GRASP65磷酸化的抑制通过ERK信号DL-3-N-Butylphthalide预防脑缺血再灌注损伤

文摘

背景和目的。本研究的目的是探讨DL-3-n-butylphthalide的角色(平衡)在脑缺血再灌注损伤(CIRI)小鼠模型。细胞外的参与signal-regulated激酶(ERK)信号通路也被调查。方法。所有小鼠被分为五组:sham-operated集团CIRI集团,所以预处理组,所以治疗组,所以预处理+治疗组。CIRI小鼠模型建立了使用Pulsinelli four-vessel闭塞方法。预处理小鼠获得平衡(90毫克/公斤/天)一天三次在四天前再灌注填喂法。治疗小鼠获得平衡(90毫克/公斤/天)后五天内每天三次再灌注填喂法。我们发现了梗死面积,神经严重,超氧化物歧化酶和丙二醛水平。此外,我们观察到GRASP65的表情,磷酸化的GRASP65 (pGRASP65), ERK和磷酸化ERK(活跃)的免疫印迹的使用。结果。结果表明,应对CIRI ERK通路被激活。所以减少活跃和pGRASP65 CIRI的表达式。此外,所以可以降低脑组织MDA和SOD水平。减少梗塞体积也平衡组中观察到。因此,平衡抑制ERK通路的激活CIRI和减少了GRASP65磷酸化。结论。目前的发现表明,平衡保护大脑免受CIRI由抑制ERK信号通路,随后减少GRASP65磷酸化。

1。介绍

脑缺血再灌注损伤(CIRI),特点是加重神经损伤和功能障碍,是最常见的并发症发生在中风患者溶栓治疗。CIRI占85%的中风患者导致大量病人和社会的医疗负担(1]。到目前为止,CIRI的确切机制仍不清楚。因此,全面了解的潜在机制CIRI CIRI和识别有效的治疗策略是重要的临床意义。

先前的研究已经表明,氧化应激中起关键作用的病理生理学CIRI生产过剩的氧自由基,导致大量的细胞凋亡和死亡(2,3]。氧化应激过程中,高尔基体(GA)是一个关键细胞器参与信号转导,体内平衡,和细胞凋亡;这种效应被命名为高尔基体应力(气)(4,5]。细胞外signal-regulated激酶(ERK)属于系统的增殖蛋白激酶(MAPK)。越来越多的证据显示,ERK通路参与氧化应激,参与神经损伤引起的氧化应激(6]。此外,以往的研究报道,高尔基重新组装和叠加的磷酸化蛋白65 (GRASP65)是由ERK,导致池来分开(7]。

DL-3-n-butylphthalide(平衡)是一种外消旋化合物从L-3-n-butylphthalide发达,这是最初来自的种子芹菜graveolens(图1)。研究报道,所以可以预防缺血性脑损伤的衰减氧化应激损伤(8),抑制炎症反应,和神经细胞凋亡9]。此外,临床试验证明了功效,所以治疗急性缺血性中风患者(10,11]。如前所述,GA参与氧化应激。然而,所以是否能产生一种保护作用在GA CIRI仍然未知。

我们目前的研究目的是探讨CIRI小鼠平衡的作用。此外,该机制,所以减毒气体通过ERK信号通路诱导CIRI也被调查。

2。材料和方法

2.1。化学物质

所以软胶囊是购买中海壳牌制药集团公司有限公司(河北,中国)。所以胶囊(0.1 g)与大豆油稀释到2.5毫克/毫升准备和被储存在4°C。水合氯醛是购自国药控股化学试剂有限公司(上海,中国)。化验用品的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、血清总蛋白、bicinchoninic酸(BCA)蛋白质是购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。Anti-GRASP65 (sc - 398363)和antiphospho (p) -GRASP65 (sc - 389542)抗体购自圣克鲁斯生物技术,Inc .(美国达拉斯,TX)。Anti-ERK(4696年代)和anti-pERK (9106 l)抗体购自细胞信号技术,Inc .(丹弗斯、马、美国)。

2.2。实验动物

五十个男性和50个女性,特别是无菌ICR小鼠(汽车g)是由温州医科大学实验动物中心提供中国(温州)。老鼠被安置在一个特定的无菌环境和被允许免费获取食物和水的摄入量。老鼠的房屋温度控制(研讨会°C)和相对湿度(51 - 61%)光/暗周期12 h。所有小鼠随机分为5组(每组10男10女)如下:sham-operated (A组);控制(B组);平衡(C组),包括预处理(C1),治疗(C2),预处理+治疗(C3)。本研究实验动物伦理委员会批准的协议是温州医科大学。

2.3。建模方法

的Pulsinelli four-vessel闭塞法建立脑缺血小鼠模型(12]。小鼠麻醉使用1.5%戊巴比妥(0.1毫克/ 20公斤)腹腔内注射。我们做了一个1.5厘米切口中间的脖子,仔细分离颈肌肉。再往下,我们阻挡两国共同使用电凝法椎动脉和缝合切口。然后,老鼠被允许恢复。

第二天,我们重复上述步骤和颈总动脉闭塞5分钟使用小牛头犬夹。A组的手术没有阻塞。A组和B组收到豆油(90毫克/公斤/天)由填喂法。组C1和组C3都使用强饲法管理平衡的90毫克/公斤/天一天三次在四天前再灌注。组C2和C3组填喂法处理好管理的平衡点在90毫克/公斤/天每天三次再灌注后五天内。

2.4。Neuroethological评估

神经严重程度评分(NSS)被用来评估小鼠的神经损伤5天后再灌注(13]。

2.5。样本采集和测定梗死区

经过5天的建立模型,从每组小鼠进行斩首。大脑的颅骨切开术后解剖与生理盐水灌注。大脑在4%多聚甲醛溶液固定,然后用石蜡是嵌入式。标本分为5μ米厚片和苏木精和伊红染色(他)14]。在TTC染色,大脑与生理盐水灌注在4°C 10分钟。标本是切割厚度为2毫米。接下来,我们孵化的TTC片在2%解决方案半个小时在恒定的温度下(37°C)水浴。脑梗死的区域定义为大脑的清白的区域并计算使用图像分析软件(Image-Pro + 6.0版本;媒体控制论,Inc .,美国马里兰州罗克维尔)[15]。

2.6。测量脑SOD和MDA

大脑是均质冷生理盐水在4°C,和样本离心机1006 g×10分钟。收集上清液通过MDA和SOD试剂盒。疯狂和SOD水平计算使用Multiskan光谱标根据阅读材料的光学密度在552和550海里(热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)。

2.7。免疫印迹分析

ERK蛋白浓度,活跃,GRASP65, pGRASP65匀浆样本测量使用西方墨点法。总蛋白浓度的样品匀浆测定由BCA蛋白质化验设备。等量的蛋白质(20μg样本/ lane) 10% sds - page凝胶分离和转移到聚乙二烯二氟化物膜。蛋白质和抗体检测ERK(1: 1000),活跃(1:1000),GRASP65(1: 200),和pGRASP65 (1: 500)。β肌动蛋白是作为内部控制。然后,膜与二次孵化HRP-conjugated anti-rabbit (KS001)或抗体(KS003)抗体(稀释,1:3000)为2 h。蛋白质是由西方墨点法可视化的化学发光试剂。墨迹是量化使用BandScan软件(版本5.0;美国CA Glyko公司,诺瓦托)。

2.8。统计分析

统计分析软件SPSS 21.0。数据证明是平均值的标准偏差(SD)。不同组之间的比较采用方差分析,其次是事后图基测试和Bonferroni调整。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验神经严重程度得分进行了分析。Nemenyi测试被用于多个比较。 (2-tailed)被视为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Neuroethological CIRI后评估

组C1和C3明显减少神经严重程度评分比B组( ;图2)。此外,C1 ( ;图2)和C3 ( ;图2)神经严重程度得分低于B组。

3.2。所以对神经细胞形态学变化的影响

从A组细胞紧密排列,核形态正常,由他统一染色(图3)。相反,从B组细胞松散排列与几个异常形状,如核凝结,间质水肿,神经变性(图3)。在小鼠体内的平衡治疗组(C2组),一些细胞仍然表现出核凝结和其他异常的病理变化。细胞组C3与a组相比没有区别的细胞效应细胞组C1之间观察到组C2和C3(图3)。

3.3。效果,所以CIRI后梗死面积

sham-operated组(A组)、脑组织匀通过TTC染色,表现出没有明显的梗死。相比之下,B组有显著增加梗死大小比A组和C组( ;数据4和5)。此外,组C3梗塞大小明显低于组C1和C2 ( ;数据4和5)。C2组梗塞大小与C1组相比也较低( ;数据4和5)。

3.4。所以对MDA和SOD的影响

老鼠在对照组MDA水平和降低SOD水平要明显高于A组( ;数据6和7)。此外,C组(组C1, C2, C3) SOD水平高于B组( ;数据6和7)。组C1和组C3也降低MDA水平与B组相比 ;数据6和7)。

3.5。兵,活跃,GRASP65 pGRASP65水平在五组

没有观察到显著差异水平之间的ERK组( ;图8)。然而,活跃程度和活跃的比例/ ERK在B组明显高于A组( ;图8)。与B组相比,比率越低的活跃/ ERK和较低水平的活跃群体中发现了C1, C2, C3(所有 )。这表明,ERK信号通路的激活CIRI被平衡的镇压。

同样,没有观察到显著差异水平之间总GRASP65组( ;图8)。然而,pGRASP65水平和pGRASP65 / GRASP65在B组的比例明显高于A组( ;图8)。结果表明,CIRI可能加速GRASP65的磷酸化。pGRASP65水平和较低的比率降低pGRASP65 / GRASP65也发现组织C1, C2, C3(所有 )与b组相比,因此,平衡防止CIRI通过下调GRASP65磷酸化,这可能由ERK信号通路的影响。

4所示。讨论

先前的研究已经表明,ERK通路与细胞分裂和分化,也被一些病理条件如氧化应激激活和脑缺血16,17]。林等。报道称,脑缺血再灌注损伤诱发的磷酸化ERK (18]。在最近的研究中,高水平的活跃和活跃/ ERK观察脑缺血小鼠与sham-operated老鼠相比,这都与先前的研究一致。结果表明,应对CIRI ERK通路被激活。

ERK激活参与了缺血性损伤的恶化。大量研究报道,抑制ERK的磷酸化经常减少缺血性损伤和梗死[19,20.]。此外,ERK的活化也促进炎症反应和氧化应激(21]。在这项研究中,我们还发现老鼠的活跃水平管理与平衡显著低于控制,表明可能会减弱CIRI ERK通路的激活诱导。这种效应提供了进一步的证据支持CIRI平衡的神经保护作用。

我们的研究显示,老鼠CIRI增加了表达pGRASP65和pGRASP65 / GRASP65比sham-operated老鼠。掌握膜蛋白质在叠加高尔基池由GRASP65和GRASP55。具体来说,GRASP65一个错综复杂的作用在高尔基体的形态学改变22,23]。此外,GRASP65磷酸化丝氨酸- 277通过ERK和细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1)在细胞分裂的过程中,产生的解聚的高尔基体(7,24]。控制老鼠相比,在NBP-treated老鼠,GRASP65的磷酸化是减少。ERK通路可能调解这一效应,从而可能参与CIRI后的神经元变性。氧化应激发生时,高尔基体作为一个至关重要的下游靶细胞器的内质网和线粒体与GRASP65磷酸化有关。因此,气体抑制至关重要的蛋白质的合成,加剧了CIRI。

活性氧(ROS)源自氧自由基,包括超氧化物自由基、单线态氧、过氧化脂质,过氧化氢和羟基自由基。这些活性氧会导致细胞和组织损伤条件下的压力。MDA是脂质过氧化反应的副产品,经常用来测量氧化应激的状态。抗氧化剂酶是有效地减少不可控自由基的形成,如草皮。几项研究已经报道,SOD能保持体内平衡和减弱ROS CIRI期间造成的损害25,26]。因为它的半衰期短,草皮也用作抗氧化状态的标志。发现平衡可以发挥抗氧化和神经保护作用在降低脑缺血再灌注损伤的27]。燕等人报道,所以减少氧化应激的损伤CIRI后老鼠。其抗氧化效果是由于过氧亚硝基的生产过剩,抑制超氧化物和一氧化氮28]。这种效应也被证明在其他疾病模型,如帕金森病和macrovascular疾病。在我们的研究中,较高的SOD观察小鼠接受平衡与小鼠相比,大豆油。此外,平衡的治疗还可以减少CIRI引起的MDA含量增加。神经严重程度的测量显示一个类似的效应,所以。

必须提到研究的一些局限性。首先,量化神经细胞形态学的改变应该被测量。第二,细胞凋亡的情况没有测量。第三,我们缺乏可视化蛋白质免疫染色的ERK /福利/ GRASP65 / pGRASP65。

5。结论

总体上,所以对CIRI神经保护作用,介导通过抑制ERK信号通路,随后减少GRASP65磷酸化。我们的研究调查CIRI的潜在机制,表明平衡可能代表一个潜在的治疗药物治疗CIRI前景。

缩写

平衡:	DL-3-n-butylphthalide
兵:	细胞外signal-regulated激酶
掌握:	高尔基重新组装和叠加的蛋白质
SOD:	超氧化物歧化酶
MDA:	丙二醛
ROS:	活性氧
TTC):	四唑氯。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

资金

这个项目的资金支持国家学生的创新和创业培训项目(批准号201410343003)。

引用

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