展望 生物化学研究国际 2090 - 2255 2090 - 2247 Hindawi出版公司 10.1155 / 2015/767204 767204年 研究文章 单克隆抗体发展CMP-N-Acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2 3-sialyltransferase 1 (ST3Gal-I)重组蛋白表达 大肠杆菌 古普塔 阿库玛 考尔 Parvinder 帕蒂尔 Harshada Kadam 帕拉维·埃呀尔 Bhanushali Paresh B。 丘格 Manoj 宣 j .贾斯汀 Yashraj生物技术有限公司 情节不。C 232 TTC工业区 MIDC 纳400705年孟买 印度 yashraj.com 2015年 10 12 2015年 2015年 06 10 2015年 21 11 2015年 25 11 2015年 2015年 版权©2015 Anuj Kumar Gupta et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

异常糖基化是癌症的主要特征之一,基因表达水平改变了sialyltransferases签名。sialyltransferase ST3Gal-I,众所周知,扮演着重要的角色在膀胱癌sialylation T抗原,它报告了高表达在乳腺癌致癌作用与增加肿瘤恶化阶段。当前研究的目的是开发新单克隆抗体(mab)对人类ST3Gal-I和评估他们的诊断的潜力。我们开发了一个曲目稳定的杂种细胞细胞株产生的高亲和性免疫球蛋白抗体重组人类ST3Gal-I表示 大肠杆菌BL21-DE3压力。为了演示马伯的诊断价值,各种ST3Gal-I克隆用于免疫组织化学分析在癌组织中表达。抗体产生的7 e51c83a10克隆了一个强大和特定的荧光染色在乳腺癌组织部分,没有表现出明显的纤维腺瘤背景部分。总之,mab提出反对重组ST3Gal-I识别细胞ST3Gal-I和代表一个有前途的诊断工具的immunodetection ST3Gal-I表达细胞。Specific-reactivity克隆7 e51c83a10马伯ST3Gal-I也经免疫印迹。因此,我们的观察保证评价ST3Gal-I作为一个潜在的癌症诊断的标志在更大的规模。

 1。介绍

糖基化是一种常见的转译后的修改细胞内蛋白质和脂质碳水化合物侧链的共价加成。改变与癌症和糖基化是很好,由于糖和寡糖链半个高度复杂的结构,这些分子因此产生大的蛋白质组多样性。近年来开发了不同的方法来描述和分析,但仍在起步阶段 1, 2]。准确和精确的糖是由两种酶糖基化称为糖基转移酶和苷的关键正是和差异表达在不同的细胞和组织 3, 4]。

唾液酸是神经氨酸残基位于聚糖和终端位置糖经常发现与蛋白质或脂质分子。这些分子发挥重要作用在肿瘤细胞信号形成、分化、和发展带来的酶的活动属于sialyltransferase家族( 5, 6]。

Sialyltransferases分为4家庭的基础上合成的碳水化合物侧链,即ST3Gal ( α2,3-ST)、ST6Gal ( α2 6-ST) ST6GalNAc和ST8Sia ( α2,8-ST) [ 4]。每个sialyltransferase利用一个特定的糖一半作为催化底物的转移唾液酸低聚糖。ST3Gal-I和ST3Gal-II利用类型3低聚糖结构Galß1→3 galnac-r而ST3Gal-III ST3Gal-IV, ST3Gal-V, ST3Gal-VI使用低聚糖同分异构体Galß1→3/4GlcNAc-R [ 7- - - - - - 9]。

异常糖基化是一种主要的癌症和商标中所描述的癌症中最常见的异常糖基化途径Thomsen-Friedenreich-related抗原包括Thomsen-nouveau抗原(Tn) Sialyl-Thomsen-nouveau抗原(STn) Thomsen-Friedenreich抗原(T)和Sialyl-Thomsen-Friedenreich抗原(ST)。Tn抗原包含一个残留的GalNAc alpha-O-linked丝氨酸/苏氨酸残基的多肽链。Tn抗原可以sialylated STn ST6GalNAc-I或可以转化成由C3GnT核心3结构。Tn抗原由T-synthase,进一步转化为T抗原T抗原转化为圣由C2GnT ST3Gal-I或酷睿2结构( 10]。

用已知特异性,sialyltransferase ST3Gal-I介导的sialylation T抗原,肿瘤主要碳水化合物标记。的upregulation ST3Gal-I被透露的一个主要机制负责sialylation T抗原。sialylated的T抗原是肿瘤相关的结构形式(圣抗原)是参与改变的表达sialyltransferases,通常与不良结果相关,可怜的癌症病人的存活率。癌上皮来源,如胃、大肠癌、胰腺癌、乳腺癌,卵巢癌经常表现出增强的表达Sialyl-Tn (STn) [ 11, 12]。此外,转移性大肠癌癌显示特性减少了Tn和T肿瘤标志物的表达与一致的表达升高sialylated Tn, T,刘易斯和Lewis-X抗原与原发性肿瘤。被广泛报道,这些抗原可以作为很好的癌症生物标记( 13, 14]。

ST3Gal-I尤其是扮演着一个重要的角色在膀胱癌的sialylation T抗原( 12]。在乳腺癌中,T抗原的主要载体是粘蛋白1 (MUC1) [ 15, 16]。从乳腺癌细胞系muc 1粘蛋白(MCF-7 BT-20, T47D)简单的糖基化模式和更少的碳水化合物链比muc 1从正常乳腺上皮细胞(MMSV1-1、MTSV1-7 HB-2)比率较高的GlcN / GalN。这些差异,在一起或独自一人,解释不同的肿瘤特异性的T细胞和muc 1抗体( 17]。Solatycka等人表明,以上的差别在乳腺癌细胞中,对这些ST3Gal-I直接与MUC1基因的超表达MUC1的表达影响乳腺癌细胞的粘附carbohydrate-mediated [ 18]。

因此,在当前的研究中我们的目标是开发和描述单克隆抗体ST3Gal-I因此建立重组酶的作用并确认其增加了相对于正常细胞癌组织的表达。使用sds - page蛋白为特征,免疫印迹和免疫组织化学的乳腺癌组织。单克隆抗体纯化ST3Gal-I蛋白和抗体生成特别认可的专门在乳腺癌组织中蛋白质表达。然而,ST3Gal-I及其马伯需要临床验证,在一个宽广的平台,让他们被利用作为癌症检测和诊断工具对多糖的研究。

 2。材料和方法 2.1。表达重组ST3Gal-I

密码子优化互补脱氧核糖核酸的氨基酸1 - 340 智人ST3Gal-I (NCBI加入:NP_003024.1)克隆使用NcoI / HindIII网站为内部开发pYBL01质粒向量包含T7启动子体系和卡那霉素抗性基因的选择(数据没有公布)。 E。 杆菌应变,BL21 (DE3)(新英格兰生物学实验室Inc .),用于重组蛋白表达。的表情,pYBL01-ST3Gal-I质粒转化为BL21 (DE3)细胞。这些细胞被培养在仅有37°C Bertani(磅)媒体含卡那霉素(25 μg / mL) 10毫升一夜之间文化。接种后 一个 600年 n 米 0.05,小规模的基因表达(10毫升)诱导了一种文化密度 一个 600年 n 米 0.9增加1毫米IPTG的37°C 3小时。诱导后细胞被离心收获在4°C和细胞颗粒保持在−80°C进行进一步处理。

 2.2。分析重组ST3Gal-I表达式

分析重组蛋白的表达(ST3Gal-I)含有氨基端7 x标记,10毫升小规模文化离心机在12000 rpm (22030×g) 10分钟在4°C日本久保田公司离心机(型号7780)。Uninduced和诱导细胞颗粒悬浮在缓冲区,组成0.125 Tris-HCl, 10% 2 β巯基乙醇、20%甘油和0.004%溴酚蓝,pH值约为6.8,通过sds - page分析描述Laemmli [ 19]。蛋白质乐队被Coomassie可视化蓝染色。

 2.3。纯化的重组ST3Gal-I

纯化的重组ST3Gal-I执行使用固定化金属亲和色谱法。总共9克湿重的冷冻细胞2.5 L BL21 (DE3)文化表达了37°C是在冰上融化,resuspended 50毫升的裂解缓冲包含20毫米三、150毫米氯化钠和0.1% TritonX100, pH值8.0。声波降解法在冰5分钟后溶解产物离心澄清了在日本久保田公司10000 rpm (15229×g)转子30分钟。的颗粒被洗两次洗涤缓冲区包含20毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8.0,150毫米氯化钠,Triton x - 100和0.1%,其次是与20毫米三洗两次,pH值8.0,150毫米氯化钠。最终颗粒(包涵体)溶解在60毫升的平衡缓冲包含8 M尿素,20毫米三,300毫米氯化钠,德勤和1毫米,pH值8.0。溶解样品过滤是0.2 μ米孔隙大小过滤装置(耐尔根,罗彻斯特,纽约)。一个20毫升螯合琼脂糖(通用电气医疗集团、印度)IMAC列,指控0.1硫酸镍,与20毫米Tris-Cl preequilibrated, pH值8.0,8 M尿素,300毫米氯化钠,1毫米德勤(平衡缓冲)加载之前过滤样品。流量是整个运行3毫升/分钟。蛋白质通过收集的样本通过列。加载完成后,列是用平衡缓冲至少10列卷(CV),直到吸光度在280 nm成为稳定在基线。洗了5简历平衡缓冲(20毫米Tris-Cl, pH值8.0,8 M尿素,300毫米氯化钠,和1毫米德勤)包含50 mM咪唑。的洗脱蛋白,5简历洗脱缓冲(20毫米Tris-Cl, pH值8.0,8 M尿素,300毫米氯化钠,1毫米德勤,和300毫米咪唑)是应用。蛋白质分数被收集在20毫升每12% sds - page分析。重组ST3Gal-I包含分数与最终汇集0.2精氨酸和蛋白质集中在PEG 20000 16小时。集中样本对20毫米Tris-Cl透析,pH值5.0,0.2米精氨酸,50%甘油在室温(25°C) 16小时。 The dialyzed sample was filtered through a 0.2  μ米孔隙大小过滤装置(耐尔根,罗彻斯特,纽约)。总蛋白浓度估计spectrophotometrically 一个 280年 n 米 。

 2.4。代的单克隆抗体

五个群三个6-8-week-old雌性BALB / c小鼠10 - 50的每个被皮下注射免疫 μ克ST3Gal-I使用杂种细胞重组技术被描述为科勒和Milstein 20.]。一个初始免疫的抗原在弗氏完全佐剂乳化(σ)。后续免疫天21、42和63进行抗原在弗氏不完全佐剂乳化。抗血清收集每两周后注入和检测存在ST3Gal-I-specific抗体的间接ELISA。最高的小鼠抗体效价提高腹腔内,两次(24小时间隔两个推进器)15 μ克ST3Gal-I溶解在PBS, 2天前细胞融合。小鼠脾细胞与Sp2/0-Ag 14小鼠骨髓瘤细胞融合使用Hybri-Max聚乙二醇溶液50% (W / v) (Sigma-Aldrich-P7181)。混合细胞生长培养基中选择补充了帽子(氨喋呤,次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)(50 x帽子媒体补充,Sigma-Aldrich-H0262)。文化的上层的杂种细胞克隆筛选ELISA对重组ST3Gal-I蛋白质和积极的克隆被限制subcloned稀释。Subcloning进行两次以确保单克隆克隆人的行为与稳定。杂种瘤细胞生长在完成杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM,σ)补充15%胎牛血清(的边后卫,Gibco) Glutamax (Gibco)和抗生素抗菌抗真菌的(Gibco)。由此产生的杂种细胞筛选特定ST3Gal-I蛋白抗体的抗体捕获ELISA间接使用Fc特定合共轭anti-mouse免疫球蛋白选择克隆分泌免疫球蛋白的免疫球蛋白g同形像。克隆分泌抗体活性His-tagged重组蛋白是被忽视的。同形像生成的马伯决心用鼠标单克隆iso-typing工具包(σ)根据制造商的指示。

 2.5。免疫印迹

重组ST3Gal-I纯化抗原被钠十二烷基硫酸盐解决聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和转移在硝化纤维膜。墨迹;探讨了10毫升的单克隆抗体(100 ng / mL)纯化腹水 在活的有机体内从 Balb / c老鼠。绑定马伯Fc特定检测了HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白免疫球蛋白的同形像(σ),紧随其后的是一个与三甲热量反应底物(σ)。蛋白质加载和转换效率被Coomassie蓝色监控( 21和朱红色年代染色,分别描述。

 2.6。免疫组织化学

福尔马林固定石蜡包埋块乳腺癌组织和纤维腺瘤病理部门接收,全印度医学科学研究所,新德里。4 μ米厚的部分在轮船被Citra治疗了30分钟。部分被封锁在1 xtbs / 10%正常山羊血清20分钟在rt,部分被孵化主要抗体稀释1:50 1 xtbs一夜之间在4°C。部分在TBS冲洗三次5分钟每个RT和孵化与二次抗体稀释1:1000年1 xtbs 60分钟RT在黑暗。部分被冲洗三次为5分钟每个TBS rt,盖玻片与DAPI安装在幻灯片(与DAPI表达载体,延长黄金不变色试剂)。的部分是与奥林巴斯相差倒置显微镜成像,CKX 41科幻。

 3所示。结果 3.1。分析重组ST3Gal-I

的DNA构建ST3Gal-I (pYBL01-ST3Gal-I)具有NcoI / HindIII酶(图 1)。ST3Gal-I蛋白质的表达进行使用 大肠杆菌应变,BL21 (DE3),在感应温度37°C和1毫米IPTG浓度为3小时。作为定位研究中,观察到蛋白质表达为包涵体在其不溶性形式。用IPTG诱导后在37°C,诱导表达的蛋白质产品和uninduced重组细菌含有重组ST3Gal-I比较(图 2)。

pYBL01-ST3Gal-I克隆的特性:巷1:1 Kb DNA阶梯,默克公司;巷2:骨干向量消化NcoI / HindIII酶和预期的乐队大小52个基点和5370个基点;巷3:pYBL01-ST3Gal-I克隆、消化与NcoI / HindIII酶和预期的带尺寸1032个基点和5370个基点。

Coomassie蓝染色的sds - page分析重组ST3Gal-I E。 杆菌应变BL21 (DE3):巷1:uninduced rST3Gal-I文化;巷2:诱导rST3Gal-I文化。蛋白质分子量从默克公司使用标记。箭头显示诱导重组蛋白。

 3.2。净化rST3Gal-I

重组ST3Gal-I净化的基础上执行它的镍绑定使用螯合琼脂糖亲和IMAC列在300毫米咪唑洗脱。蛋白质都集中在PEG 20000最后透析到缓冲50%甘油作为稳定剂。一群纯化蛋白对应大约44观察kDa,说明了减少12% sds - page、银染色(图 3)。我们得到了纯度大于95%的预期rST3Gal-I sds - page档案的基地。纯化rST3Gal-I被发现的收益率大约14毫克/ 2.5 L的细菌培养。

银染色利用sds - page分析纯化后的重组rST3Gal-I。从默克巷1:蛋白质分子量标记;道2和3:纯化重组ST3Gal-I蛋白(2 μg和1 μg,职责)。

 3.3。单克隆抗体发展

单克隆抗体生成的数组对注入rST3Gal-I(只有非重复序列)和subcloned通过限制两倍稀释法。我们可以确定7对重组蛋白单克隆抗体,并没有意识到他的标记和正常人类血清所描述的其他地方。7 e5 1 c8 3 a10单克隆抗体ST3Gal-I表现出强烈的反应。,ELISA、免疫印迹和免疫荧光研究。

 3.4。免疫印迹分析

单克隆抗体的特异性,也分析了sds - page免疫印迹紧随其后。7 e5 1 c8 3 a10单克隆抗体特别认可44 kDa ST3Gal-I蛋白质。抗体没有表现出任何反应正常人类血清蛋白质和他包含重组galectin(图3蛋白质 4)。

免疫印迹分析ST3Gal-I 7 e5 1 c8 3 a10单克隆抗体。从内巷1:蛋白质分子量标记;巷2:纯化重组ST3Gal-I蛋白(3 μg);巷3:-控制1(人类血清);巷4:-控制2(重组galectin 3包含6 x标记,31.5 kDa)。

 3.5。免疫组织化学

强烈的信号中检测出积极控制组织,也就是说,人类临床诊断乳腺癌组织,这是强烈的,尽管一个小级别的预期背景染色负控制(人类纤维腺瘤组织,最常见的一种良性乳腺病变),如图 5。

针对ST3Gal-I IHC-7E5 1 c8 3 a10马伯(人类乳腺癌和纤维腺瘤)。(一)DAPI染色人类乳腺癌组织切片,(b) 7 e5 1 c8 3 a10mabs人类乳腺癌组织切片染色,(c) DAPI染色人类纤维腺瘤组织切片,和(d) 7 e5 1 c8 3 a10mabs彩色人体纤维腺瘤组织部分。

 4所示。讨论

报道,T抗原在不同癌症包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌;但它也表达了在大约40%的可检测范围内正常组织( 22]。同样,Sialyl-T抗原(ST)在某些癌症包括膀胱和乳腺癌 12, 14, 23在正常组织和白细胞(发现),但也 24, 25]。ST3Gal-I负责T抗原的不可逆转换sialylation Sialyl-T抗原。在这项研究中,我们已经表达了完整ST3Gal-I蛋白质 大肠杆菌和发展人类重组ST3Gal-I的单克隆抗体。研发系统,美国已表示NS0-derived ST3Gal-I蛋白,小鼠骨髓瘤细胞和有针对性的57 Arg 340 Arg氨基酸与公顷(YPYDVPDYA)标记。据理论和大小(33.4 kDa)都是相同的状态,没有或非常少的糖基化。李等人表示ST3Gal-I的催化域,缺少55 N末端氨基酸残基,并报告非常轻微的糖基化 26]。我们的初步数据显示,mAb (7 e5 1 c8 3 a10)专门识别本机ST3Gal-I癌症组织也已经显示出强烈的反应和特异性 大肠杆菌表达等化验ST3Gal-I免疫印迹和ELISA。这些数据表明潜在的马伯7 e5 1 c8 3 a10克隆用作诊断试剂研究ST3Gal-I表达肿瘤,因此T和Sialyl-T抗原的表达。因此本研究可能有助于在多糖研究以及理解ST3Gal-I不同癌的诊断的潜力。

 5。结论

我们的策略是应用重组 大肠杆菌表示ST3Gal-I作为免疫原高度发展的特定马伯活性细胞ST3Gal-I和ST3Gal-I重组。我们已经成功纯化的重组ST3Gal-I 大肠杆菌细胞和发达的单克隆抗体对ST3Gal-I专门检测人类乳腺癌组织无反应性与人类纤维腺瘤组织。还需要进一步的研究来建立ST3Gal-I及其抗体作为乳腺癌诊断的诊断工具以及现有的生物标志物。

 缩写 磅:

仅有肉汤

 IPTG:

异丙基硫代的, β-D-galactosidase

 页面:

聚丙烯酰胺凝胶电泳

 C2GnT:

酷睿2 β1 3-N-acetylglucosaminetransferase

 C3GnT:

core 3 β1,3-N-acetylglucosaminetransferase

 简历:

列卷

 IMAC:

固定化金属亲和色谱法

 马伯:

单克隆抗体。

 伦理批准

动物保健和相关实验过程进行了按照机构伦理委员会批准的协议(IAEC)由Yashraj生物技术有限公司,印度,和是符合指南委员会控制和监督的目的的动物实验(CPCSEA),印度环境与森林部。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 承认

作者承认金融和基础设施支持收到Yashraj生物技术有限公司,纳孟买,开展这项工作。作者也感谢a . k . Dinda博士的小组从肾病理部门,全印度医学科学研究所,进行免疫荧光研究乳腺癌和纤维腺瘤病例。

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