Fructose-Induced羰基/氧化应激酿酒酵母:TOR的参与

文摘

TOR(雷帕霉素)的目标信号通路第一出芽酵母中描述酿酒酵母是真核生物中高度保守的细胞生长的效应,长寿和应激反应。TOR活化氮来源,特别是氨基酸,深入研究;然而与碳水化合物的相互作用和羰基应激研究甚少。果糖是一个更强有力的glycoxidation代理的能力会产生大量的活性羰基(RCS)和氧物种比葡萄糖(ROS)。RCS / ROS增加生产,由于glycoxidation在活的有机体内,应该是参与羰基/氧化应激、代谢紊乱,真核生物的寿命缩短。在这个工作我们的目标是扩大我们的理解TOR是如何参与的羰基/氧化应激引起的减少单糖。发现与glucose-grown细胞相比,fructose-grown羰基/氧化应激标志物的水平更高。TOR路径的缺陷抑制代谢率,抑制代glycoxidation产品fructose-grown酵母。

1。介绍

之间有很强的正相关关系过度饮食的摄入碳水化合物和代谢紊乱被观察到在许多实验和临床研究1- - - - - -6]。在机制被认为是负责代谢障碍,ROS / RCS生产增加,由于glycoxidation,是最支持一个(1,3]。葡萄糖是最被动减少单糖,这种特性被认为是负责葡萄糖作为主要代谢燃料的出现(7- - - - - -9]。同时,果糖的摄入,这大大增加了在过去几十年(4,6),建议比葡萄糖更广泛参与非酶的过程和生成的活性物种10- - - - - -12]。长期应用果糖的不利影响在不同实验模型可以解释为高水平的glycoxidation产品(4,13,14]。例如,过多的果糖摄入量动物已被证实引起羰基/氧化应激(10,12]。

能够很好的证明,通过TOR信号通路激活各种细胞外和细胞内挑战当条件有利于经济增长15]。例如,TOR促进细胞生长,以应对营养可用性(16,17]。大多数研究TOR激活的营养都集中在氮源(15,18,19),而碳水化合物得到了更少的关注。此外,TOR,作为细胞生长的中央控制器,可以应对不同类型的压力和压力条件下起着重要的作用除了营养限制(18]。然而,关于TOR和羰基之间的关系所知甚少的压力。

这里,使用果糖,glucose-grown酵母作为一个模型,我们表明,删除TOR基因抑制代谢率和抑制细胞培养一代glycoxidation产品果糖但不是葡萄糖。

2。材料和方法

2.1。酵母菌株和化学品

的酿酒酵母菌株使用如下:YPH250(野生型垫一个trp1-Δ1 his3-Δ200 lys2 - 801 leu2-Δ1 ade2 - 101 ura3-52),请提供教授井上Yoshiharu(日本京都大学)20.];JK9-3da(野生型马塔leu2 - 3112 ura3-52 rme1 trp1 his4加+ HMLa)[21)及其衍生物MH349-3d (JK9-3dator1: LEU2-4)[22),SH121 (JK9-3dator2: ADE2-3 / YCplac111:: tor2-21ts)[23],SH221 (JK9-3dator1: HIS3-3 tor2: ADE2-3 / YCplac111:: tor2-21ts)[24),请提供教授迈克尔•霍尔(瑞士巴塞尔大学)。化学物质来源于Sigma-Aldrich化工有限公司(美国)和丙烯酰胺(德国)。所有的化学试剂均为分析纯。

2.2。生长条件和细胞提取物

酵母细胞生长在28°С用颤抖的175 r.p.m。在液体培养基中含有1%酵母提取物,2%蛋白胨,1%蔗糖(yp) 24 h。获得文化分成三组:yp稀释,另一个稀释的酵母提取物中含有1%,蛋白胨2%,和2%葡萄糖(YPD),最后一个稀释介质中含1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%果糖(YPF)。在所有文化(稀释0.3×10⁶细胞/毫升)细胞种植在上述条件下额外的24小时。由离心收集细胞实验文化(5分钟,8000克)和洗50 mM磷酸钾缓冲(pH值7.0)。酵母细胞从第一组在28°孵化С:(1)10 - 60%葡萄糖或10 - 60% fructose-containing缓冲溶液为24小时(25];(2)10毫米H₂O₂1 h (26];和(3)50 mM乙二醛1 h [27]。

酵母颗粒来自各自的实验文化resuspended在裂解缓冲(50毫米磷酸钾缓冲,1毫米phenylmethylsulphonyl氯,EDTA和0.5毫米)。细胞提取物是由涡流酵母悬浮液与玻璃珠(0.5毫米)如前所述28)和保存在冰立即使用。

2.3。对酵母生存能力和代谢活动的评价

细胞生存能力作为衡量细胞生存和被稀释点可视化评估对比方法(29日]。点分析是由接种酵母细胞(在同一浓度在每组)和连续稀释(1,10⁻²,10⁻⁴5)作为一滴μL在琼脂板。经过3天的孵化在28°С,由此产生的殖民地形成清晰可见文化景点。

评估酵母的代谢活动2、3、5-triphenyl四唑氯使用。新陈代谢活跃的细胞能够减少染料不溶于水的红色甲瓒,可以从细胞中提取乙醇/丙酮混合物,然后这个解决方案的吸光度是阅读在485纳米30.]。结果表示为OD_485年单位每10⁸细胞。

2.4。ROS的荧光分析

荧光,oxidation-sensitive探针2′,7′二氯荧光素二醋酸盐是用来测量细胞内ROS水平(26]。氧化二乙酸二氯荧光素的荧光强度是决定使用纳米和纳米与SpectraMAX双子座EM 96孔板荧光谱仪和软马克斯Pro 4.7软件(从分子器件、桑尼维尔CA)。相对荧光表达的结果是每10个单位⁶细胞。

2.5。测定蛋白质羰基、糖化蛋白质和α二羰基化合物

参数测量spectrophotometrically Spekol 211分光光度计(德国卡尔蔡司)和СФ-46(ЛОМО,苏联)。蛋白质羰基化合物的含量是衡量确定数量的2,4-dinitrophenylhydrazone形成下反应2,4-dinitrophenylhydrazine [28]。羰基含量的最大吸光度计算2,4-dinitrophenylhydrazone以370海里使用22毫米的消光系数⁻¹·厘米⁻¹。nmol /毫克的蛋白质表达的结果。

糖化蛋白是由果糖胺估计的内容分析的基础上,减少氮蓝四唑(电视台)碱性pH值(31日]。细胞匀浆被稀释1毫克/毫升的蛋白质浓度和透析用水20 h将低分子量化合物。电视台在100毫米碳酸盐缓冲(pH值10.3)添加到样本含有0.2毫克蛋白获得最后一个电视台0.3毫米的浓度。吸光度测量在525海里5 h后孵化在37°С。糖化蛋白质含量计算使用的消光系数12.6毫米⁻¹·厘米⁻¹。nmol /毫克的蛋白质表达的结果。

α二羰基化合物的Girard-T反应(32]。的吸光度双取代的化合物,它是由绑定两个Girard-T试剂分子二羰基组,测量在pH值为9.2,最大吸收波长325 nm使用18.8毫米的消光系数⁻¹·厘米⁻¹乙二醛。乙二醛等价物的结果表示在nmol /毫克的蛋白质。

2.6。蛋白质浓度测定和统计分析

蛋白质浓度测定的考马斯亮蓝g - 250染色法(33)与牛血清白蛋白标准。实验数据表示为3 - 7独立实验的平均值±标准平均误差(SEM),和统计测试学生的使用以及。

3所示。结果与讨论

果糖是常用的甜味剂和摄入自1900年代初以来[翻了两番4,6]。这相似之处增加肥胖,糖尿病和其他代谢紊乱(3,5,34- - - - - -36]。增强的glycoxidation产品建议参与果糖负面影响在不同的实验模型4,13,14,36]。

比较葡萄糖和果糖参与活性氧/ RCS的一代,最近我们使用面包酵母作为在体外和在活的有机体内模型,发现在体外果糖与葡萄糖相比是一个更强有力的发起者的glycoxidation反应(25]。然而,至关重要的果糖效果很大程度上取决于实验条件:(i)更高层次的羰基/氧化应激标志物与更高的fructose-grown老化速率与glucose-grown酵母在固定相(果糖在长期的不利影响模型)(11];(2)fructose-grown酵母在指数期暴露于H₂O₂了更高的生存和细胞内ROS浓度低于glucose-grown细胞(防守果糖短期效应模型)(26];和(iii)没有区别的葡萄糖和果糖对酵母的影响生存和细胞内水平glycoxidation产品monosaccharide-induced压力,当完整细胞暴露在高浓度的己糖25]。

在这里,我们使用酵母24 h葡萄糖或果糖上的培养,当指数期合并缓慢增长的固定相。图1显示了影响细胞内的葡萄糖和果糖水平glycoxidation产品。Fructose-grown相比glucose-grown细胞代谢率较高(图2.5倍1(一)),这是符合我们的以前的观测(11,26]。能够很好的证明,整体代谢率,特别是碳水化合物代谢,很大程度上决定了细胞的氧化还原平衡(37,38和寿命39]。显著提高代谢活动(图1(一))与更高层次的氧化应激标记,ROS和蛋白质羰基fructose-grown比glucose-grown细胞(1.7——1.3倍的数字1 (b)和1 (c)、职责)。图2显示更高级别的总ROS(1.6倍)和羰基蛋白(1.8倍)酵母处理10毫米H₂O₂相对于控制细胞(H₂O₂)。因此,ROS水平的增加和羰基蛋白在fructose-grown酵母类似细胞暴露于过氧化氢可以解释为氧化应激在fructose-supplemented增长的发展。

从先前的报道众所周知,过多的果糖摄入量在动物(10,12)和酵母模型(11,36羰基)也会导致压力。此外,增加蛋白质羰基可以伴随许多生理和病理过程和被认为是衰老的一个标记(29日,40- - - - - -44]。因此,接下来,我们研究了羰基应激水平的标记在研究类型的细胞(葡萄糖-和fructose-grown)。图3展示了更高层次的α二羰基化合物(a)和(b)糖化蛋白质在fructose-grown细胞比生长在葡萄糖(1.3和2.8倍,分别地。)。比较的能力果糖和高活性羰基化合物乙二醛羰基造成压力,接下来,我们测量了酵母的羰基应激标记水平强调50 mM乙二醛。的内容α-dicarbonyls(图4(一))和蛋白质羰基(图4 (b))被发现与乙二醛酵母菌治疗后显著增加(2.5和1.8倍,分别地。)。因此,fructose-supplemented酵母培养会导致氧化和羰基压力。

图5展示了葡萄糖和果糖参与活性氧/ RCS和氧化/羰基形成压力。Glycoxidation可以由减少单糖和收益率enediols和烷氧基的激进分子。烷氧基的激进容易与氧气反应生成超氧化物阴离子自由基,它可以转化为过氧化氢和羟基自由基。与此同时,glycoxidation导致的形成α-dicarbonyls乙二醛和甲基乙二醛等。实验比较果糖和葡萄糖反应在非酶的过程展示更高的果糖反应(4,11,13,14,26,36]。乍一看,它不同意有机化学的概念醛糖(如葡萄糖)由于更大的亲电性和可访问性的羰基活性大于各自酮糖(例如,果糖)。少一个解释是,葡萄糖是反应的形成非常稳定的环结构阻碍其水溶液反应。果糖也形成环状结构,但在更大程度上存在于其活性形式比葡萄糖。因此,本研究条件下用于果糖与葡萄糖相比是一种更强有力的glycoxidation的引发剂在活的有机体内(数据1和3)。

上述符合更好的生存酿酒酵母YPH250后应力诱导40%葡萄糖40%果糖(图6)。当另一个野生型菌株也获得了类似的结果酿酒酵母JK9-3da和60%的碳水化合物(图使用7);但是,相比酿酒酵母YPH250,没有观察到不同葡萄糖-和fructose-stressed之间酿酒酵母JK9-3da单糖的40%。因此,酿酒酵母JK9-3da似乎更耐高浓度果糖比酿酒酵母YPH250。有趣的是,衍生品JK9-3da,单一的变异Δtor2和双突变体Δtor1Δtor2低,生存压力诱导40%果糖40%葡萄糖(图7)。因此,一些参与TOR路径可以在酵母fructose-induced压力。以前的工作报道的失活细胞内ROS水平下降通过热量限制或TOR信号通路tor1基因缺失,而TOR信号通路的激活酿酒酵母高营养浓度增加活性氧的水平(45]。此外,最近有人建议,TOR抑制抑制甲基乙二醛的形成和其他有害的RCS (46]在碳水化合物代谢产生47,48];然而任何实验证实这些假设还没有被发现。

为了检查上述建议,氧化/羰基应激水平的标记已经决定在野外JK9-3da和突变体缺陷类型tor1和tor2基因生长在葡萄糖和果糖(图8)。按照建议果糖与葡萄糖是一种更有效的诱导物的氧化/羰基应激和获得的数据酿酒酵母YPH250(图1和3),代谢率(图8(一个)),水平的α-dicarbonyls(图8 (b)蛋白质羰基(图),8 (c))被发现明显高于JK9-3da细胞生长在细胞生长在葡萄糖果糖比(1.8、1.3和1.8倍,分别地)。参数的三个突变体生长在葡萄糖演示中的价值观类似glucose-grown野生型细胞。在fructose-supplemented培养的情况下,所有的三个参数确定,代谢活动的水平α-dicarbonyls,蛋白质羰基化合物,总体较低的三个突变体与野生型相比(1.7、2.6和1.9倍,分别地)。因此,TOR基因缺失降低了RCS fructose-grown酵母菌的浓度。后者对应前面的建议在RCS代抑制TOR路径失活(46]。

4所示。结论

首先TOR信号通路中描述酿酒酵母之间高度保守的酵母、动物和植物。它收到了极大的关注由于其重要性在调节细胞生长、新陈代谢,长寿和应激反应。我们的研究证实了以前的发现果糖和葡萄糖的高反应性,更有力的RCS / ROS的生产和开发不同fructose-supplemented的氧化/羰基应激模型和扩展他们的第一份报告的代谢率抑制和降低代glycoxidation fructose-grown缺乏TOR蛋白的酵母产品。需要进一步的研究来理解TOR监管可能有助于预防代谢综合征,糖尿病并发症和其他干扰与慢性消耗高果糖饮食有关。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢井上Yoshiharu教授和教授Michael大厅提供酵母菌株和Jacek Miedzobrodzki教授的支持和合作。

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