抑制大鼠肌肉和肝脏磷酸果糖激酶的高剂量乙醇

文摘

活动大鼠肌肉和肝脏磷酸果糖激酶明显抑制后一个乙醇摄入的剂量每公斤体重2.5克。这种抑制作用是间接的,因为乙醇浓度(50毫米)接近建立后摄入2.5克每千克体重不能减少他们的活动在体外。抑制肝脏磷酸果糖激酶活性后,每公斤5.0 g乙醇摄入可能是直接的,因为肝脏磷酸果糖激酶活性降低在体外当乙醇添加到上层清液的大鼠肝组织在100毫米的浓度。根据分子对接的结果,在高浓度乙醇可以绑定adenine-binding口袋的肝脏磷酸果糖激酶的变构ADP-binding网站(Asp543, Phe308、Phe538 Phe671)和ADP的激活可以被C₂H₅哦分子。直接抑制肌肉磷酸果糖激酶活性,可能由于ADP-binding网站绑定的乙醇相似,是可能的,当乙醇(500毫米)的浓度远远高于可成立于活细胞水平。因此,抑制肌肉磷酸果糖激酶活动后一个摄入5.0克每公斤是间接的,可能与酶的抑制柠檬酸、磷酸烯醇丙酮酸水平升高。

1。介绍

磷酸果糖激酶催化磷酸化fructose-6-phosphate特性,6-bisphosphate。这个反应是一个关键的糖酵解的监管一步(1]。磷酸果糖激酶活性是通过变构抑制和激活规范。高ATP ADP比抑制磷酸果糖激酶和糖酵解(1]。事实上,ADP(反应)的乘积是一个变构激活酶的活性(2]。磷酸果糖激酶也被AMP激活和fructose-2 6-bisphosphate和抑制磷酸烯醇丙酮酸和柠檬酸3]。

哺乳动物磷酸果糖激酶是四聚物。有三个单体的磷酸果糖激酶基因编码。他们是指定为肌肉、肝脏和血小板磷酸果糖激酶。肌酶是homotetramer(由四个相同的肌肉子单元)1]。肝脏也表示主要homotetramer四肝子单元组成的1]。

乙醇中可以找到163条蛋白质数据银行(http://www.pdb.org/)。它能与许多蛋白质作为溶剂的一部分。酒精脱氢酶结合(代谢)乙醇专门(1]。乙醇还结合α7-nAChRs(烟碱乙酰胆碱受体)作为受体激动剂(4),GABA受体(γ-氨基丁酸受体)是一个积极的变构调制器(5],NMDA (n -甲基- d受体)作为拮抗剂受体(6),和甘氨酸受体受体激动剂(7]。此外,乙醇激活G protein-gated内心整流K⁺通道(GIRK) (8]。一个假定的alcohol-binding口袋位于胞质域GIRK通道被建议的8]。,alcohol-binding口袋被认为是类似于特定alcohol-binding口袋里的气味结合蛋白的描述黑腹果蝇(8- - - - - -10]。

在我们最近的研究表明,糖酵解酶如丙酮酸激酶(肌肉和肝脏同功酶)也可以直接抑制很高(500毫米)剂量的乙醇(11]。考虑乙醇形成氢键的能力和参与极地,cation-pi,和疏水相互作用的蛋白质,它是非常重要的检查是否对某些酶的活动直接或间接的。直接影响是乙醇的物理的结果绑定在特定绑定的口袋里的蛋白质(8]。间接影响不是由于乙醇的物理结合的蛋白质的兴趣。相反,乙醇可能通过改变流动的脂质双分子层8),通过神经或激素调节,通过与其他蛋白质结合,甚至DNA (12),等等。

本研究的主要目的是找出乙醇是否能直接抑制肌肉和肝脏磷酸果糖激酶活动。这个问题的答案是积极的:高浓度的乙醇降低磷酸果糖激酶活性在体外。解决第二个问题是是否直接磷酸果糖激酶的抑制乙醇可能与急性酒精中毒的影响,酶的活性?根据我们的结果,抑制急性酒精中毒后的肌肉磷酸果糖激酶活动不是一个后果的直接抑制乙醇。肌酶可以直接抑制乙醇只有500毫米。直接抑制肝脏磷酸果糖激酶发生时乙醇的浓度达到100毫米,所以有可能摄入5.0克每千克后乙醇可以直接抑制其活动。

不同结构的肌肉和肝脏磷酸果糖激酶变构ADP-binding网站已经进行了讨论。因为这些差异的乙醇可以直接抑制肝脏磷酸果糖激酶活性在低浓度的情况下肌肉同系物。

2。材料和方法

急性酒精中毒已经建模在20两老鼠(男性,180 - 220 g),七大鼠作为对照组。所有的老鼠都禁食11小时前乙醇(或equivolume 0.9%氯化钠)承认通过胃插管。七老鼠收到25%的乙醇水溶液的剂量每公斤体重1.0克;七大鼠25%乙醇用量的每公斤体重2.5克;和八个老鼠收到25%的乙醇用量的5.0克/公斤体重。老鼠1小时后被斩首的乙醇或盐的摄入量。乙醇在这项研究中使用的剂量(1.0,2.5,和5.0克/公斤体重)标准实验在急性乙醇中毒的后果13- - - - - -15]。

乙醇的用量等于5.0克每千克体重广泛用于研究重型急性酒精中毒的影响。根据不同的资料来源,通过胃插管剂量乙醇导致80.43毫米(14,16)或108.0±2.3毫米(17血浓度峰值。

乙醇的用量等于2.5克每千克体重用于急性模型平均剂量酒精中毒。血浓度峰值后一个每公斤2.5 g乙醇摄入不同从23.9±11.3毫米18),39.3±10.0毫米(19),40.43毫米14)55.0±7.1毫米(20.]。

乙醇的用量等于1.0克每千克体重对应于低剂量急性酒精中毒。峰值剂量乙醇后血液中酒精含量发生显著的变化:7.2±0.43毫米(13),11.8±1.4毫米(21),15.9±2.2毫米(22),18.3±1.0毫米(23]。

在体外实验直接乙醇影响磷酸果糖激酶活动已经完成六大鼠肝脏和肌肉组织的上层清液(男性,180 - 220克)。我们进行实验和四个最终的乙醇浓度(5、50、100和500毫米)。的最低浓度乙醇中使用在体外实验(5毫米)对应的最低剂量乙醇(每公斤体重1.0克)在活的有机体内实验(13]。50 mM的浓度可以建立乙醇摄入2.5克每千克后(20.]。100毫米的浓度对应每公斤5.0 g乙醇管理(17]。最高浓度的乙醇(500毫米)也用于研究直接乙醇对酶活性的影响,即使浓度不能成立在活的有机体内。

肝脏和肌肉组织中均质玻璃均质器。离心后的上层清液已经获得匀浆。

磷酸果糖激酶的酶活性在肝脏和肌肉组织的上层清液Undervud和Newsholme提出的衡量方法24)(fructose-bisphosphate醛缩酶、alpha-glycerophosphate脱氢酶和triosephosphate脱氢酶耦合试验)。孵化混合物包含70毫米tris-HCl缓冲pH = 8.2;AMP约2毫米;EDTA约1毫米;0.2毫米NADH;1毫米2-merkaptoethanol;0.3毫米KCN;5毫米MgCl₂;50微克fructose-bisphosphate醛缩酶;10微克的alpha-glycerophosphate脱氢酶,10微克的triosephosphate脱氢酶。所有探测器都孵化10分钟25°C。然后,fructose-6-phosphate(最终浓度等于1毫米)和ATP(最终浓度等于1毫米)被添加到测试探针。Fructose-6-phosphate没有添加到控制探针。吸收的控制在340纳米探针测量“太阳能”分光光度计。然后,测试探针进一步孵化20分钟20°C。活动从不同的吸光度计算的测试和控制探测器在340海里。活动中表达nmol每毫克每分钟组织基质(nmol /毫克/分钟)。

有两个x射线结构磷酸果糖激酶(3 o8n和3 o8l)提交给蛋白质数据银行(http://www.pdb.org/)。这两个PDB文件描述兔肌肉磷酸果糖激酶(2]。3 o8n文件,有三种分子的ADP绑定到三个不同的网站一个磷酸果糖激酶(2]。我们使用3 o8l文件作为模板来构建三维模型的人类和老鼠的肌肉和肝脏酶同源,因为在这个文件有两个ATP分子和一个ADP绑定到蛋白质分子(2]。的三个结合位点被认为是特定的不为ADP和ATP绑定(2]。

瑞士模式服务器(25)(http://swissmodel.expasy.org/)已经被用于建模基于他们的老鼠和人类酶氨基酸序列从基因库(NP_001160158;AAH94212.1;NP_002617.3;NP_037322.1)。

对接服务器(26,27)(http://www.dockingserver.com/)已经被用于乙醇的分子对接,ADP,和ATP磷酸果糖激酶的3 d模型,以及乙醇的郁郁葱葱的蛋白质的对接黑腹果蝇(1现钞)。服务器自动使用面积为ADP对接,包括一个特定的网站绑定磷酸果糖激酶和ethanol-binding口袋里郁郁葱葱的。为每个对接有10分。我们计算平均水平的自由能绑定的10分。然后,我们根据下面的公式计算结合常数 在这个公式,是一个有约束力的常数,是一个免费的能量绑定(千卡每摩尔),是一种气体常数(1.99·10⁻³千卡每摩尔·K),是一个温度(310 K)。

我们使用所有可用的序列运用数据库的磷酸果糖激酶(28]。如果有不同方向对称压力突变的序列相同的对齐,进化距离他们通常变得更高29日]。为了避免这个问题,我们排除了那些GC-content第三密码子序列位置(3 gc)低于50%11]。此外,我们排除了部分序列(从七鳃鳗基因组除外)和序列区域不能正确对齐。最后,我们排除了序列从不同种类的鱼,因为有几个副本的组织磷酸果糖激酶基因。

文昌鱼(文昌鱼floridae同系物的磷酸果糖激酶(XM_002607302)从脊椎动物被发现的帮助下爆炸搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

序列已经被肌肉对齐算法包括大型5项目(30.]。我们计算JTT氨基酸进化序列之间的距离(31日]。系统树图已由UPGMA方法(31日]。

3所示。结果与讨论

活动的肌肉和肝脏磷酸果糖激酶被平均和高剂量抑制乙醇(见表1)。活动的肌肉磷酸果糖激酶入学后已经下降了1.23倍2.5克乙醇每1公斤体重和入学后的1.48倍5.0克/公斤。肝脏磷酸果糖激酶活性已下降约1.43倍后入学平均和高剂量的乙醇(见表1)。

结果表明,饮酒(包括急性和慢性)导致ATP水平的降低和增加细胞(ADP水平32,33]。所以,期间ATP / ADP比率就低酒精的摄入量。高浓度的ADP应该刺激影响磷酸果糖激酶的活性(2]。然而,我们的数据显示,活动的肌肉和肝脏磷酸果糖激酶可以在某种程度上减少了乙醇。这种减少酶的活动是可能的,以防代偿机制与ADP水平增加时没有工作(在急性酒精中毒)。

磷酸果糖激酶活性抑制的可能途径之一在急性酒精中毒可能与NADH / NAD升高有关⁺比率。乙醇消费导致NADH积累(酒精脱氢酶和醛脱氢酶产生NADH河畔⁺)[1,34]。异柠檬酸脱氢酶是由HADH水平升高,抑制柠檬酸允许增加水平(1]。柠檬酸是一种已知的抑制剂磷酸果糖激酶活性的3,34]。

正如我们先前所显示的,急性酒精中毒(5克/公斤体重)导致减少的肌肉和肝脏丙酮酸激酶活动(他们成为低1.47和1.35倍,分别地。)(11]。因为这个原因,磷酸烯醇丙酮酸水平应该增加在急性酒精中毒。磷酸烯醇丙酮酸磷酸果糖激酶活动是一个已知的抑制剂(3]。最有趣的关于由柠檬酸、磷酸烯醇丙酮酸磷酸果糖激酶活性抑制的事实是这些物质需要足够的ATP水平的行动3]。换句话说,柠檬酸和磷酸烯醇丙酮酸可以抑制磷酸果糖激酶活性当ATP水平相对较高(3]。这些条件可以建立在急性酒精中毒。

乙醇的抑制作用的本质在肌肉和肝脏磷酸果糖激酶活动中观察到在活的有机体内实验已经澄清在体外实验(见表2)。活动的肌肉磷酸果糖激酶抑制了500毫米的乙醇。这样一个活细胞内的高浓度的乙醇是不可能的。这意味着尽管乙醇可以直接与肌肉磷酸果糖激酶和抑制其活动,这样的直接抑制作用是可能的在体外。

肝脏磷酸果糖激酶活性显著地抑制了100毫米乙醇(见表2)。乙醇的浓度非常高,它可以建立在大量饮酒后活细胞(100毫米等于4.6‰)。众所周知,血液中酒精含量超过5‰是致命的。然而,也有一些已知的情况下,血液中酒精含量在8 - 10‰(35]。所以,直接抑制肝脏磷酸果糖激酶活性可能在人类的摄入高剂量的酒精。

血液酒精浓度峰值在老鼠摄入5.0克每公斤的乙醇可能达到108.0±2.3毫米(17]。因此,抑制作用的急性酒精摄入可以直接。这意味着抑制肝脏磷酸果糖激酶活性高剂量的酒精摄入后可能发生的,因为两个直接和间接的机制(可能是由于抑制枸橼酸和磷酸烯醇丙酮酸的存在足够的ATP浓度)。

ADP是磷酸果糖激酶的变构激活(PFK) [2]。ADP绑定的网站包括Asp173、Met174 Asp179, Tyr214, Phe308, Asn341, Ser377, Asn381, Phe538, Asp543, Phe671残留2]。据ADP的分子对接结果模型大鼠和人类肌肉和肝脏磷酸果糖激酶,所有这些11个氨基酸残基预计ADP的绑定。苯丙氨酸残基(Phe308 Phe538和Phe671)可以参与cation-pi或疏水性与腺嘌呤的交互。Asp543能够与nh氢键₂腺嘌呤。

可以看到在图1、乙醇可能受ADP的相同部分结合位点能够绑定腺嘌呤,至少,在模型大鼠肌肉磷酸果糖激酶。三苯丙氨酸残基(Phe308、Phe538 Phe671)能够参与疏水或cation-pi交互与乙醇,而Asp543通常参加极地交互。

以同样的方式,乙醇可以停靠的腺嘌呤绑定口袋ADP结合位点模型的大鼠肝脏磷酸果糖激酶(见图2)。尽管乙醇的位置在两个酶的变构部位相似,有一些差异。乙醇对接的变异老鼠肌肉磷酸果糖激酶总自由能最低的约束力,所发挥的主要作用是Phe538(自由能量来分解的绑定=−0.4589千卡每摩尔)和Asp543(−0.4915千卡每摩尔)。在乙醇的最佳对接鼠肝脏磷酸果糖激酶,所发挥的主要作用是Val545(−0.3043千卡每摩尔)。Val545参与疏水与乙醇的交互。

可以看到在图3,从肝脏磷酸果糖激酶Val545与Leu546肌肉磷酸果糖激酶。Val545似乎更适合比Leu546疏水与乙醇的互动。Ala542从肌肉磷酸果糖激酶,它有一个积极的自由能绑定与乙醇。这个地方被Ser541 Ala542的肝脏磷酸果糖激酶。所以,一些线性部分的氨基酸替换预测乙醇结合位点可能会影响其配体的结合(参见图的能力3)。

有趣的是提到已知ethanol-binding的郁郁葱葱的蛋白质(根据1力量[9),3 b7a, 3 b86 [103 d结构)还包括疏水氨基酸与ch交互₂ch₃尾巴的乙醇(Val58和Phe113)。然而,乙醇分子的亲水部分(-哦组)使氢键和Ser52 Thr57残留郁郁葱葱的9,10磷酸果糖激酶),而在案例中,这个群体参与cation-pi和极地的交互。

平均自由能绑定的ATP、ADP和乙醇在表3。重要的是要强调自由能的绑定ADP低于ATP。作为一个可以看到表4,ADP和ATP结合常数的差异相当高。所以,ADP绑定的网站应该是非常具体的2]。

平均自由绑定为乙醇的能量大约是3.3倍的ADP如果我们谈论的是肌肉磷酸果糖激酶。肝脏磷酸果糖激酶,平均自由能绑定ADP低于3.0倍的乙醇。肝酶结合乙醇比肌肉酶,而肝酶结合ADP比肌肉酶(见表3和4)。

当然,绑定常量比常数对ADP乙醇要低得多。它意味着乙醇可能以某种方式结合ADP别构部位,但只有在高浓度。事实上,结果在体外实验支持的数据表4:乙醇浓度应该为肝脏和500毫米100毫米和更高和更高的肌肉磷酸果糖激酶。

另一方面,郁郁葱葱的蛋白质的平均自由能源乙醇绑定−2.03千卡/摩尔,也就是8.5%低于平均自由能模型绑定的人类肝脏磷酸果糖激酶(9.6%低于模型鼠酶)。乙醇绑定郁郁葱葱的蛋白质的常数(26.86)是1.29倍人类肝脏磷酸果糖激酶的模型(1.33倍模型大鼠的肝脏磷酸果糖激酶)。有趣的是,根据服务器对接结果郁郁葱葱的蛋白质和乙醇,氢键形成的自由能量来分解Ser52(−0.1157千卡每摩尔)低于分解的疏水相互作用自由能Phe113(−0.4007千卡每摩尔)和Val58(−0.2221千卡每摩尔),虽然Thr57提到其它氨基酸参与互动(−0.0404千卡每摩尔)。乙醇绑定的数据通过一个高概率描述的非特异性的肝脏磷酸果糖激酶在这项研究中,和为特定的结合位点的郁郁葱葱的接近那些ADP-binding模拟酶的口袋里。

在我们看来,肝脏磷酸果糖激酶直接被低浓度的乙醇比肌肉磷酸果糖激酶因为某些氨基酸替换固定的线性结合位点的一部分。散度的肌肉和肝脏磷酸果糖激酶发生在数百万年前周期在713.2和535.7之间(缅甸)之间的分歧就像肌肉和肝脏丙酮酸激酶(11]。可以看到在图4文昌鱼的蛋白质同源磷酸果糖激酶的脊椎动物蛋白质组是一个外围集团。之间的分歧的时候文昌鱼和脊椎动物的前身是约713.2米娅36]。有组织(肌肉和血小板)磷酸果糖激酶的蛋白质组七鳃鳗(见图4)。这意味着三种类型的磷酸果糖激酶之间的分歧发生过七鳃鳗的散度和其他脊椎动物(535.7米娅(前36])。根据图的系统树图4、肌肉和肝脏磷酸果糖激酶显示比他们每个人彼此相似的同系物在血小板表达。

4所示。结论

可以抑制肝脏磷酸果糖激酶活性高剂量的乙醇(5克/公斤体重导致血100毫米和更高的峰值水平),由于乙醇的绑定的变构监管网站。

肌肉磷酸果糖激酶的活性也可以抑制由于乙醇的绑定在一个类似的网站,而配体的浓度所需的酶抑制(500毫米)高于任何可能的活细胞中乙醇浓度。

抑制肌肉和肝脏磷酸果糖激酶活动由一个平均剂量的酒精的摄入量(每公斤体重2.5克)是间接的,它可能是与NADH / NAD增加有关⁺比率。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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