cmp - n - acetylneuraminate -beta-半乳糖胺-alpha-2,3-sialyltransferase 1 (ST3Gal-I)重组蛋白单克隆抗体的研制大肠杆菌

摘要

异常糖基化是癌症的主要特征之一，其特征是唾液酸转移酶的基因表达改变。ST3Gal-I是一种唾液酸转移酶，已知在膀胱癌中T抗原的唾液酸化中发挥关键作用，据报道它在乳腺癌发生中随着肿瘤进展阶段的增加而表达升高。目前研究的目的是开发新的抗人ST3Gal-I单克隆抗体(mAbs)，并评估其诊断潜力。我们开发了一套稳定的杂交瘤细胞系，能产生高亲和力的IgG抗体对抗重组人ST3Gal-I，表达于大肠杆菌BL21-DE3压力。为了证明单克隆抗体的诊断价值，我们利用不同的克隆对ST3Gal-I在癌组织中的表达进行免疫组化分析。7E51C83A10克隆产生的抗体在乳腺癌组织切片中表现出强烈的特异性荧光染色，在纤维腺瘤切片中无明显背景。总之，针对重组ST3Gal-I的单克隆抗体可以识别细胞ST3Gal-I，并代表了一个很有前景的诊断工具，用于ST3Gal-I表达细胞的免疫检测。7E51C83A10单克隆抗体对ST3Gal-I的特异性反应也通过免疫印迹得到证实。因此，我们的观察证明ST3Gal-I作为一种潜在的肿瘤诊断标志物在更大范围内具有价值。

1.介绍

糖基化是一种常见的蛋白质和脂质翻译后修饰与碳水化合物侧链的共价添加。糖基化改变与癌症密切相关，由于糖基和寡糖链的高度复杂结构，这些分子因此产生了很大的蛋白质组学多样性。近年来，人们发展了不同的方法来描述和分析它们，但这些方法仍处于起步阶段[1，2］.糖的精确添加是由两种对糖基化至关重要的酶介导的，即糖基转移酶和糖苷，它们在各种细胞和组织中精确而不同地表达[3.，4］.

唾液酸是位于聚糖中糖的末端位置的神经酸残基，并且通常被发现与蛋白质或脂质分子有关。这些分子在肿瘤形成，分化和进展期间在细胞信号传导中发挥着重要作用，其由属于唾液酸糖基族家族的酶活性引起的[5，6］.

唾液酸转移酶根据其合成的碳水化合物侧链分为4个家族，即ST3Gal (α2,3 - st)， ST6Gal (α2,6 - st)、ST6GalNAc和ST8Sia (α2, 8-ST) [4］.每个唾液酸转移酶利用特定的糖基作为底物催化唾液酸转移到低聚糖。ST3Gal-I和ST3Gal-II利用3型寡糖结构Galß1→3galna - r，而ST3Gal-III, ST3Gal-IV, ST3Gal-V和ST3Gal-VI使用寡糖异构体Galß1→3/ 4glcnac - r [7- - - - - -9］.

异常的糖基化是癌症的主要商标之一，癌症中最常见的异常糖基化学术中描述了与Chomsen-Friedenreich相关的抗原的途径，其中包括Thomsen-Nouveau抗原（TN），SiaLyl-Thomsen-Nouveau抗原（STN），Thomsen-friedenreich抗原（t）和sialyl-thomsen-friedenreich抗原（st）。TN抗原含有一个Galnacα-O与多肽链中丝氨酸/苏氨酸残基的一个残留物。TN抗原可以通过ST6GalNAC-I唾液化至STN，或者可以通过C3GNT转换成核心3结构。通过T-合酶转化为T抗原的TN抗原，通过C2GNT通过ST3GAL-I或核心-2结构转化为ST的另外的T抗原[10］.

根据已知的特异性，唾液酸转移酶ST3Gal-I介导T抗原的唾液酸化，T抗原是一种关键的碳水化合物肿瘤标志物。ST3Gal-I的上调被证实是T抗原唾液化的主要机制之一。T抗原是一种肿瘤相关结构，其唾液酸化形式(ST抗原)与唾液酸转移酶的表达改变有关，通常与癌症患者的不良预后和低生存率有关。上皮来源的癌症，如胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌，通常表现为Sialyl-Tn (STn)的表达增强[11，12］.此外，转移性结肠直肠癌表现出与原发性肿瘤相比，唾液酸化TN，T和Lewis-A和Lewis-X抗原的一致表达的TN和T肿瘤标志物的特征降低。众所周知，这些抗原可以作为癌症的好生物标志物[13，14］.

ST3Gal-I尤其在膀胱癌中T抗原的唾液化中发挥重要作用[12］.在乳腺癌中，T抗原的主要载体是粘蛋白1 (MUC1) [15，16］.来自乳腺癌细胞系(MCF-7、BT-20和T47D)的muc1粘蛋白比来自正常乳腺上皮细胞(MMSV1-1、MTSV1-7和HB-2)的muc1糖基化模式更简单，碳水化合物链更少，GlcN/GalN比例更高。这些差异，共同或单独，解释了一些T细胞和muc1抗体的独特肿瘤特异性[17］.Solatycka等研究表明，在乳腺癌细胞中，ST3Gal-I的下调与MUC1基因的表达直接相关，MUC1基因的过表达影响了糖介导的乳腺癌细胞粘附[18］.

因此，在本研究中，我们的目标是开发和表征抗重组ST3Gal-I的单克隆抗体，从而建立酶的作用，并证实其在癌组织中相对于正常细胞的表达增加。通过SDS-PAGE、western blot和乳腺癌组织免疫组化对该蛋白进行表征。针对纯化的ST3Gal-I蛋白产生单克隆抗体，并特异性识别在乳腺癌组织中特异表达的蛋白。然而，ST3Gal-I及其单克隆抗体需要在一个大的平台上进行临床验证，以便将其用作癌症检测和聚糖研究的诊断工具。

2.材料和方法

2．1．重组ST3Gal-I的表达

氨基酸1-340 cDNA的密码子优化智人利用NcoI/ hinii位点将ST3Gal-I (NCBI accession: NP_003024.1)克隆到内部开发的含有T7启动子系统和卡那霉素抗性基因的pYBL01质粒载体中进行选择(数据未发表)。E．杆菌菌株BL21 (DE3) (New England Biolabs Inc.)用于重组蛋白表达。将pYBL01-ST3Gal-I质粒转入BL21 (DE3)细胞进行表达。细胞在37°C含卡那霉素(25μg/mL)。接种后0.05，以培养密度诱导小范围基因表达(10 mL)在37°C下加入1 mM的IPTG 3小时。诱导后，4°C离心收获细胞，细胞颗粒保存在−80°C进行进一步处理。

2．2．重组ST3Gal-I表达分析

为分析含有n端7x His标签的重组蛋白(ST3Gal-I)的表达情况，将10 mL小培养液在Kubota(型号7780)离心机中4℃，12000 rpm (22030 ×g)离心10 min。未诱导和诱导细胞颗粒悬浮在由0.125 M Tris-HCl组成的缓冲液中，10% 2β-巯基乙醇，20%甘油，0.004%溴酚蓝，pH值约6.8，通过SDS-PAGE分析，如Laemmli所述[19］.考马斯蓝染色可见蛋白条带。

2．3.重组ST3Gal-I的纯化

使用固定化金属亲和层析进行重组ST3GAL-1的纯化。在37℃下表达的2.5LBl21（de3）培养物总共9克湿的冷冻细胞重量在冰上中解冻并重新悬浮在含有20mM Tris，150mM NaCl和0.1％TritonX100的50ml裂解缓冲液中，ph 8.0。在冰上超声处理5分钟后，通过以10,000rpm（15229×g）在Kubota转子中以10,000rpm（15229×g）来澄清裂解物30分钟。用含有20mM Tris，pH 8.0,150mM NaCl和0.1％Triton X-100的洗涤缓冲液洗涤两次粒子，然后用20mM Tris，pH 8.0和150mM NaCl洗涤两次。将最终颗粒（包含体）溶解在含有8M尿素，20mM Tris，300mM NaCl和1mM DTT，pH8.0的60ml平衡缓冲液中。将溶解的样品通过0.2过滤 μm孔径过滤装置(Nalgene, Rochester, NY)。单个20ml螯合Sepharose (GE Healthcare, India) IMAC色谱柱，带0.1 M硫酸镍，在加载过滤样品前，用20mm Tris-Cl、pH 8.0、8 M尿素、300 mM NaCl和1 mM DTT(平衡缓冲液)预平衡。在整个运行过程中，流速设置为3ml /min。当样品通过色谱柱时，收集蛋白质流动。上样完成后，用平衡缓冲液至少洗涤10柱体积(CV)，直到280 nm的吸光度稳定在基线。用含有50 mM咪唑的平衡缓冲液(20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 8 M尿素，300 mM NaCl, 1 mM DTT) 5 CV进行洗涤。蛋白的洗脱采用5 CV的洗脱缓冲液(20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 8 M尿素，300 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM咪唑)。各20 mL收集蛋白组分，12% SDS-PAGE分析。重组ST3Gal-I片段与最后添加0.2 M精氨酸混合，蛋白在peg20000中浓缩16小时。浓缩样品在20 mM Tris-Cl、pH 5.0、0.2 M精氨酸和50%甘油下室温(25°C)透析16小时。 The dialyzed sample was filtered through a 0.2 μm孔径过滤装置(Nalgene, Rochester, NY)。总蛋白浓度用分光光度法在．

２.４.单克隆抗体的产生

将3只6 - 8周龄雌性BALB/c小鼠分为5组，每组皮下注射10-50免疫μg重组ST3Gal-I，使用杂交瘤技术，如Kohler和Milstein所述[20.］.在初始免疫中，抗原在弗氏完全佐剂(Sigma)中乳化。随后在第21、42和63天用弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行免疫。每次注射后2周收集抗血清，用间接ELISA检测st3gal - i特异性抗体的存在。抗体滴度最高的小鼠被腹腔注射两次(两次增强间隔24小时)，每次15μg的ST3Gal-I溶解在PBS中，细胞融合前2天。小鼠脾细胞与Sp2/0-Ag 14小鼠骨髓瘤细胞融合使用hybrid - max聚乙二醇溶液(50% W/v) (Sigma-Aldrich-P7181)。杂交细胞选择在添加了HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)的培养基中(添加了50倍HAT培养基，Sigma-Aldrich-H0262)。采用ELISA法筛选重组ST3Gal-I蛋白杂交瘤克隆培养上清，限制性稀释亚克隆阳性克隆。亚克隆进行了两次，以确保克隆的单克隆行为和稳定性。杂交瘤细胞在添加15%胎牛血清(FBS, Gibco)、谷氨酰胺(Gibco)和抗菌抗真菌抗生素(Gibco)的完全Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM, SIGMA)中生长。采用间接抗体捕获ELISA法，利用Fc特异性HRP标记的抗小鼠IgG，筛选只分泌IgG同型免疫球蛋白的克隆，筛选出ST3Gal-I蛋白特异性抗体。分泌对his标记的重组蛋白反应抗体的克隆被忽略。根据制造商的说明，用小鼠单克隆同型分型试剂盒(SIGMA)确定生成的单克隆抗体的同型。

2．5．免疫印迹

重组ST3Gal-I抗原经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移到硝酸纤维素膜上。用从腹水中纯化的10 mL单克隆抗体(100 ng/mL)进行印迹检测在活的有机体内从Balb / c老鼠。用Fc特异性酶标山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG同型(Sigma)检测结合单克隆抗体，然后与TMB底物(Sigma)进行量热反应。考马斯蓝检测蛋白质的装载量和转运效率[21]和Ponceau S染色，如在其他地方描述。

2．6．免疫组织化学

福尔马林固定石蜡包埋的乳腺癌组织和纤维瘤瘤块来自新德里全印度医学科学研究所病理科。4μ将M厚切片通过Citra在蒸笼中处理30分钟。在室温下，在1xtB / 10％正常的山羊血清中封闭切片20分钟。将切片与1xtB中的1：50中的初生抗体孵育过夜，在4℃下过夜。在室温下，在TBS的TBS中漂洗三次的切片，并在室温下在室温下在1：1000中稀释1：1000的二抗孵育60分钟。然后在室温下将部分在TBS中漂洗三次，每次搅拌3分钟。盖玻片安装在含有DAPI（Invitrogen，Depong Gold Drifade试剂与DAPI）的载玻片上。将该部分与Olympus相位对比倒置显微镜，CKX 41SF成像。

3.结果

3．1.重组ST3Gal-I基因的分析

用NcoI/HindIII酶对ST3Gal-I (pYBL01-ST3Gal-I)的DNA结构进行了表征(图)1）.ST3Gal-I蛋白表达采用大肠杆菌菌株BL21 (DE3)的诱导温度为37℃，IPTG浓度为1mm，诱导3小时。在定位研究中发现，蛋白质以不溶形式表达为包涵体。37℃IPTG诱导后，比较含ST3Gal-I重组菌的诱导和非诱导表达的蛋白产物(图)2）.

3．2.净化rST3Gal-I

重组ST3Gal-I以其镍结合亲和力为基础，使用螯合Sepharose IMAC柱进行纯化，在300 mM咪唑洗脱。蛋白在peg20000中浓缩，最后透析到以50%甘油作为稳定剂的缓冲液中。通过SDS-PAGE还原12%，观察到约为44 kDa的纯化蛋白条带，银染色(图)3.）.在SDS-PAGE分析的基础上，我们得到了所需rST3Gal-I的纯度大于95%。纯化的rST3Gal-I的产量约为每2.5 L细菌培养14 mg。

3．3.单克隆抗体发展

针对注射的rST3Gal-I(只有非重复序列)产生了一系列单克隆抗体，并通过限制稀释法亚克隆了两次。我们可以鉴定出7种针对重组蛋白的单克隆抗体，这些单克隆抗体不识别His标签和其他描述的正常人血清。7E5 1C8 3A10单克隆抗体对ST3Gal-I表现出较强的反应性。，用于ELISA、western blot和免疫荧光研究。

3．4．免疫印迹分析

通过SDS-PAGE和western blot分析单克隆抗体的特异性。7E5 1C8 3A10单克隆抗体特异性识别44 kDa ST3Gal-I蛋白。抗体对正常的人血清蛋白和含有His-Tag的重组蛋白无任何反应(图4）.

3．5．免疫组织化学

阳性对照组织(即临床诊断的人乳腺癌组织)检测到较强的信号，阴性对照(人纤维腺瘤组织，乳腺最常见的良性病变之一)的预期背景染色水平较低，但其可区分性较强，如图所示5．

4.讨论

据报道，T抗原在不同的癌症中过度表达，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌;但在可检测范围内，约40%的正常组织也有表达[22］.同样，Sialyl-T抗原(ST)在一些癌症中过度表达，包括膀胱癌和乳腺癌[12，14，23]，但也能在正常组织和白细胞中检测到[24，25］.ST3Gal-I通过唾液酰化作用将T抗原不可逆地转化为唾液酰T抗原。在本研究中，我们表达了全长ST3Gal-I蛋白大肠杆菌并开发了一套针对人重组ST3Gal-I的单克隆抗体。ST3Gal-I蛋白在ns0来源的小鼠骨髓瘤细胞中表达，并通过HA (YPYDVPDYA)标记靶向57至340精氨酸。理论和报告的大小(33.4 kDa)是相同的，说明没有或非常少的糖基化。Lee等表达了ST3Gal-I的催化结构域，缺少N端55个氨基酸残基，并报道了非常轻微的糖基化[26］.我们的初步数据表明，mAb (7E5 1C8 3A10)能特异性识别肿瘤组织中固有的ST3Gal-I，并对ST3Gal-I具有较强的反应性和特异性大肠杆菌表达ST3Gal-I。这些数据表明，7E5 1C8 3A10克隆的单克隆抗体有潜力作为诊断试剂，用于研究ST3Gal-I在肿瘤中的表达，从而研究T和Sialyl-T抗原的表达。因此，这项研究可能有助于糖研究以及了解ST3Gal-I在不同癌症中的诊断潜力。

5.结论

我们的策略是应用重组大肠杆菌表达ST3Gal-I作为一种免疫原，用于开发与细胞ST3Gal-I和重组ST3Gal-I反应的高度特异性单克隆抗体。我们成功地纯化了ST3Gal-I大肠杆菌细胞和开发对ST3GAL-1的单克隆抗体，其特异性地检测人乳腺癌组织，没有与人纤维腺瘤组织的反应性。此外，需要研究ST3GAL-I及其抗体作为乳腺癌诊断的诊断工具以及现有的生物标志物。

缩写

磅:	仅有肉汤
IPTG:	异丙基硫代的,β-D-半乳糖苷酶
页面:	聚丙烯酰胺凝胶电泳
C2GNT：	酷睿2β1 3-n-乙酰葡糖胺蛋白酶酶
C3GnT:	core 3β1, 3-N-acetylglucosaminetransferase
简历:	列卷
IMAC:	固定化金属亲和层析
马伯:	单克隆抗体。

伦理批准

动物护理和相关实验程序是按照由印度Yashraj生物技术有限公司组成的机构伦理委员会(IAEC)批准的协议进行的，并符合动物实验控制和监督委员会(CPCSEA)的指导方针，印度环境与森林部。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

承认

作者感谢新孟买Yashraj生物技术有限公司为开展这项工作提供的资金和基础设施支持。作者还感谢全印度医学科学研究所肾病理科A. K. Dinda博士的团队，他们对乳腺癌和纤维腺瘤病例进行了免疫荧光研究。

参考文献

1. R. Apweiler, H. Hermjakob和N. Sharon，“关于从SWISS-PROT数据库分析推断的蛋白质糖基化的频率，”生物化学与生物物理学报，第1473卷，第1期。1，第4-8页，1999。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. I. Marchal, G. Golfier, O. Dugas, M. Majed，《糖生物学的生物信息学》，Biochimie第85卷第1期1-2，第75-81页，2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. j·A·w·哈利迪,A·h·弗兰克斯t . e . Ramsdale r·马丁和大肠、快速、自动化的检测方法加β1-4GlcNAcα2,6-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.1)活性Sambucus黑质凝集素”,糖生物学，第11卷，第5期。7，页557-564,2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. A. Varki，“唾液酸作为识别现象中的配体”美国实验生物学学会联合会杂志，第11卷，第5期。4，pp。248-255,997。视图:谷歌学者
5. a . Harduin-Lepers M.-A。Recchi和P. del惹人，"唾液酸转移酶之年"糖生物学，第5卷，第5期。8，第741-758页，1995。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. S. Tsuji, A. K. Datta, J. C. Paulson，《唾液酸转移酶的系统命名法》，糖生物学，第6卷，第2期7，第5-11页，1996。视图:谷歌学者
7. H. Kitagawa和J. C. Paulson，“人类组织中五种唾液酸转移酶基因的差异表达”，生物化学杂志，卷。269，没有。27，pp。17872-17878,1994。视图:谷歌学者
8. Y.-J。金,K.-S。金,工程学系。人类Gal的分子克隆和表达β1、3 galnacα2, 3-sialyltransferase (hST3Gal II)。”生物化学与生物物理研究通讯第228卷，第228号2，第324-327页，1996。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. V. Giordanengo, S. Bannwarth, C. Laffont et al.， " human Gal cDNA的克隆和表达β1 - 3) GalNAcα来自CEM t细胞系的2,3-唾液酸转移酶欧洲生物化学杂志，第247卷，第2期2，页558-566,1997。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. L. R. Loureiro, M. A. Carrascal, A. Barbas等人，“针对Tn和Sialyl-Tn抗原的抗体发展的挑战，”生物分子，第5卷，第5期。3, pp. 1783-1809, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. I. Brockhausen，“癌细胞中o -聚糖生物合成途径”，Biochimica et Biophysica Acta-General受试者，第1473卷，第1期。1，页67-95,1999。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. P.A.Videira，M.Correia，N.Malagolini等，“ST3GAL.I SiaLyl转移酶在膀胱癌组织和细胞系中相关性”，BMC癌症， 2009年第9卷第357条。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. Mucin-type i Brockhausen。O-聚糖在结肠癌和乳腺癌中的作用:糖动力学和功能EMBO报告，第7卷，第5期6，第599-604页，2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. F. Schneider, W. Kemmner, W. Haensch等人，“唾液酸转移酶cmp -唾液酸:Gal的过度表达β1、3 galnac-rα6-唾液酸转移酶与人类结肠直肠癌患者生存差相关。癌症研究第61卷第1期11，页4605-4611,2001。视图:谷歌学者
15. S. R. Hull，A. Bright，K.L.Caraway，M. Abe，D.F.Hayes和D.W.Kufe，D.W.Kufe，DF3唾液酸素抗原的寡糖差异来自正常人乳和BT-20人乳腺癌细胞系“癌症的通信， vol. 1, no. 14，页261-267,1989。视图:谷歌学者
16. F. G. Hanisch, G. Uhlenbruck, J. Peter-Katalinic, H. Egge, J. Dabrowski, and U. Dabrowski， " structure of neutral .O人脱脂乳粘蛋白上的-联聚乳糖胺聚糖。一类新的线性扩展聚N-乙酰乳胺与Galβ(1 - 4) GlcNAcβ(1 - 6)重复单位。”生物化学杂志，第264卷，no。2，第872-883页，1989。视图:谷歌学者
17. K. O. Lloyd, J. Burchell, V. Kudryashov, B. W. T. Yin, J. Taylor-Papadimitriou， "比较O来自正常乳腺上皮细胞系和乳腺癌细胞系的muc1粘蛋白中的-链接碳水化合物链。肿瘤细胞中更简单和更少的糖链，”生物化学杂志号，第271卷52，第33325-33334页，1996。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. A. Solatycka, T. Owczarek, F. Piller等人，“MUC1在人和小鼠乳腺癌细胞中降低核心2的表达β1,6-乙酰戊酰氨基氨基氨基转移酶和β半乳糖苷α2, 3-sialyltransferase。”糖生物学第22卷第2期8, pp. 1042-1054, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. uk Laemmli，“T4噬菌体头部组装过程中结构蛋白的切割”，自然，卷。227，没有。5259，pp。680-685，1970。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. G. Kohler和C. Milstein，“分泌预定义特异性抗体的融合细胞的连续培养”，自然，第256卷，第2期5517，第495-497页，1975。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. W.Weiss，F.Weiland和A.Gorg，“蛋白质检测和用于凝胶的蛋白质组分析的定量技术”分子生物学方法J. Reinders和A. Sickmann, Eds。，卷。564，pp. 59–82, Humana Press, 2009.视图:谷歌学者
22. M. R.Kudelka，T.Ju，J.Heimburg-Molinaro，以及R. D. Cummings，“癌症中复杂疾病 - 粘蛋白型O-聚糖的简单糖”癌症研究进展，第126卷，第3章，第53-135页，Elsevier, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. 林志信。王,w l。李,C.-M。Juang等人，“卵巢癌中唾液酸转移酶mRNA表达的改变”，妇科肿瘤，第99卷，第5期。3，页631-639,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. P. A. Videira, I. F. Amado, H. J. Crespo等人，“表面α2 - 3,α人单核细胞和衍生树突状细胞的2-6唾液酸化及其对内吞作用的影响GlycoConjugate Journal.，第25卷，第2期3，页259 - 268,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. J. J. Priatel，D. Chui，N.Hiraoka等，“ST3GAL-I Sialyl转移酶控制CD8⁺通过调节o -聚糖生物合成的T淋巴细胞稳态免疫力，第12卷，第2期3，页273-283,2000。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. K.-Y。Lee, H. G. Kim, M. R. Hwang et al.，“Gal的六肽抑制剂β1、3 galnac-specificα2,3-唾液酸转移酶作为唾液酸糖酶的通用抑制剂，“生物化学杂志第277期51，页49341-49351,2002。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2015 Anuj Kumar Gupta等。这是分布下的开放式访问文章知识共享署名许可协议如果正确引用了原始工作，则允许在任何媒体中进行无限制使用，分发和再现。