生产和净化部分α淀粉酶枯草芽孢杆菌使用固态发酵(MTCC 121)

文摘

淀粉酶是一种酶,这种酶催化淀粉分解成糖类和在不同领域中扮演着关键角色作为餐后酒,用于生产乙醇和高果糖玉米糖浆,洗涤剂,欲望的纺织品、改性淀粉,水解油田钻井液和废纸回收。在目前的工作中,固态发酵(SSF)α淀粉酶生产被用于代替深层发酵(SmF)由于其简单的技术,低投资,低水平的降解物阻遏,更好的产品复苏。枯草芽孢杆菌已经众所周知生产α淀粉酶和测试使用固态发酵48小时37°C与麦麸作为衬底。比较不同发酵时间48小时后展示了高产α淀粉酶。α淀粉酶最佳pH值和温度在7.1和40°C,分别。目标净化α淀粉酶、30 - 70% (NH)₄)₂所以₄削减集中淀粉酶活动三个方面对原油发酵提取。这是验证在酶谱定量DNS测定方法以及凝胶概要文件。淀粉酶的精确分子量尚未决定借助其他蛋白质纯化技术。

1。介绍

淀粉酶催化作用淀粉分解成糖类。α淀粉酶可以分解长链碳水化合物,最终产生从直链淀粉、麦芽糖或麦芽糖,葡萄糖,和“极限糊精”支链淀粉。淀粉酶是由广泛的生物,虽然每个源产生的生化表型显著不同pH值和温度等参数最适条件以及金属离子的需求(1]。到目前为止,两个主要的类别的淀粉酶已确定在微生物,即α淀粉酶和葡糖淀粉酶。α-Amylases (endo-1 4-a-D-glucan glucohydrolase)是细胞外酶,随机裂开,4-a-D-glucosidic相邻葡萄糖单元线性淀粉酶之间的联系链。葡糖淀粉酶(exo-1 4-a-D-glucan glucanohydrolase)水解单一葡萄糖单位nonreducing结束的直链淀粉和支链淀粉在逐步的方式1,2]。这些是钙近年,完全无法函数在缺乏钙。钙稳定之间的界面中央一个域(291残留物)(β/α)₈桶结构和多变量B域(104年至206年残留物)[3- - - - - -7]。

因为它的繁杂程序淀粉酶吸引了研究者的注意后几十年以来在1894年首次分离和鉴定的真菌源制药消化配方中用作添加剂(8]。爆发以来发现的研究持续至今为止涉及微生物作为淀粉酶的潜在来源。优先选择微生物淀粉酶生产由于相对容易处理,可用性,有利的生长条件,和廉价的营养需要量比其他生产商像植物和动物。淀粉酶占据主要份额(约25%)的全球酶市场由于其高总需求消除化学水解淀粉的淀粉液化过程(9,10]。已经利用在纺织、食品、酿造、纸浆行业(11- - - - - -13]。

SmF的传统生产方式长期以来重要的工业酶,过去由于多个设施像更好的控制环境因素即pH值、温度、通风、湿度。文化报道用于淀粉酶生产使用SmF属于各种各样的芽孢杆菌物种如芽孢杆菌sp, PN5枯草芽孢杆菌js - 2004,芽孢杆菌IMD sp。435年,芽孢杆菌sp。我,芽孢杆菌caldolyticusDSM405,地衣芽孢杆菌GCBU-8等等(14- - - - - -19]。然而,社保基金取代SmF模仿微生物的自然栖息地。社保基金是一个更好的选择在SmF由于它的简单性,低投资,低能量需求,更少的水输出,和缺乏泡沫建立(20.- - - - - -22]。

随着生物技术创新尤其是发酵技术和酶生产的面积,社保基金与世行等农业废弃物,RB, COC,作为已经取代高成本的媒体通常用于深层发酵α淀粉酶制剂。芽孢杆菌经常用于物种α淀粉酶生产的帮助下社保基金使用麦麸[23- - - - - -29日]。

记住,生,部分纯化淀粉酶,已经使用在餐后酒,在目前的工作中,我们有部分纯化α淀粉酶提取枯草芽孢杆菌。知道固态发酵(SSF)比深层发酵成本有效和高效(SmF),我们使用麦麸作为生产的基板α淀粉酶。原油的具体活动和纯化酶决心使用DNS测定和洛瑞法(30.,31日]。α淀粉酶的pH值和温度最佳决定。淀粉酶的发酵提取部分纯化使用硫酸铵削减和验证本地页面以及酶谱。

2。材料和方法

2.1。固态发酵培养液的准备

1.5毫升培养液添加了50毫升磅媒体。接种后的媒体文化,媒体一直在37°C 48小时和O。D是检查(外径_600年= 0.450)。剂在OD相当于外径_600年= 0.450添加到4克热压处理过的麦麸(WB)可以从当地的社保基金市场和温度保持在37°C 48小时发酵周期。

2.2。酶提取

经过48小时的发酵发酵媒体拍摄,浸泡在20毫米磷酸盐缓冲剂(pH = 7.0) 30分钟在4°C扶轮瓶。这是离心机在8000 rpm 15分钟4°C。这之后的收集上层的酶提取。

2.3。淀粉酶测定

α淀粉酶活性的提取测定DNS法(30.]。在短暂的反应混合物含有可溶性淀粉1%,20毫米磷酸盐缓冲剂(pH = 7)和发酵提取被孵化37°C 20分钟之后,3、5-dinitrosalicylic酸(DNS)。在测定还原糖解放的数量估计通过测量颜色开发在540 nm紫外可见分光光度计。1 u的淀粉酶活动被定义为麦芽糖的解放微克分子的酶量在标准试验条件下每分钟。

2.4。蛋白质估计

提取的蛋白质含量测定后洛瑞的方法(31日]。

3所示。用硫酸铵沉淀净化α淀粉酶

(0 30)%,10毫升的酶提取摄于猎鹰和(268毫克10即。,2。68 gm.) of ammonium sulphate is added slowly in the extract. The mixture was stirred thoroughly for 30 minutes. Then the solution was centrifuged, the pellet was taken out, and the supernatant was kept. After that the pellet was resuspended in 2 mL of 20 mM phosphate buffer.

(30 - 70)%,检索到上层的拍摄和2.56通用。硫酸铵的加入。透析再次重复前面的步骤。

3.1。本地页面和酶谱

10毫升的解决凝胶的组成包括4毫升dH₂啊,2.50毫升1.5米三,2.667 mL Bis-Acrylamide, APS 0.733毫升1%,5μL tem。有时后,解决凝胶组时,叠加凝胶倒和可以得到解决。10毫升的叠加凝胶的组成由5.70毫升dH₂啊,2.50毫升0.5米三,1.0 mL Bis-Acrylamide, APS和0.70毫升1%,10μL tem。

现在这种凝胶是由浸在1%淀粉在酶谱开发解决方案5分钟紧随其后加入几滴碘。1%淀粉溶液制备1通用在100毫升20毫米的淀粉磷酸缓冲。为了准备碘溶液,10通用KI晶体的溶解在100毫升蒸馏水和5添加了通用的碘。

4所示。结果与讨论

芽孢杆菌物种被认为是最重要的来源α淀粉酶,常用于酶生产使用社保基金。

4.1。固态发酵生产α淀粉酶

经过48小时的固态发酵在37°C使用枯草芽孢杆菌,的生产α淀粉酶检测使用DNS方法通过确定酶活性在40°C。淀粉酶的具体活动为13.14 (μ摩尔/毫克/ min)在40°C(表上1)。

4.2。淀粉酶活性测定在不同温度和pH值

温度和pH值对酶活性产生深远的影响。48小时内发酵提取的最适温度为淀粉酶观察从图1这是大约40°C。淀粉酶是13.14的具体活动μ摩尔/毫克/分钟40°C。

确定合适的pH值范围内的酶活性,酶检测缓冲区不同pH值为6.6,7.1,7.6和8.6。观察最大酶活性在pH值为7.1 (8.74μ摩尔/毫克/毫升)在40°C。更多的使用碱性缓冲导致酶活性的急剧下降(图2)。

5。部分净化α淀粉酶

部分净化α淀粉酶从粗酶提取得到的固态发酵麦麸是通过使用(NH₄)₂所以₄降水。酶试验进行确定α淀粉酶活性在硫酸铵分数。本地化的淀粉酶活性的30 - 70%分数上层清液从(0 - 30%)降低酶活性相比分数从0 - 30%。具体活动有一个近似的三倍增加相比,原油。淀粉酶是7.73的具体活动μ摩尔/分钟/ mg在30 - 70%,而40°C 1.47μ摩尔/分钟/ mg特定活动被发现在其他分数0 - 30%。

6。描述的α淀粉酶在页面

α淀粉酶从48小时发酵提取的特征在8%本地凝胶。观察了在图3;从凝胶很明显,相对于原油提取、30 - 70% (NH)₄)₂所以₄分数是丰富的蛋白质。这也印证了定量测定淀粉酶活性(表2)。这是观察到0 - 30% (NH₄)₂所以₄分数相对贫穷的淀粉酶活性对其蛋白质含量(具体活动= 1.47μ摩尔/分钟/毫克)。这些数据从图进行验证3在巷2完整的蛋白带的消失是按照分钟淀粉酶活性(具体活动= 1.47μ摩尔/分钟/毫克)。

为了证实的存在在30 - 70% (NH淀粉酶₄)₂所以₄分数,α-淀粉酶的酶谱进行了使用本机的另一半凝胶。观察图3 (b)。在车道3中,淀粉酶活性检测作为一个明确的乐队在黑暗背景淀粉碘的存在。缺乏明确的乐队由于车道1和2的淀粉酶活性对应原油和0 - 30%分数证明相对纯化淀粉酶在30 - 70%的分数。α淀粉酶活性是由于转换下的极限糊精过多的的影响β淀粉酶与碘产品给红棕色颜色。的分子量α淀粉酶的芽孢杆菌物种范围在50到60 kDa虽然有些例外的存在α淀粉酶(分子量31 kDa)隔绝地衣芽孢杆菌(32- - - - - -34]。在目前的研究部分纯化α淀粉酶限制我们的知识结论的分子量α淀粉酶。进一步的工作是描述分子相同的质量。

高市场需求的淀粉酶与特定应用在食品和医药行业生产需要和局部净化这些有价值的酶从社保基金使用廉价的原材料如麦麸。与这一目标,目前的工作是试图净化淀粉酶枯草芽孢杆菌,可以用在许多领域如洗涤剂、纺织、油田钻井液的水解,造纸工业。

7所示。结论

尽管有些初步的酶的最佳pH值和温度等参数优化确定了α淀粉酶从社保基金在37°C, 48小时内完成净化以及分子量测定仍要执行。目前,目标净化α淀粉酶,部分酶的浓度是通过30 - 70% (NH₄)₂所以₄切,酶谱模式验证。进一步的工作完全净化α淀粉酶将其他净化技术的帮助下进行的。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

引用

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