小窝功能受损和Upregulation Intersectin-1s表达式的替代实验调制引起的内吞作用的途径在小鼠肺内皮

文摘

Intersectin-1s (ITSN-1s),包含五个SH3 (a e)域的一种蛋白质,通过SH3A dynamin-2的功能调节(dyn2)内吞作用的网站。ITSN-1s表达调制由脂质体在小鼠肺内皮交付质粒cDNA编码myc-SH3A或特定的核目标ITSN-1基因。SH3A-transduced和ITSN-1s——缺陷小鼠的肺血管灌注是用金子白蛋白(Au-BSA)分析电镜形态中间体和途径参与transendothelial运输或dinitrophenylated (DNP) bsa量化通过ELISA运输。急性调制ITSN-1s表达的小窝的数量减少,损害他们的运输,和打开interendothelial连接,而移植补偿非传统内吞作用的/ transcytotic结构。慢性抑制ITSN-1s进一步增加非传统中间体的发生和部分恢复了交界的完整性。这些发现表明ITSN-1s表达式需要小凹函数和高效transendothelial运输。此外,我们的研究结果表明,ECs高度适应执行他们的交通功能,同时保持肺内稳态。

1。介绍

ITSN-1s multimodular蛋白质,进化保守和广泛表达1,2];它由两个NH₂终端领域,中央卷曲螺旋域和连续5 COOH-terminal SH3域,SH3A-E, (3,4]。类似于直流发电机,ITSN-1s定位内吞作用的clathrin-coated坑和质膜小凹和同事优先小窝的颈部区域(5,6]。同时存在多个SH3和嗯域,最出名的内吞作用函数,以及ITSN-1s的亚细胞定位,导致早期假设ITSN-1s可能函数作为一个适配器/支架的内吞作用的机械(3,5]。后续研究表明,ITSN-1s能够绑定必不可少的内吞作用的蛋白质,Epsin1/2, Eps15 [7),神经元和广泛表达达因亚型,(3,5,6,8],stonin 2 [9,10),和信号蛋白RaIBP-associated Eps15-homology域蛋白(11),美索(12,13],5-phosphatase SHIP2 [14]。ITSN-1s同时绑定多个分子动力学和集群内吞作用的网站,创建一个高浓度的甘油炸药所需环形成的脖子内吞作用的囊泡(6,8]。这是一个至关重要的内吞作用的事件自达因GTPase活性变构依赖达因蛋白质浓度(15,16]和GTP-dependent自组装动力学的戒指的脖子崭露头角的囊泡在膜裂变中扮演着重要角色17,18]。蛋白质过度,丧失突变,击倒或敲除方法的关键作用提供了强有力的证据ITSN-1s在脚手架一般的内吞作用的机械、直流发电机的招聘,规定其功能的内吞作用的网站(6,8,16,19- - - - - -21]。证据可能ITSN-1s在监管中的作用的动力学函数在突触囊泡内吞作用已经被报道在不同的物种和实验条件(16,21- - - - - -23]。哺乳动物的直接同源ITSN-1s在秀丽隐杆线虫有负监管效应Dyn-controlled通路或直流发电机本身22]。果蝇的ITSN Dyn-associated蛋白质(Dap160),支架内吞作用的机械,促进有效的内吞作用通过维持高浓度的甘油炸药和允许的变构激活GTPase活性在突触15,16,23]。此外,在七鳃鳗巨头reticulospinal突触,急性摄动ITSN-Dyn互动的建议ITSN可以控制直流发电机的数量从突触囊泡释放集群periactive区,ITSN可能调节裂变clathrin-coated中间体(21]。ITSN-1s基因敲除小鼠的要求建立ITSN-1s高效突触囊泡内吞作用和贩卖20.]。此外,SH3A ITSN-1s领域有独特的能力调节Dyn2齐聚反应及其GTPase活性颈部区域的小窝(8]。过度的全身或截断ITSN-1s培养ECs造成了严重损害的小窝内吞作用的功能。这些细胞的电镜分析显示广泛的形态变化,如小窝多形性的脖子,他们中的许多人包围达因项圈,小窝集群、和膜受损裂变6,8]。SH3地区的表现,认为功能占主导地位的消极的方式通过隔离直流发电机离开小窝内吞作用的网站导致小窝数量显著下降(6]。最近的研究揭示了协会ITSN-1 arfaptin2, Src同源域生长因子3 receptor-bound 2 (endophilin)相互作用蛋白1 (SGIP1)和带/ Cip4同源蛋白质域只有1和2 (FCHO) membrane-deforming /弯曲活动必不可少的初始clathrin-coated坑成熟和有被小泡形成11,24,25]。

在目前的研究中,我们解决了在活的有机体内ITSN-1s在小凹函数的规定transendothelial运输实验调制ITSN-1s表达小鼠肺内皮。我们的研究结果提供的证据表明,ITSN-1s需要高效的小窝在transendothelial运输功能。此外,调制ITSN-1s表达式和随后的障碍的小窝内化和贩卖调节替代内吞作用的/ transcytotic途径来弥补不足小凹函数。

2。材料和方法

2.1。材料

胆固醇和二甲基溴化铵二酸双(DDAB)与牛血清白蛋白(BSA)从σ(圣路易斯,密苏里州)。MicroBCA蛋白质化验设备和增强化学发光底物(ECL)从皮尔斯(Rockfort, IL)。相应的抗体(Abs)购买如下:兔子anti-DNP多克隆Ab从英杰公司(CA)卡尔斯巴德,ITSN-1马伯从BD转导实验室(肯塔基州的列克星敦),α肌动蛋白单克隆Abσ,myc马伯从细胞信号(丹弗斯,MA)。SureBlue储备三甲Microwell过氧化物酶底物和辣根过氧化物酶(合)共轭记者来自KPL(马盖)。HyBlot CL电影来自Denville科学Inc . (Metuchen NJ)。电子显微镜试剂都从电子显微镜科学(华盛顿,PA)。DNP-BSA,示踪剂和8 nm-BSA复合物准备在我们的实验室如前所述26,27]。完整的人类ITSN-1 cDNA(礼物Suzana de la Luna,基因组中心规定,UPF值,基于和Centro de Investigacion en红德心血管Raras (CIBERER-ISCIII),巴塞罗那,西班牙),被用作模板来生成c端myc-his-SH3A(残留740 - 806)(8]。SMARTpool试剂和ITSN-1 siRNA双[GGACAUAGUUGUACUGAAAUU(序列)和5′-UUUCAGUACAACUAUGU CCUU(反义序列)作为推倒ITSN-1s表达来自Dharmacon(拉斐特有限公司)。

2.2。动物

CD1雄性老鼠,6 - 8周大,20 - 25克重量,从杰克逊实验室(巴尔港,我),保持标准的住房和喂养条件下,。实验在麻醉下进行,使用氯胺酮(60毫克/公斤),乙酰丙嗪+ xylasine(2.5毫克/公斤)+(2.5毫克/公斤),和甲苯噻嗪(2.5毫克/公斤)0.1 - -0.2毫升PBS。所有实验都依法批准和执行准则拉什大学机构的动物保健和使用委员会。

2.3。蛋白质的提取

小鼠肺组织中均质缓冲区包含150毫米氯化钠,50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8.0和蛋白酶抑制剂;总溶解产物被添加NP-40准备,最终浓度为1.0%,2 h,在4°C。贝克曼的明确导致溶菌产物离心桌面TLA-55转子离心器,45分钟,在4°C和45000 rpm。蛋白质浓度测定用BSA microBCA方法标准。

2.4。免疫印迹和微

等量的总蛋白(70μg / lane)受到4 - 20% SDS页面,转移到硝化纤维膜,然后进行免疫印迹分析(28),对ITSN-1s使用Abs, myc标签,以及肌动蛋白作为加载控制。使用一个适当的免疫反应性的乐队是可视化HRP-conjugated记者Ab和发射极耦合逻辑检测。HyBlot CL电影受到使用NIH ImageJ1.37v光密度分析软件。

2.5。Cationic-Liposome-Mediated交付Myc-SH3A和ITSN-1s siRNA老鼠肺部

阳离子脂质体被旋转蒸发准备使用DDAB和胆固醇脂的解决方案在氯仿中,在42°C,在真空下29日,30.]。脂质膜水化1 h RT在5%葡萄糖其次是声波降解法和无菌过滤通过0.47μm和0.22μm膜。然后,暂停挤压通过50 nm聚碳酸酯过滤器安装在miniextruder设备(Avestin, Inc .,加拿大),以确保单膜囊泡的形成。DNA-liposomes复合物是准备使用比8 nmol脂质体:1μg myc-SH3A DNA。ITSN-1基因表达失活在小鼠肺我们使用Dharmacon聪明的池试剂,如(19]。核糖核酸酶免费使用条件和试剂在沉默的实验。初步实验的小干扰rna序列进行识别聪明的池,最有效的消声ITSN-1s基因。短暂,siRNA序列推倒ITSN-1s蛋白表达第一次交付使用Dharmafect培养小鼠成纤维细胞转染试剂根据制造商的指示。目标序列5′-GAGAGAGCCAAGCCG GAAA-3′被发现最有效的差别在对这些ITSN-1s表达式在小鼠成纤维细胞,因此,用于生成siRNA双工在活的有机体内交付。此外,如果控制小干扰rna序列功能不属预定目标的5′-UAGCGACUAAACACAUCAA-3′被用作控制潜在的副作用引起的核转染小鼠成纤维细胞。

沉默ITSN-1s基因、核/脂质体复合体我们准备使用100年μg ITSN-1s /鼠标,1:3(卷/期)siRNA:脂质体比。小鼠静脉注射(尾静脉)与阳离子脂质体复合体、实现转导的具体myc-SH3A构造或击倒的ITSN-1s肺微血管。肺部收集在不同的时间点在第一次交付myc-SH3A质粒或ITSN-1s siRNA脂质体复合体监控myc-SH3A和ITSN-1s蛋白表达水平。

2.6。DNP-BSA和8海里Au-BSA灌注

DNP-BSA(10毫克/毫升)被灌注在26),评估肺血管通透性白蛋白控制老鼠,老鼠表达SH3A或ITSN-1s-deficient老鼠。的生化量化transendothelial运输是在26]。短暂,示踪剂灌注后,肺在PBS手剁碎和均质,使用Brinkmann polytron(1分钟、4°C)。匀浆是离心机(45000 rpm, 45分钟)获得最后的上层清液,将包含肺间质液和因此,肺interstitia DNP-derivatized组织运输。DNP-BSA的数量评估ELISA使用HRP-conjugated anti-DNP Ab后跟一个比色测定与三甲microwell过氧化物酶底物(26]。板块是在650 nm ELISA读者阅读。为定量评估DNP-BSA transendothelial运输,使用已知浓度的标准曲线生成DNP-BSA。每毫克ng DNP-BSA表达的数据归一化总蛋白质和10分钟。Au-BSA复合物(_520年= 1.0)灌注原位10分钟,释放示踪剂被3分钟刷新灌注使用含氧PBS (27]。

2.7。rt - pcr

小鼠肺总RNA提取用RNeasy迷你工具列DNase消化由RNase-free DNase组(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。使用高容量的互补脱氧核糖核酸合成反转录试剂盒(应用生物系统公司ABI,卡尔斯巴德,CA)。rt - pcr反应放大了35周期与适当的底漆为目标基因集,鼠标ITSN-1s ITSN-2s ITSN-2L,还有一个辅助的基因通过GoTag绿色主人混合(Promega圣路易斯奥比斯波,CA)。两个到10μL (PCR产品受到1.2%琼脂糖凝胶电泳和可视化使用Alpha Innotech AlphaImager II系统。引物配对(σ,密苏里州圣路易)用于PCR:鼠标ITSN-1s(转发:5′-CAGGCTTGAAAAGTCCTCAAA-3′,相反:5′-GGTGATCATGCTGGAAG TCA-3′);鼠标ITSN-2s(转发:5′-CTGGGCACAATGCAGCCTACG-3′,相反:5′ca AAAAGTTGCAGGCCGTCCA TG-3′),鼠标ITSN-2L(转发:5′-CCAGGACGTTCT GTGTCTCACTATG-3′,相反:5′-CAGTAGTAGTCGGCGGGTGGT-3′),还有和鼠标(转发:5′-GGCAAATGCTGGACCAAACAC-3′,相反:5′-TTCCTGGAC CCAAA ACGCTC-3′)。

2.8。实时qPCR

使用电力SYBR绿色PCR反应进行主混合在一式三份(ABI)和分析MyiQ单色实时PCR检测系统(Bio-Rad大力神,CA)。每个基因的相对表达水平是由一个数学计算δCt方法应用生物系统公司开发的。RNA的含量是规范化为所有时间点还有辅助基因和报告相对于控制老鼠的肺(设置为1)。

2.9。电子显微镜

8海里Au-BSA灌注小鼠肺是固定的原位通过15分钟4% (wt /卷)甲醛和戊二醛2.5% 1%鞣酸0.1管道缓冲pH值7.2,然后切除和固定为1 h RT,在相同的固定剂混合物。固定的肺被用来收集小的组织块加工电子显微镜的标准程序包括OsO的4%₄改变固定的(26,27]。选择标本在增加浓度的乙醇脱水,紧随其后的是氧化丙烯,嵌入在环氧树脂812。薄片从块安装在镍网格,然后沾醋酸双氧铀及柠檬酸铅,最后检查,在乔尔1220透射电子显微镜显微照片。

2.10。的形态学分析

的形态学分析正常和改变caveolar概况以及非传统的内吞作用的/ transcytotic结构进行如前所述[6]。简单地说,15 - 20部分每网格和3 - 5个网格块,从8 Epon812块,从控制和随机ITSN-1s siRNA-treated老鼠,。形态的外观是记录在150年显微图(×30000标准放大)为每个实验条件。长度的测量等离子体膜上的电子显微图使用了(31日]。数据规范化每100人μ米质膜和长度是三个独立实验的平均值±SD。

2.11。统计分析

数据比较用方差分析的方法之一,学生的以及与Bonferoni修正多个比较,双向方差分析。统计学意义是。

3所示。结果

3.1。实验操纵ITSN-1s表达小鼠肺

评估在活的有机体内ITSN-1s的作用在调节小凹函数在transendothelial运输我们调制ITSN-1s的表达质粒的脂质体在小鼠肺内皮交付cDNA编码SH3A域,或特定核双目标ITSN-1基因。Myc-SH3A DNA质粒:脂质体复合体,准备在材料和方法,描述了静脉注射小鼠肺中(29日,30.]。肺部收集在不同的时间点在第一次交付myc-SH3A lipoplexes监控myc-SH3A蛋白表达。免疫印迹的小鼠肺溶解产物使用myc马伯表示高效SH3A表达式,在48小时改变DNA治疗(图1(一))。ITSN-1s击倒,ITSN-1s siRNA的消声效果开始在48 h,很明显72 h改变siRNA管理和持续了一个额外的72 h,所评估的免疫印迹的小鼠肺溶解产物ITSN-1马伯(图1 (b))。ITSN-1s蛋白表达恢复168 h改变siRNA交付。肌动蛋白被用作加载控制。ITSN-1s击倒并不影响的表达caveolin-1 (Cav1),小窝的外套结构蛋白(32]。光密度分析表明蛋白质含量大于70%减少ITSN-1s在第三天,与野生型相比未经处理的小鼠(图1 (c)星号)。空的静脉注射脂质体并不影响ITSN-1s蛋白质含量(没有显示)。有效的可拆卸的ITSN-1s 72 h后siRNA交付进一步证实了实时定量PCR(图(q)1 (d))。ITSN-1s mRNA水平ITSN-1s siRNA-treated鼠肺样本超过三倍降低参照控制(图1 (d)星号)。交付空白脂质体(车辆)并不影响鼠标的mRNA水平肺,而未经处理的小鼠。得到更多见解ITSN-1s不足于小凹函数的影响我们也生成一个与慢性ITSN-1s抑制小鼠模型,通过反复的交付ITSN-1s siRNA脂质体复合体,每72小时,连续24天(图1 (e))。免疫印迹分析应用于小鼠肺的溶解产物ITSN-1s siRNA-treated表示连续击倒ITSN-1s 21天。准确的定量数据,我们再次使用qPCR分析。结果表明,真正的降价目标ITSN-1基因被引用还有大约三倍,基因(图作为标准1 (d),两个星号)。此外,常规RT PCR应用于肺癌样本准备从控制和ITSN-1s-deficient老鼠(图1 (f))表明,击倒ITSN-1s是具体的和有效的。ITSN-1s mRNA的表达没有检测到10天,15到24改变ITSN-1s siRNA交付,而ITSN-2s和ITSN-2L mRNA没有明显影响相比,未经处理的控制。这些小鼠模型产生的脂质体的cDNA质粒编码SH3A域和ITSN-1s siRNA被用于进一步的详细研究ITSN-1s内吞作用的功能。

(一)

(b)

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图1

μ μ μ 实验调制ITSN-1表达小鼠肺。(a) Myc-SH3A ITSN-1s领域是有效表达小鼠肺,在48小时改变质粒cDNA /脂质体复合体的交付。小鼠肺溶解产物(70g总蛋白/ lane)的控制和myc-SH3A-transduced老鼠受到4 - 20% SDS页面,转移到硝酸纤维素和免疫印迹myc Ab。(b) siRNA-mediated击倒的ITSN-1s老鼠肺部。肺溶解产物(70g总蛋白/ lane)的控制和老鼠注射脂质体/ ITSN-1s siRNA复合物解决在4 - 20% SDS PAGE和电泳图被转移到硝化纤维膜之后,免疫印迹和对ITSN-1 Abs,肌动蛋白(加载控制)和cav-1。注意ITSN-1s蛋白质的高效廉价的96 h,从第三天开始(3 d)改变核交付。(c)代表HyBlot CL电影的光密度分析表明,治疗ITSN-1s siRNA /脂质体复合体会使有效ITSN-1s蛋白在小鼠肺。(d)定量RT PCR ITSN-1s ITSN-1s mRNA的siRNA治疗小鼠肺。值归一化到内务还有基因和报告相对于控制肺(组1)。(e)长期抑制ITSN-1s表达式连续21天重复交付ITSN-1s siRNA脂质体复合体。肺溶解产物的控制和ITSN-1s-siRNA-treated老鼠采用Abs ITSN-1s和肌动蛋白免疫印迹分析,加载控制,在几个时间点改变交货,如表示。(f)的常规rt - pcr ITSNs亚型表达的小鼠肺。RT PCR反应放大所述在材料和方法使用适当的底漆为目标基因集,ITSN-1s, ITSN-2s ITSN-2L,还有一个辅助的基因。5 -L (PCR产品受到1.2%琼脂糖凝胶电泳和可视化使用Alpha Innotech AlphaImager II系统。所有数据显示是代表三种不同的实验,小鼠(3 /实验条件)。

3.2。急性ITSN-1s表达的扰动诱发多形性内吞作用的/ Transcytotic结构和小鼠肺血管通透性增加

一旦实现高效表达myc-SH3A, (48 h改变管理myc-SH3A质粒/脂质体复合体),DNP-BSA通过小鼠肺微血管灌注及其transendothelial运输由ELISA量化,如(26]。的表达导致小鼠肺内皮SH3A大于transendothelial DNP-BSA运输增加36%,而控制(图2(一个)),这表明破坏interendothelial连接(IEJs)。开幕式IEJs被灌注8海里Au-BSA进一步证实,在48小时改变myc-SH3A管理。电子显微镜分析运输通道紧随其后8海里Au-BSA从腔血管周的空间控制标本显示几乎独家示踪和小窝(图之间的联系2 (b))。10分钟灌注后,我们发现了示踪剂在血管腔,(图2 (b)t),囊泡开放腔的ECs(图2 (b)v1)内皮细胞质内的囊泡,可能在运输过程中在内皮(图2 (b)v2)囊泡放电负载的血管周的空间(图2 (b)、v3)和数量可变的血管周的空间(没有显示)。我们还确定的位置示踪IEJs。我们发现没有示踪交界资料或与他们abluminal退出;IEJs不渗透的示踪粒子,然而,生成过滤残留在腔的入祭文,(图2 (b)箭头)。相反,示踪粒子的transendothelial运输在小鼠肺内皮表达SH3A透露开放IEJs渗透Au-BSA复合物(数字2 (c),2(c1),箭头)和在某些情况下,沉重的金颗粒协会的abluminal退出IEJs(数字2 (c),2(c2))。有趣的是,在SH3A-expressing鼠标标本,小窝(数字2 (c),2(c3),2(c4),箭头)和clathrin-coated坑(数字2 (c),2(c7),箭头),长长的脖子,小窝的狭窄的脖子周围staining-dense项圈(数字2 (c),2(c5),2(c6),箭头)经常被观察到。clathrin-coated坑和细长的脖子是如图2 (c),2(c8)(盒装,插图)。除了小窝,大量的细长的元素和管式膜结构,其中许多由金颗粒标记(数字2 (c),2(c1),2(c9)(黑色盒装结构)和插页c9.1 c9.2)组成的小窝和涂布坑(数字2 (c),2(c9),2(c10),白色盒装结构)以及大型和不寻常的小窝集群(c10,箭头和插图c10.1)占领了细胞内的空间,在附近的等离子体膜。小管的直径介于25 - 60 nm之间,而他们的不同长度150纳米至600纳米(小管)。正如前面我们所示(33),管状的元素可能的一部分endosomal tubulovesicular网络,可能与细胞表面通过小窝和clathrin-coated囊泡。网络可能调节SH3A的表达式和急性ITSN-1s / Dyn2交互的干扰。观察也反映了膜裂变反应,因此受损,Dyn2功能受损的刺激效应对经济增长的动态管状结构作为细胞的报道缺乏Dyn1 / Dyn2 [34]。交付空白脂质体不影响小凹的形态和ECs(没有显示)。根据这些结果我们得出结论,在SH3A面前,类似于培养ECs (8],Dyn2 / Dyn2相互作用稳定,Dyn2功能受损和小窝不能分离的质膜形成囊泡的免费交通。因此,小窝功能受损引发动态管状结构的扩张来弥补缺乏运输通过小窝。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图2

内皮通透性增加,膜受损裂变,并增加非常规性内吞作用的发生/ transcytotic中间体在鼠标肺表达SH3A ITSN-1s领域。(a) ELISA应用于小鼠肺溶解产物控制,空的脂质体,灌注myc-SH3A-transduced老鼠和10毫克/毫升BSA-DNP, 10分钟。研究结果表示在ng BSA-DNP / mg总蛋白/ 10分钟。酒吧±SD。结果在4 - 5个不同的实验,每个实验条件有三个老鼠。(b)代表EM图像显示8海里Au-BSA transendothelial运输的控制老鼠的肺。示踪粒子检测血管腔,(t)在囊泡开放腔的ECs (v1),内皮细胞质内的囊泡,在囊泡(v2),放电的负载血管周的空间(pv;v3)。示踪粒子不渗透IEJ和生成过滤残留物(箭头),在腔内入祭文的结。酒吧规模:100海里。 (c) Representative electron micrographs showing transendothelial transport of 8 nm Au-BSA in SH3A-transduced mouse lung specimens as well as nonconventional endocytic/transcytotic intermediates in ECs expressing the SH3A domain of ITSN-1. Open IEJ permeated by 8 nm gold BSA complexes (c1) and heavy association of gold particles with the abluminal exit of an IEJ (c2). Caveolae (c3, c4, arrows) and clathrin-coated pits (c7, arrow) with very long necks, and caveolae with their narrow necks surrounded by staining-dense collars (c5, c6 arrowheads) were frequently observed. A clathrin-coated pit with elongated neck is shown (c8, boxed area, inset). Elongated elements and tubular membranous structures, labeled by gold particles (c1, c9, black boxed structures, c9.1, a9.2) and comprising caveolae and coated pits (c9, c10, white boxed structures) as well as large and uncharacteristic caveolae clusters (c10, arrow and inset). Bars: 200 nm—(c1), (c3), (c7), (c8), (c9.1); 100 nm—(c2), (c4), (c6), (c9), (c8) inset, (c10); 50 nm—(c5), (c9.2).

接下来,急性ITSN-1s缺乏的功能效应(72 h) 10分钟灌注肺微血管通透性进行了评估的10毫克/毫升DNP-BSA通过小鼠肺微血管构筑和量化ELISA DNP-BSA示踪剂的大量运送到肺interstitia,如上所述。我们观察到显著增加DNP-BSA运输ITSN-1s-deficient鼠标相对于控制(即。,472 ng DNP-BSA/mg total protein/10 min in knockdown mouse versus 328.3 ng DNP-BSA/mg total protein/10 min, in controls), consistent with endothelial barrier dysfunction, Figure3(a),我们进一步分析了电子显微镜的形态IEJs如果示踪,8海里Au-BSA,可以通过打开IEJs逃脱。详细分析超薄部分准备从随机选择小鼠肺标本敏锐地耗尽ITSN-1s IEJs显示经常开放。图的电子显微图3(c)显示了一个tricellular结一方显然是开放的。之间的IEJs EC2和EC3切片的组织不利于交界限制不能得出结论。相比之下,在控制标本(图3(b)) interendothelial空间是由紧密连接密封,这是最顶端IEJ结构(图3(b),箭头)。这些观察结果强烈表明,渗透率增加BSA-DNP ITSN-1s-deficient肺血管的鼠标是由于,类似于SH3A表达小鼠,开放IEJs的频繁出现。在ITSN-1s耗尽标本,与8海里Au-BSA灌注,水泡标签类似于控制的模式,(图2 (b))。控制的区别,我们发现开放IEJs大量标记在他们的长度由Au-BSA粒子。的形态学分析表明大约48%的IEJs数被8海里Au-BSA复合物(开放和渗透)。在控制条件下,主要在postcapillary小静脉,我们发现,大约30%的连接打开~ 6海里,从而使水、离子和小分子interstitia paracellular通路,数据协议(35]。鉴于Au-BSA复合物的尺寸(外径Au-BSA复合物(金+ BSA分子)大约是20海里),我们可以估计,连接被广泛开放:如果,例如,在一些地区,三个或四个黄金粒子被发现在同一平面图,标签交界空间,结的开放可以估计约60 - 80 nm宽。我们也发现金颗粒与abluminal退出结(数据3(d),3(d1),3(e))。广泛扩张的血管周的空间和丰富的蛋白质的水肿是另一个这些老鼠肺部(数据的表型特征3(d)4(一)、星号)。一个新的有趣的观察是多形性形态结构的频繁检测/中间体认为函数替代内吞作用的途径,如膜环(数字4(一),4(a1),4(e),4(e1),4(f)),其中许多都是装备了8海里Au-BSA粒子(数字4(一),4(a1))、小管和tubulovesicular开放腔(图元素4(b)、包装结构、4(c),4(e))或没有明显的与细胞外环境(数据通信4(b),4(c),4(d),箭头),扩大内吞作用的结构,其中许多融合典型的小窝,显然放电负载(图4(d),箭头)。戒指的范围在150 nm和400 nm直径(环)和显示一个狭窄的腔,(20 nm±4海里)。最后,显著降低小窝也观察到小鼠肺ECs数量不足的ITSN-1参照控制(表1)。这些发现强烈建议Dyn2招聘效率低下造成的内吞作用的网站ITSN-1s不足,由此而来的自由的小窝可以形成功能受损transendothelial运输,不仅破坏IEJs引起的,但也促使ECs鼠标肺血管移植和使用一些替代/补偿途径内吞作用的内化和transendothelial交通(表1)。管式元素的积累可能也反映了影响Dyn2招聘效率低下的内吞作用的网站,作为细胞缺乏Dyn1 / Dyn2[之前报道34]。Alltogether,调查结果表明,正常ITSN-1s表达对Dyn-mediated至关重要膜小凹的裂变反应,维持他们的运输功能的小窝号码和肺微血管ECs。此外,实验操纵ITSN-1s表达诱发替代内吞作用的/ transcytotic通路。

图3

增加内皮渗透性和受损interendothelial交界的完整性在小鼠肺内皮ITSN-1s敏锐地枯竭。(a) ELISA应用于小鼠肺溶解产物控制,空的脂质体,和ITSN-1s siRNA-treated老鼠(72 h改变siRNA),与10毫克/毫升BSA-DNP灌注,10分钟。结果在4 - 5个不同的实验,小鼠(3 /实验条件),并表示在ng BSA-DNP / mg总蛋白/ 10分钟。酒吧±SD。(b, c) EM IEJs形态的控制(b)和小干扰rna (c) ITSN-1s鼠肺内皮。箭头在B点密度蛋白矩阵interendothelial紧密连接密封的空间。箭头(c)指向三IEJs开放。电子商务:内皮细胞;m:线粒体。酒吧:150海里。 (d, e) Representative electron micrographs showing open IEJs labeled throughout their length by 8 nm Au-BSA particles. Arrows in (d) and magnified d1, point to three-four Au-BSA particles located close to each other in the same plan, indicative of the wide opening of the IEJ. Gold particles are also associated with the abluminal exit of IEJs. Note also the limited number of caveolae and dilation of the pericapillary space (pcs; asterisks). Bars: 200 nm (d); 100 nm (e).

图4

急性ITSN-1s表达的扰动诱发多形性内吞作用的/ transcytotic中间体。(f)代表EM膜环的图片(a1, e, e。1,f), tubular elements (b, c, d, arrows) and enlarged endosomes (d, arrowheads), loaded with 8 nm Au-BSA and associated with caveolae-like morphology. Two tubular structures open to the lumen are shown in (c) and (e). The EM image shown in (e) was selected from a mouse lung specimen not perfused with 8 nm Au-BSA. Note also the severe dilation of the perivascular space (pvs) and the proteinaceous edema (a). Bars: 250 nm (a, b); 200 nm (c, d); 150 nm (f); 100 nm (a1, e).

3.3。慢性抑制ITSN-1s表达式部分恢复小窝数量和IEJ完整性的同时保持替代内吞作用的/ Transcytotic通路的激活

来获得更多的洞察ITSN-1s小窝监管运输的作用功能和内皮渗透性我们未来使用长期抑制的小鼠模型ITSN-1s表达连续21天(图1 (c))。功能性慢性ITSN-1s缺乏对肺微血管通透性的影响进行评估的10分钟灌注DNP-BSA通过小鼠肺微血管构筑和量化ELISA DNP-BSA示踪剂的大量运送到肺interstitia,如上所述。这些发现是有趣的;transendothelial运输DNP-BSA ELISA量化,通过DNP Ab返回控制水平(图5(一个))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图5

慢性抑制ITSN-1s表达式部分恢复小窝数量和IEJ完整性。(a) ELISA应用于小鼠肺溶解产物控制,空的脂质体,和ITSN-1s siRNA-treated老鼠,24 d改变交货,灌注BSA-DNP 10毫克/毫升、10分钟。结果在4 - 5个不同的实验,小鼠(3 /实验条件),并表示在ng BSA-DNP / mg总蛋白/ 10分钟。酒吧±SD。(b, d)过滤残留在腔的入祭文两IEJs(箭头)。轻度扩张(*)的pv表明IEJs的泄漏。多泡体(多功能车辆总线),质膜的附近,有一些内部的小泡,由8海里Au-BSA粒子标记(c, d)。酒吧:100海里。

的电子显微镜形态学评估interendothelial联接的完整性在小鼠慢性抑制ITSN-1s表达式表明,8海里Au-BSA IEJs粒子无法穿透。相反,他们形成过滤残留的导管入祭文结(数字5 (b)和5 (d)箭头)。然而,有趣的是血管周的空间显示一些扩张和轻度水肿,这表明IEJs仍然漏水的,但是不透水的大小我们的示踪剂。

另一个有趣的观察是频繁的检测多泡体(多功能车辆总线),包括内部直径约50纳米的小泡,其中一些含有8海里盟BSA粒子(数字5 (c)和5 (d))。选择内吞作用的途径及其形态中间体仍然存在和更好的代表(图6)。膜环直径100纳米至400纳米之间,(数字6(一)和6(c)),自由在胞质或开放腔和小管(数字6(b),6(d)6(e)),其中的一些分支或卸货示踪剂血管周的空间,(图6(b)、盒装结构和插图),和扩大内吞作用的结构(最可能次级溶酶体),其中许多与典型的小窝(图融合6(一),箭头)经常被检测到。通常,显示的管状结构连接到质膜的胞质界标小窝(数字6,6(b1))或涂布囊泡(图6(e),箭头)。我们还发现膜褶边(图6(f)、箭头和insets (f.1), (f.2))和macropinocytic囊泡(图6(f)、mpv1 mpv2),参与了示踪剂摄取,如黄金所示标签,因此,可能补偿不足小窝运输。

图6

慢性ITSN-1s表达的抑制增强替代内吞作用的/ transcytotic通路的激活。(a e)代表他们的图像膜环直径100纳米至400纳米之间,(a, c),自由在胞质或开放腔和小管(b、d、e),其中的一些分支或卸货示踪剂血管周的空间,(b,盒装结构和插图),和扩大内吞作用的结构,其中许多融合典型的小窝(a)。注意管状结构连接到质膜和显示在胞质末端小窝(b1)或涂布囊泡(e,箭头)。酒吧:100海里(b, c, d);250纳米(一个);75海里(e);(f)膜褶边(f,箭头,insets f。1,f.2) and large macropinocytic vesicles (mpv1, mpv2) labeled by tracer particles. Bar: 150 nm.

的形态学分析表明,内吞作用的/ transcytotic结构略有增加的数量在24天,72 h时间点相比,膜环/小管标记Au-BSA显示进一步增加到14倍,而控制(表1)。小窝数量部分恢复,只有17.8%的下降,通过引用来控制条件。总的来说,这些观察强调ITSN-1s transendothelial运输至关重要的生理水平通过小窝和paracellular渗透率在活的有机体内。

4所示。讨论

我们需要表明,ITSN-1s高效transendothelial运输通过小窝和提供在活的有机体内超微结构的证据表明调制ITSN-1s表达激活paracellular通路以及先前描述,但不理解内吞作用的tubulovesicular网络和膜环似乎有效地弥补不足小窝传输函数。到目前为止,有限的证据关于非传统部分获得在培养细胞内吞作用的机制主要是通过研究的毒素和病毒(36- - - - - -40]。在这项研究中,使用小鼠模型表达ITSN-1s myc-SH3A域,能够调节Dyn2活动内吞作用的网站(8),和老鼠敏锐地(72 h)和长期(21 d)耗尽ITSN-1s小干扰rna,通过我们直接证明通过干扰ITSN-1s,动力学的一个关键伙伴在膜内吞作用的裂变,小凹函数中断和替代内吞作用的/ transcytotic通路及其形态中间体被激活。由别人和我们之前的研究表明,ITSN-1s函数通过招募动力学和内吞作用的调节其功能网站(6,8,16,21- - - - - -23,41]。研究培养ECs,补充在体外化验证明SH3A域ITSN-1s刺激基底和assembly-stimulated Dyn2 GTPase活性,形成低聚物的结构以及Dyn2能力(8]。在SH3A的内吞作用的网站,Dyn2 / Dyn2相互作用稳定,组装Dyn2的一生是漫长的,尽管连续三磷酸鸟苷水解,Dyn2寡聚物不能拆卸。膜裂变反应和随后的超然的小窝质膜形成自由的水泡运营商被抑制了。这里,我们扩展这些研究和表达的ITSN-1s SH3A鼠肺内皮,解决在活的有机体内监管职责的ITSN-1s膜裂变和直流发电机本身。类似于培养细胞,我们看到从质膜受损的小窝释放,小窝的脖子周围staining-dense项圈以及细长的元素和管式膜结构,与caveolae-like形态有关。此外,缺乏通过小窝transcellular运输造成的IEJs paracellular通路的激活,符合功能性反式-之间的串扰和paracellular运输途径在小鼠肺内皮。这些观察结果支持在活的有机体内ITSN-1s的作用,通过其SH3A域,在监管Dyn2函数在脖子上的小窝和ITSN-1s / Dyn2交互的重要性在小窝内化和贩卖。

急性siRNA-mediated ITSN-1s击倒,72 h改变脂质体/ siRNA交货导致小窝数量下降59%,IEJs中断,导致增加43% DNP-BSA transendothelial运输,而控制。没有ITSN-1s Dyn2 ITSN-1s和基本播放器的主要互动伙伴超然的小窝质膜不是有效地招募到内吞作用的站点,从而,小窝从质膜分离,形成自由水泡运营商中断(19,23]。类似于直流发电机,其他内吞作用的蛋白质可能是位置不当,可能更少的有效互动影响的动态特性内吞作用的复合物(23]。因此,无论分子机制involved-impaired动力学函数,对于SH3A表达式,或低效达因招聘内吞作用的网站,对于ITSN-1s knockdown-the膜裂变反应受到抑制,从质膜小凹超然不发生。ITSN-1s由五个SH3域是维持高达因浓度的关键,因此,监管的GTPase活性和低聚内吞作用的网站。

Transendothelial传输(transcytosis)通过小窝Transendothelial运输的主要机制;ECs clathrin-coated囊泡的数量是相对较小的内化过程是次要的(和他们的贡献6,42,43]。ECs真正的小窝(水泡运营商Cav1积极)代表整个水泡~ 95%人口和non-Cav1 nonclathrin囊泡中标识Cav1零鼠标不代表没有定义为一个Cav1和clathrin-independent膜泡运输系统(44,45]。我们的研究证实,确实小窝是主要的水泡运营商transendothelial ECs功能的交通工具。类似Cav1零老鼠,缺乏形态可识别的小窝,改变ITSN-1s表达式,通过减少小窝数量和损害他们的运输功能,激活补偿传输通路。这里显示增加paracellular运输之间的示踪粒子直径6 nm (DNP-BSA) 20 nm (Au-BSA)发生在小鼠急性调制的ECs ITSN-1s水平,而多形性tubulovesicular和环状的结构的高频标签Au-BSA,暗示他们直接参与示踪剂摄取和细胞贩运。ITSN-1s不足不仅可以引入古典interendothelial通路的激活,还能调节的连接。ITSN-1s长期抑制的条件下,paracellular途径仍然是漏水的但不透水18纳米直径的示踪剂。显然,ECs缺乏ITSN-1s限制paracellular通路的激活小分子,而大分子的运输(Au-BSA和DNP-BSA)达到相似的值作为对照。这个明显的交叉的完整性可能部分一般对炎症和肺损伤保护机制。此外,多形性tubulovesicular和环状的结构标签增加了Au-BSA表明他们增强参与示踪剂摄取和细胞贩运。据我们所知,这是第一个报告显示在活的有机体内调制的替代运输途径。

一个大胞内tubulovesicular endosomal来源网络,扩展从细胞核质膜和参与受体回收之前已经报道过(46]。后来,一个类似的系统是由Palade特征的组和证明包括G-protein-coupled凝血酶的受体和血小板激活因子(33,40,47,48]。结构,结果表明,这种tubulovesicular网络并不colocalize核内体早期,高尔基体和内质网。此外,网络显示其与细胞外环境和核间通信的ECs。合吸收的研究表明,合标记这个管状网络,在几分钟的治疗,符合它早期参与内化过程(33]。在这项研究中,所使用的小鼠模型中另一种细胞内运输路线是调节;缺乏招聘和动力学功能受损的内吞作用的网站由于SH3A表达式或ITSN-1s损耗可能忙的形成管状结构所示细胞条件Dyn1 / Dyn2淘汰赛(34]。此外,受损膜内陷之间的协调和泡分离可能导致大型内陷形成。ITSN-1s和2直接与FCHo1/2酒吧域包含蛋白质(24,49]。虽然没有直接的功能之间的连接已经建立ITSN-1s小窝萌芽和f -包含蛋白质,这种交互可能占tubulovesicular结构和小窝内的小凹形态改变集群。有趣的是,长期抑制ITSN-1s丝毫没有增加DNP-BSA interstitia运输。扩大IEJs是有限的。非传统的内吞作用的结构的数量更大,膜环/小管显示增加了2倍,而72 h ITSN-1s击倒。

虽然我们的结果可以用一个模型来解释ITSN-1s修改表达式和Dyn2功能受损可能有利于膜制管,直接行动的ITSN-1s肌动蛋白聚合的可能性不能排除。我们已经表明,时间和空间的肌动蛋白聚合和重塑subadjacent质膜中扮演一个重要的角色在小窝内化50]。通过其SH3A N-WASp ITSN-1s结合,(51),一个actin-nucleating因素在质膜上游Arp2/3复杂的行为(52]。黄蜂的生理意义与短ITSN-1,并不拥有DH-PH串联为长ITSN亚型,还不理解。受损的小窝内化和贩卖也可能对细胞信号的影响。upregulation的内吞作用的膜性结构可能提供不同的信号平台(53),能够部分补偿小窝信号。此外,小窝数量部分恢复,表明高度同源ITSN-2s同种型可以部分弥补ITSN-1s慢性缺,一个有待解决的问题在未来的工作。

小窝,Cav1are参与重要的细胞功能,如增殖,细胞凋亡,细胞分化,细胞迁移,内吞作用,transcytosis [44,54,55]。小窝出现在肺中所有的细胞类型,包括ECs,上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞,telocytes,巨噬细胞55,56]。最近的研究涉及小窝,Cav1在人类肺部疾病的发病机理45,57,58),神经退行性疾病(59),和肺癌60,61年]。不仅Cav1,而且无所不在地表示ITSN-1s,肺组织的主要蛋白质,与肺部炎症条件(62年),endosomal障碍与早期阿尔茨海默病和帕金森疾病的发病机制(63年)以及癌症(64年,65年]。因此,更好的理解ITSN-1s的内吞作用的功能,以及它如何调节小窝内化和贩卖可能为理解人类疾病提供新的见解,给新机遇新靶点的治疗方法。

总之,我们的研究结果提供了新的信息在活的有机体内ITSN-1s作为支架的作用,招聘人员和监管机构的小窝内吞作用的机械和加强的证据功能的内吞作用的tubulovesicular网络ITSN-1s不足引起的。

缩写

确认

这项工作是由美国国立卫生研究所拨款R01HL089462 R01HL089462-02S1和美国心脏协会SDG0635175N (s . a . Predescu)。

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