义为切线的斜率在吸附如图的开始gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。可以看出,吸附率随溶液浓度的增加。这个比例增加是一个现象学匹配朗缪尔模型的进一步证据。根据朗缪尔吸附的速率正比于主要的驱动力,浓度(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

的结果图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba没有显示出显著的吸附率降低原油绿茶的解决方案相比,EGCG的解决方案。这进一步支持了假设竞争绑定不是显性效应。尽管其他因素可能影响儿茶素的药物动力学gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,这些结果表明,用绿茶代替纯EGCG不会降低血清白蛋白绿茶儿茶素的吸附率。gydF4y2Ba

4所示。结论gydF4y2Ba

石英晶体微量天平是用于调查的绑定特征主要绿茶儿茶素与牛血清白蛋白。绑定使用解决方案的纯EGCG检查以及解决方案的原油含绿茶提取物,除了EGCG,其他儿茶素、类黄酮和酚酸的分子。根据这个实验,可以得出以下主要结论:gydF4y2Ba(1)gydF4y2Ba吸附行为EGCG和绿茶所描述的解决方案可以朗缪尔等温线。这是表示系数相对较高的决心,当朗缪尔模型用于符合吸附质量与溶液浓度数据。适合朗缪尔模型表示一个同质的覆盖率和concentration-driven特定的绑定。更高的吸附率更高浓度也支持现象学的朗缪尔等温线。gydF4y2Ba(2)gydF4y2Ba平衡吸附质从绿茶的解决方案是高于EGCG的解决方案。自EGCG是最大的绿茶提取物儿茶素,平衡结合质量的增加表明,附加成分显示出显著的BSA的结合亲和力。竞争绑定是发现在决定二次效应的平衡吸附量,这是符合BSA的能力同时绑定到多个配体没有明显的这些配体之间的相互作用。gydF4y2Ba(3)gydF4y2Ba之间没有显著差异吸附的速率从EGCG绿茶的解决方案,解决方案,进一步支持竞争绑定非惯用的结论。gydF4y2Ba(4)gydF4y2Ba的药物label-free技术可以应用于蛋白结合研究原油混合物等植物提取物除了纯化合物的解决方案。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突有关的出版。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

手稿是通过贡献的作者写的。所有作者都批准的最终版本的手稿。所有作者取得重大科学贡献范围、执行和完成当前的研究反映了作者归因。e·e·阿里作用域的初始工作,执行部分的实验,准备部分的手稿。m . o . Elmakki执行部分的实验,确定最后的建模,和准备的部分手稿。m . l . Gavette执行部分的实验。b·j·道尔协助范围和建议的生物学方面的工作。s . j . Timpe建议的范围以及化学和工程方面的工作。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这个经济研究是由伊利诺斯州空间格兰特财团,休斯研究奖,布拉德利大学卓越中心的教学和学习。gydF4y2Ba

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