文摘
我们研究了PGC-1的影响α(过氧物酶体proliferator-activated受体γcoactivator-1α)超表达人类骨骼肌细胞的氧化能力体外。PGC-1α超表达增加了棕榈酸的氧化速率和mRNA表达的基因调节脂质代谢、线粒体生物起源、人类肌管和功能。基底和刺激脱氧葡萄糖摄取减少,可能是由于upregulation PDK4 mRNA。快速光纤类基因表达标记(MHCIIa)下降。骨骼肌相比在活的有机体内,PGC-1α超表达多个基因的表达增加,表达下调过程中细胞的分离和培养。总之,PGC-1α过度的氧化能力增加培养肌管通过改善脂质代谢,增加表达的基因参与调控线粒体功能和生物起源的,和减少MHCIIa的表情。这些结果表明,旨在增加PGC-1疗法α表达可能在肥胖以及肥胖相关疾病的治疗。
1。介绍
肥胖的成因是多方面的。然而,有证据表明,减少能量消耗,特别是对利用脂肪代谢能力降低燃料是重要的因素,尤其是在体重减少状态(1]PGC-1α(过氧物酶体proliferator-activated受体γcoactivator-1α)是一个转录辅激活最初从褐色脂肪组织分离(2),但现在已知丰富在许多代谢活跃的组织,如骨骼肌、肝脏、心脏和大脑,PGC-1α在传导中起着重要作用的营养和生理刺激转录代谢和收缩反应(2,3]。
许多转录因子coactivated PGC-1α是核呼吸因子(NRF1/2) [4),肌细胞增强因子2 (MEF2) [4)和核激素受体的几名成员,包括过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR) subtypes-a家族的脂质核激素受体激活起着关键的作用在调节自适应调节肌肉脂肪酸氧化的5]。最常见的PGC-1的函数α跨组织的线粒体生理机能的调节,但除此之外,这个家庭辅活化因子控制的独立组织生物程序。在肝脏,PGC-1的表情α禁食和引起的强烈刺激肝醣类和酮生成6,7];心里,这是一个强有力的兴奋剂线粒体基因表达和生物转化(8),而PGC-1α缺乏大脑已被证明导致行为异常与轴突退化(9]。
在骨骼肌,PGC-1α被有效地诱导条件的增加身体活动(10- - - - - -15),当ATP需求高,诱导线粒体氧化功能就变得非常重要了为了适应和维护整个身体能量平衡。通过PGC-1增强线粒体功能和生物转化的发生αcoactivation核呼吸因子(NRF) (16),参与氧化磷酸化和调节基因是通过与estrogen-related受体的相互作用介导的α(犯错α)[17]。此外,适应增加收缩活动涉及转换从II型(快抽搐)I型(慢抽搐)纤维18),这一过程也证明是由PGC-1驱动的α在转基因动物16),而阳性PGC-1敲门α在动物中已被证明导致转换I型和II型肌纤维,运动不耐受,减少线粒体蛋白质和肌病(19]。还在初级骨骼肌细胞从老鼠,PGC-1超表达α可以授予一个开关向更加慢肌纤维表型(20.]。此外,过度PGC-1α改善脂质利用率、胰岛素信号和葡萄糖运输在活的有机体内动物研究[21,22),而全身PGC-1超表达α似乎有相反的影响肝脏和肌肉胰岛素敏感性(23]。在细胞培养的啮齿动物肌管(C2C12和16种),PGC-1超表达α已经被证明可以有效地调节胰岛素的水平葡萄糖转运蛋白4 (GLUT4) mRNA和葡萄糖摄取24]。
过氧物酶体proliferator-activated受体δ(PPARδ)是由PGC-1 coactivatedαin体内和在体外,与增加脂肪酸氧化(25]。此外,PPARδ,连同PGC-1α,已被确定为一个关键球员在细胞水平上协调运动的影响(16,26,27),建议作为代谢综合征的治疗的新目标(28]。
培养肌管是一个有用的工具在细胞水平上研究代谢过程,但有限的有用性,它们的特点是糖酵解属性(29日,30.]。PGC-1α被称为“主调节器”的线粒体生物起源的协调,主要是因为增加PGC-1吗α可以激活转录因子开关肌肉细胞对氧化代谢(31日- - - - - -33]。然而,PGC-1显著减少α在肌肉细胞培养相比,水平在活的有机体内肌肉提取物已经被报道在鸡34],PGC-1的角色α在骨骼肌代谢过程在体外之前一直强调使用adenoviral超表达在细胞培养24),但数据描述PGC-1代谢的影响α超表达在人类骨骼肌细胞主要是有限的35]。
当前工作的目的是研究是否过度PGC-1α在人工培养的骨骼肌细胞健康个体将增加细胞的氧化能力,促进纤维类型转换,增加线粒体生物起源的相关基因的表达和功能。此外,我们想比较讲究的骨骼肌肌管体内。最后,PGC-1之间可能的相互作用α超表达和PPAR的药理活性δ脂肪酸氧化和脂质代谢的关键基因的表达进行了研究。
2。材料和方法
2.1。材料
DMEM-Glutamax、FCS Ultroser G, penicillin-streptomycin-amphotericin B, trypsin-EDTA从生活中获得技术(英国佩斯利)。骨骼肌生长介质子弹工具包是来自Clonetics (BioWittaker, Verviers,比利时)。(3H]软脂酸(2.0 GBq /更易)和2-deoxy-D - (3H]葡萄糖(222 GBq /更易)从杜邦NEN购买生命科学产品(美国波士顿)。棕榈酸,BSA(实质上是脂肪无酸的),细胞松弛素B,和细胞外基质凝胶从西格玛化学品购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。胰岛素Actrapid是诺和诺德公司(Bagsvaerd、丹麦)。RNeasy迷你工具包和RNase-free DNase买来试剂盒科学(挪威奥斯陆)。引物从英杰公司购买(挪威奥斯陆)。高容量cDNA档案箱,SYBR绿色TaqMan逆转录试剂包,TaqMan普遍PCR大师混合和微射流卡片从应用生物系统公司购买(沃灵顿、英国)。蛋白质分析工具从BioRad购买(丹麦哥本哈根)。标准的商业使用的所有其他化学物质纯度高质量。
2.2。人类骨骼肌活检和细胞培养
肌肉活检样本进行obliquus内肌腹或股外侧肌从七个健康的志愿者,和卫星细胞细胞银行成立。活检获得知情同意和批准国家研究伦理委员会(挪威奥斯陆)。肌肉细胞培养的成纤维细胞的方法建立了亨利et al。36]。短暂,肌肉组织解剖火腿的不会在4°C和分离介质由三个连续治疗0.05%胰蛋白酶/ EDTA和卫星细胞resuspended骨骼肌细胞生长中2% FCS, 50 U /毫升青霉素、50μ1.25 g链霉素,μg / mL两性霉素B,没有添加胰岛素。每个捐赠者的细胞分别培养井或烧瓶涂以细胞外基质凝胶(37]。1 - 2周后,在~ 80%融合,生长介质和2% FCS,取而代之的是DMEM 50 U /毫升青霉素、50μ1.25 g / mL链霉素,μg / mL两性霉素B,和25点胰岛素诱导分化成肌细胞的多核肌管。细胞培养在湿润有限公司5%2气氛在37°C,媒介是改变每2 - 3天。所有的肌管文化被用于分析在7或8天之后出现分化。
2.3。瞬态逆转录病毒载体生产
本研究中使用的三个逆转录病毒结构pBABE(空向量),pBABE-hPGC-1α和pBABE-zsGreen(积极控制感染疗效)。293 t / 17细胞转染前被播种8 h的密度每100 mm细胞培养皿中15毫升的DMEM 2毫米谷酰胺和10%胎牛血清(FCS)。转染了使用ProFection哺乳动物转染系统(Promega生物技术,瑞典)。DNA混合物被稀释后准备大量的质粒:16μ16 g的基因组,μg pVPack和8μg pME-VSV-G 438μL蒸馏水/ 100毫米培养皿。转染前十五分钟,65.5μL CaCl2和500年μL玫瑰被添加到DNA混合物,1毫升的DNA / CaCl2/玫瑰然后添加到每个培养皿。细胞被允许孵化湿润5%股份有限公司2气氛在37°C 24 h,当介质换成10毫升新鲜prewarmed DMEM与10毫米丁酸钠(每100毫米培养皿)和孵化有限公司5%2大气和37°C的额外6 h。中被删除,和新鲜的培养基没有添加丁酸钠,细胞培养另一个16 h。媒介是收集和上层清液透过0.45μ米孔隙过滤和直接用来感染培养的成肌细胞。描述协议应用相同的生产三个逆转录病毒结构:pBABE pBABE-hPGC-1α,pBABE-zsGreeen。
2.4。逆转录病毒感染人类成肌细胞培养
感染培养的成肌细胞病毒上清液为100%的2μ24 h g / mL聚凝胺给飞行员实验感染效率最高,而这些条件选择进一步感染。培养成肌细胞被播种密度8000 - 14000(取决于增长率)细胞/厘米2感染后1 - 2天播种和2毫升100%(每在6-well板)逆转录病毒上清液包含pBABE(空向量),PGC-1α或pBABE-zsGreen(积极控制)的2μg / mL聚凝胺,孵化24 h。之后,媒体“(分泌物)取代Clonetics SkGM-BulletKit没有胰岛素。细胞被允许达到~ 80%融合,当介质与2% FCS,取而代之的是DMEM 50 U /毫升青霉素、50μ1.25 g / mL链霉素,μg / mL两性霉素B和25点胰岛素诱导分化成肌细胞的多核肌管。所有实验肌管文化进行7或8天之后出现分化。准确度和GW501516或控制(DMSO)进行实验前48小时。
2.5。棕榈酸吸收和氧化
肌管生长在six-well盘子洗了3毫升的PBS和接触3H]软脂酸(50μ0.5米,μCi在PBS /毫升0.5%脂肪酸免费白蛋白(BSA) 1毫升/),在湿润有限公司5%2气氛在37°C。30或60分钟的孵化后,肌管被放置在冰,和孵化中被转移到新瓶和化验标记为酸溶性代谢物(asm)如前所述38]。简单地说,孵化中是添加150年沉淀的μL BSA和80年的20%μL 1 M高氯酸和离心两次(20000克,5分钟,4°C)。计算了浮在表面的放射性液体闪烁。不允许控制包括在内。细胞被洗两次与PBS和细胞溶解在0.3毫升每(哺乳动物蛋白质提取试剂、热科学)。细胞相关放射性物质由液体闪烁测量。PA吸收被计算为ASM的总和(没有细胞控制校正)放射性介质和细胞相关的细胞。蛋白质含量测定采用BCA化验(皮尔斯)。
2.6。脱氧葡萄糖运输和糖原的合成
肌管在无血清DMEM培养60分钟和5.5毫米葡萄糖,有或没有10μM细胞松弛素B在37°C。脱氧葡萄糖吸收测量了15分钟的10μM标记脱氧葡萄糖(1μCi /毫升)2-deoxy-D - [3H]葡萄糖在葡萄糖吸收缓冲(140毫米氯化钠20毫米玫瑰5毫米氯化钾,2.5毫米MgSO41毫米CaCl2,pH值7.4)。孵化后,细胞被洗了三次冰冷的PBS和细胞溶解米/ 0.3毫升、和放射性物质由液体闪烁计数。Noncarrier介导葡萄糖运输确定的细胞松弛素B (10μ米),并从所有的值减去。测量的糖原合成、肌管被孵化2 h (37°C, 5%的股份有限公司2)在无血清DMEM(±100海里胰岛素),在加入DMEM 2μCi /毫升D - U -14C]葡萄糖100纳米胰岛素存在与否的60分钟。60分钟后,细胞被洗了三次冰冷的PBS和细胞溶解1 M氢氧化钠。所述合成糖原测定(39]。糖原合成线性增加胰岛素刺激后4小时内,作为纳摩·mg细胞蛋白质−1·h−1。每个样品的蛋白质含量测定蛋白质根据布拉德福德使用BSA作为参考。
2.7。RNA分离和分析基因表达的定量实时PCR
人类骨骼肌活检和肌管生长在6-well板细胞溶解在1毫升Trizole试剂(表达载体,奥斯陆,挪威)根据供应商的总RNA隔离协议。孤立的RNA是溶解在RNase-free水,浓度的分光光度测量在260海里。所有样品都在1%琼脂糖凝胶电泳评估核糖体乐队的完整性。
已经没有DNA总RNA从上面处理DNase(细胞,Ambion)去除污染前基因组DNA互补脱氧核糖核酸的合成。不久,0.1的10倍量DNase缓冲区,4 - 6单元DNase和水30μL是添加到每个样本。样本在37°C孵化40到45分钟。DNase失活试剂添加到每个样本,通过离心2分钟后在室温下孵化。
第一次执行链cDNA合成上标三世第一链合成系统rt - pcr(表达载体,奥斯陆,挪威)根据供应商协议。1μ克DNase治疗总RNA用于每个合成。启动的合成低聚糖来完成(dT)12 - 18。对于每一个消极的控制没有酶合成反应是设置。获得cDNA用于相对量化应用生物系统公司7700。定量实时PCR进行了使用TaqMan普遍PCR反应混合液或SYBR绿色PCR反应混合液(从应用生物系统公司)25μL反应运行在一式三份。模板的PCR从上面首次链cDNA(相当于做ng总RNA数量)。正向和反向引物和TaqMan普遍PCR反应混合液,标记探针,具体不同的基因,使用200 nM和400 nM)的浓度,分别为:CD36F: GGGAAAGTCACTGCGAC ATGA R: GAACTGCAATACCTGGCTTTTCTC,探针:TACAGATGCAGCCTCATTTC CACCTTTTGT;CPT1bF: GCGCTGGAGGTGG CTTT R: TCGTGTTCTCGCCTGCAAT,探针:AAACTCCATAGCCATCATCTGCTAC AGGGC;MCADF: TACTTGTAGAGCACCAAGCAATATCA R: TGCTCTCTGGTAA CTCATTCTAGCTAGT,探针:CAACTTTCATTGCCATTTCAGCCAGCATA;ATGLF: CGCACCTGTGCCTTAATCTTC R: GCTGCAAAGTTCTCAGGAGTAAAG;奥软F: C AGAAGATGTCGGAGCCCATA, R: GGCCAGTGCTGCTTCAGAC;PPARαF: CTCT CAGGAAAGGCCAGTAACAA R: TGGCCACCAGCGTCTTCT,探针:CACCTTTTG TCATACATGATATGGAGACACTGTGT;PPARγF: GTCACGGAACACGTGCAGC R: GCAGGAGCGGGTGAAGACT;PPARδF: TGCGGCAACTGGTCACC R: TCTCGGTT TCGGTCTTCTTGA;细胞色素CF: CTGCCAACAACGGAGCATT R: CGTGAGCA GGGAGAAGACGTA,探针:CACCATGCCTAGCTCGCACGATGTAG;COXIVF: CC GCGCTCGTTATCATGTG R: CACCCACTCTTTGTCAAAGCTTT,探针:CACTATGT GTACGGCCCCCTCCCG;SOD2F: GCTTGTCCAAATCAGGATCCA R: GCGTGCTC CCACACATCA;SOD3F: GGCCTCCATTTGTACCGAAA R: CGGGAGTCTCAGGGC TTATG;UCP-2F: TGAGCTGGTGACCTATGACCTCAT R: AGTGGCAAGGGAGGTC ATCTGT,探针:AAGGATGCCCTCCTGAAAGCCAACCT;ucp - 3F: CTGCTGGACT ATCACCTGCTCA R: CCACCACTGTGGCACAGAAG,探针:ACAACTTCCCCTGCC-ACTTTGTCTCTGC;犯错αF: GAGAGGAGTATGTTCTACTAAAGGCCTT R: GCCTC GTGCAGGAGCTTCT,探针:TCGGCTCATCTTCGATGTGCACAGAGTC,NRF1F: C ATGCGTTGAGCTACTGACAAAC。R: AGTCCAGCAGGGAGAGTTCTGT,mtTFAF: GCTGAAAGATTCCAAGAAGCTAAGG R: TTCAGAGTCAGACAGATTTTTTTCCAG-TT;MHCIF: CCAGACTGTGTCTGCTCTCTTCAG R: CAGGACAAGCTCATGCTCC,MHCIIaF: AAGGTCGGCAATGAGTATGTCA R: CAACCATCCACAGGAACAT CTTC。
为所有PCR反应,两种类型的消极的控制。尽可能控制放大的基因组DNA,没有酶互补脱氧核糖核酸合成的控制设置为所有primer-probe集。包括其他消极的控制是没有模板。所有信号都是标准化的看家基因36 b4。样本运行在7700年ABI棱镜使用默认的程序:首先,与50°C两个步骤2分钟和10分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。SYBR绿色PCR掌握混合使用时,PCR产品从一个在每一加载NuSieve 2.5%琼脂糖凝胶(BioWhittaker分子应用程序)来确认一个乐队在正确的大小。
2.8。免疫印迹
整除的20μg细胞蛋白质从细胞溶解产物总准备Laemmli缓冲electrophoretically分离在NuPage 4 - 12% (w / v) Bis-Tris凝胶(表达载体),其次是与特定的抗体免疫印迹(反OxPhos复杂IV,鼠标单克隆20 e8,猫。分子探针- 21248,抗细胞色素C、鼠标单克隆7 h8。从BD Pharmingen 2 c12猫。556433)。免疫反应性的乐队与ECL可视化免疫印迹检测试剂(Amersham国际)。
2.9。统计分析
所有统计分析使用GraphPad Prism 4.0为Windows (GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。双尾配对t测试进行了确定PGC-1的影响α超表达。所有值在数据呈现意味着±SEM。统计学意义是。基因分析,褶皱变化≥2或≤0.5被认为是表达水平的增加或减少,分别。
3所示。结果
3.1。逆转录病毒的超表达PGC-1α在人工培养的骨骼肌细胞
确定实验PGC-1改变α表达会影响氧化能力培养人类骨骼肌细胞、成肌细胞被感染48 h后播种。成肌细胞的图像采取积极控制感染病毒后48 h pBABE-zsGreen图所示1。没有形态变化与未感染控制细胞中观察到细胞感染空向量或PGC-1α(数据没有显示)。PGC-1α信使rna表达细胞感染PGC-1α提高150 - 200倍相比,细胞感染空控制向量(图2(一个))。在骨骼肌活检,PGC-1α信使rna表达是35-fold高于分化培养的骨骼肌细胞(图2 (b)),因此PGC-1αPGC-1减少感染恢复α信使rna表达在细胞培养观察。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.2。PGC-1α棕榈酸氧化过度增加
氧化的棕榈酸(PA)测量7 - 8天后出现分化。PA氧化率,测量酸溶性代谢物(ASM),显著增加了71% ()在细胞overexpressing PGC-1α而控制细胞感染空向量(图3(一个))。PA氧化率的细胞无毒性(4.3±0.7 nmol /毫克/ h)没有不同于细胞感染空控制向量(4.0±0.7 nmol /毫克/ h),表明观察增加脂肪酸氧化率(6.8±1.4 nmol /毫克/ h)是由于过度PGC-1α。过度的PGC-1α并不影响PA感染与细胞的吸收空控制向量(图3 (b))。
(一)
(b)
3.3。PGC-1α超表达对脂质代谢基因的mRNA表达重要的增加,线粒体生物起源、和功能
识别潜在的机制负责PGC-1的观察效果α超表达PA氧化,选择基因的mRNA表达编码关键酶调节脂肪酸运输、存储和氧化途径和线粒体功能检查(图4)。
(一)
(b)
(c)
在脂类代谢相关基因中,PGC-1α增加介导mRNA表达最明显的MCAD(中链acyl-coenzyme脱氢酶)(7.4倍),而且PPARα增加了3.2倍,CPT1b(碱palmitoyltransferase 1 b)和高速逻辑(激素敏感脂肪酶)2.7倍(图4(一))。相比之下,PPAR意味着MCAD mRNA表达水平α和CPT1b骨骼肌活检是24 - 22.5 - 191倍高于培养细胞,分别(表1)。水平的PPARγ,PPARδ和脂肪酸运输蛋白质CD36被PGC-1没有受到影响α超表达在人类肌管(图4(一))。
过度的PGC-1α导致显著增加在mRNA水平的几个呼吸链的重要组成部分:细胞色素C(4.5倍),第四考克斯(细胞色素C氧化酶(四)(3.6倍),SOD-2(超氧化物dismutase-2)(3.6倍),和SOD-3(2.9倍)(图4 (b))。蛋白质水平的细胞色素C和COXIV也增加细胞overexpressing PGC-1α相比这两个细胞感染空控制向量和未感染的细胞(图4 (c))。两个重要的基因参与调控线粒体生物起源的,犯错α(雌激素相关受体α)和mtTFA(线粒体转录因子),在PGC-1也明显增加α细胞,分别为3.6倍和2.2倍(图4 (b))。的表情NRF1(核呼吸因子1)和蛋白质UCP-2和ucp - 3 PGC-1似乎没有受到影响α超表达(图5 (b))。在活检,意味着mRNA表达细胞色素C的水平,考克斯IV,犯错α分别为9.1、5.0和7.0倍高于培养细胞,分别(表吗1)。
(一)
(b)
3.4。PPARδ刺激强PGC-1α全身的棕榈酸氧化
我们进一步检查是否PGC-1的影响α超表达对脂肪酸代谢在人类肌管可能会同时刺激PPARδ,一个已知PGC-1的目标αcoactivation [25]。我们使用一个高度有效的和有选择性的PPARδ受体激动剂,GW501516 [40),我们以前所示增加油酸氧化的速率在人工培养的骨骼肌细胞(41]。在肌管overexpressing PGC-1α48 h (GW501516 (10 nM)治疗似乎加强PA氧化(从7.6±1.7 nmol /毫克/ h到18.2±5.9 nmol /毫克/ h)与肌管感染空向量(从4.6±0.1 nmol /毫克/ h到9.5±2.2 nmol /毫克/ h)(图5(一个))。在mRNA水平,PPAR的累加效应δ通过GW501516 PGC-1激活α全身CPT1b表达式(图5 (b))。在线粒体功能相关基因的表达(细胞色素C, COXIV,犯错αUCP-2, ucp - 3)没有受到GW501516治疗(数据未显示)。
3.5。过度的PGC-1α减少葡萄糖运输
为了进一步评估PGC-1代谢的影响α超表达,葡萄糖运输和糖原合成测量。在细胞overexpressing PGC-1α相比,脱氧葡萄糖摄取减少细胞感染空向量(图6(一))。脱氧葡萄糖运输率持平在细胞感染空控制向量相比细胞无毒性(31.7±8.9 nmol /毫克/分钟和33.3±9.3 nmol /毫克/分钟,职责),虽然它下降到15.6±8.9 nmol /毫克/分钟肌管overexpressing PGC-1α。胰岛素的葡萄糖摄取增加了约25%在控制细胞和细胞overexpressing PGC-1α(图6(一))。糖原合成也引起胰岛素,但无论是基础还是insulin-induced PGC-1糖原合成受到影响α超表达(图6 (b))。GLUT1 mRNA水平被PGC-1未受影响α表达,而GLUT4 mRNA水平增加6倍(图6 (c))。PDK4(丙酮酸脱氢酶激酶4)在PGC-1也明显增加α感染细胞(3)(图6 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.6。PGC-1α过度表达降低纤维IIa基因标记
评估PGC-1的角色α光纤类基因标记肌小管中,我们进一步研究了基因的表达特别丰富的I型(缓慢)纤维(MHCI)或IIa (fast)纤维(MHCIIa)。MHCIIa mRNA的表达明显减少细胞overexpressing PGC-1α()(图7),而MHCI mRNA水平并没有显著的增加。因此,MHCI / MHCIIa mRNA比在细胞几乎翻了一番overexpressing PGC-1α而控制细胞感染空向量(从3.4到5.9,职责)。
4所示。讨论
本研究的目的是确定转录辅激活PGC-1的过度α会增加氧化能力的人类骨骼肌细胞和骨骼肌比较这些细胞吗在活的有机体内。PGC-1α过度增加棕榈酸氧化、调节脂质代谢的关键基因的表达:CPT1b, MCAD, PPARα和高速逻辑,以及基因参与线粒体功能和生物转化。骨骼肌相比在活的有机体内,PGC-1α过度增加表达的几个基因表达下调过程中细胞的分离和培养。此外,我们的研究结果表明,吸收的葡萄糖在骨骼肌细胞感染PGC-1α下降,而PDK4 mRNA表达的增加,以及GLUT4的mRNA水平。此外,当PGC-1α过表达,MHCI的mRNA水平之比(I型的基因标记,缓慢氧化纤维类型)的MHCIIa(糖酵解的基因标记,增大骨骼肌纤维)是增加。
人类的主要肌管保留一些成熟的骨骼肌代谢特点,但通常是有限的,在体外通过他们的低氧化能力(29日,30.]。这是PGC-1的差别可能是由于对这些α和缺乏线粒体在缺乏必要的细胞扩散环境信号。在目前的研究中,棕榈酸氧化的速率是PGC-1时显著增加α过表达;影响不能归因于增加吸收介质的棕榈酸,这是不变的。棕榈酸的氧化速率的增加伴随着增强关键基因的表达调控脂质氧化:CPT1b MCAD, PPARα。ATGL已被证明是调节人类骨骼肌运动后(42),连同intramyocellular甘油三酯的利用率的增加了,而蛋白质水平的高速逻辑保持不变(42,43]。在目前的工作,ATGL和高速逻辑mRNA水平增加了1.6和2.4倍,分别PGC-1时α过表达。有趣的是,一个在活的有机体内研究表明,在人类骨骼肌,ATGL表达只在I型(氧化)纤维44),所以upregulation这个基因可能表明转向更多的纤维类型我喜欢当PGC-1肌管α是过表达。
PGC-1α被证明能增加线粒体生物起源由几个细胞机制(10,26,45- - - - - -47)和改善脂质氧化轻快在休息和高频运动。我们发现几个组件的呼吸链在mRNA水平增加,如细胞色素C和COXIV和蛋白质含量的增加这两个组件也通过免疫印迹(图相比4 (c))。mtTFA, PGC-1下游转录因子α,mtDNA复制的关键48),也略有增加,这表明线粒体可能会增加当PGC-1生源论α是在培养人类肌管。此外,超氧化物歧化酶(杆)研究了在目前的研究中,线粒体SOD-2和细胞外SOD-3 PGC-1时在mRNA水平调节α过表达。杆催化超氧化物阴离子为过氧化氢和氧气的减少,造成抗氧化防御的几乎所有细胞暴露于氧气,和最近的研究结果表明,SOD-2超表达小鼠保存成肌细胞线粒体质量与衰老和功能(49]。
最近,PGC-1α和PPARδ已确定为关键球员exercise-signaling级联导致线粒体生物起源(16,27]。在目前的工作,我们也想调查是否一些PGC-1的影响α超表达对脂质代谢及线粒体功能可以被同时激活内源性PPAR强δ选择性受体激动剂GW501516。PPARδ刺激增强PGC-1出现α棕榈酸氧化介导的增加和CPT1b表达式。PPAR的影响δ激活的表达式CPT1b与结果一致在体外研究使用鼠标肌管(50]。在我们的研究中,我们看不到任何PPAR的效果δ激活线粒体功能基因的表达,这与所报道阳性VP16-PPARδ转基因老鼠而不是转基因老鼠overexpressing本机PPARδ蛋白质(27),在协议,结果发现在C2C12细胞(老鼠骨骼肌肉细胞)50),PPARδ激活并没有促进线粒体基因表达,即使它增加脂肪酸氧化,因为没有一个基因在电子传递链增加了PPARδ刺激。
两个PGC-1α和骨骼肌GLUT4往往缺乏培养细胞(24,34人类肌管),在主,基底葡萄糖吸收通常是由其他葡萄糖转运蛋白,如GLUT1和GLUT3 [51,52]。在目前的工作,人类肌小管基底葡萄糖摄入明显减少overexpressing PGC-1α,而GLUT1 mRNA表达不变。一项研究与adenoviral PGC-1超表达α在C2C12和16种细胞显示总恢复GLUT4 mRNA水平所观察到的在活的有机体内三倍增加,刺激葡萄糖运输(24]。在我们的研究中,超表达PGC-1α导致增加GLUT4 mRNA但没有刺激葡萄糖摄取增加。mRNA水平的过剩和功能数据之间的矛盾在人类培养的骨骼肌细胞已报告之前(53- - - - - -55]。然而,有可能观察到的葡萄糖摄取减少可能是由于PDK4 mRNA水平的增加、丙酮酸脱氢酶复合体的抑制剂,交换机对脂质氧化。
肌纤维类型和氧化能力与肥胖和胰岛素抵抗更高比例的1型积极与肥胖与胰岛素作用和负(56,57]。此外,它已被证明与PGC-1转基因动物研究α似乎是一个重要的因素在调节肌肉纤维类型的决心16]。在目前的研究中,肌管PGC-1感染逆转录病毒编码α在增加MHCI / MCHIIa比基于基因标记分别我和IIa型纤维。据我们所知,光纤类成分的转变此前还没有人工培养的骨骼肌细胞所示。事实上,有一个倾向增加MHCI / MHCIIa比率表明一个更完整的可能性当PGC-1纤维类型之间的转换条件α在培养的骨骼肌细胞中过表达,也。
总之,在目前的研究中,超表达PGC-1α在培养人类肌管增加脂肪酸氧化能力的细胞,增加表达的基因参与调控线粒体的功能。骨骼肌相比在活的有机体内,PGC-1α超表达多个基因的表达增加,表达下调过程中细胞的分离和培养。我们还表明,快速光纤类基因的mRNA表达标记(MHCIIa)下降,这表明PGC-1α可能发挥作用在光纤类监管人类肌管。
利益冲突
所有的作者有利益冲突声明。
承认
这项工作是由奥斯陆大学和阿斯利康研发、瑞典。