文摘

最近(Mn)锰离子探测作为一个潜在的候选人元素钛的表面化学改性(Ti)植入为了开发更多的成骨的表面的期望利用其强大的亲和力的整合蛋白成骨细胞。然而,如何Mn的确切机制增强骨生成时引入钛植入体的表面并不清楚。这项研究调查了耐蚀性和潜在Mn-incorporated钛表面的成骨的能力由电化学测量和研究人类间充质干细胞(msc)的行为在临床上可用喷砂/ acid-etched (SLA)口腔植入表面用于未来生物医学应用。导致表面湿化学处理表现出Mn-containing纳米TiO的形成2锐钛矿薄膜SLA中植入和提高耐蚀性。Mn-incorporated SLA表面显示持续的锰离子释放和增强osteogenesis-related MSC功能,增强细胞早期事件如扩散、粘着斑和mRNA的表达关键adhesion-related基因和促进人类MSC分化成成熟的成骨细胞。我们的发现表明表面锰改性通过湿化学处理是一种有效的方法来产生一个钛植入表面与成骨的能力的提高促进成骨分化的msc。改进合成表面的耐蚀性是另一个重要的好处能够提供良好的骨整合界面稳定性增加障碍的效果。

1。介绍

(Ti)具有良好的耐腐蚀钛由于其表面氧化层,是生物相容性的基础,作为承载基体金属植入物(1,2]。然而,bioinert Ti有限制的生物活性;它不积极诱导新骨形成(3]。因此,许多研究人员的努力一直致力于发展更有效的表面改性钛植入体的制造模式,增强骨愈合能力,诱发快速新骨形成和达到更良好的临床结果,特别是在骨质量差(4- - - - - -9]。

表面化学变更使用生物活性离子,有利于早期细胞事件,促进成骨细胞分化的msc是一种强大的方法来生产钛植入体与成骨的能力(4,5,7,9]。Mn最近介绍了表面改性的钛植入物(10- - - - - -13)和探测作为合金元素在金属植入物基质(14,15]。Mn公司似乎忙osteogenesis-related细胞功能和骨骼愈合的植入材料(11- - - - - -13,16- - - - - -18]。锰是一种重要的微量元素在人体中扮演着关键角色在各种生理功能作为辅助因子的关键酶(19),但过量的锰吸收引起神经毒性和心血管功能障碍(20.,21]。尽管可能引起的毒性Mn过度通过摄入或职业暴露,非常微量的锰并入Ti口腔植入物的表面不会将造成任何不利影响,因为离子释放的总量从口腔植入会过低是有毒的。

研究已经证明,Mn有一个非常强大的绑定能力整合蛋白(22- - - - - -25),结合整合蛋白的细胞在一个相当低的浓度(25]。增加了整合素结合生物材料表面引发integrin-mediated信号级联,从而随后激活有利osteogenesis-related信号通路(5,26- - - - - -28]。然而,Mn的确切机制提高osteogenesis-related干细胞功能时纳入钛植入体的表面并不清楚。此外,有研究报道相互矛盾的结果的最优锰浓度诱导骨生成endosseous植入物(10- - - - - -13,17]。此外,很少有研究调查了osteogenesis-related细胞功能影响锰改性钛植入物表面的人类干细胞。

此外,耐腐蚀的能力应该被视为发展的另一个不可或缺的因素钛植入体与骨愈合能力(29日- - - - - -31日]。与改善耐腐蚀钛表面之间提供一个更加稳定的界面骨组织和钛植入已经与长期生物稳定(29日- - - - - -31日]。因此,预计一个Ti与成骨的能力增加植入物表面结合改善耐腐蚀更良好的骨整合的结果都是有益的,因为这样的表面不仅促进骨形成早期,而且达到更好的长期骨植入生物稳定的接口。

本研究旨在调查锰掺杂的表面可用钛植入物用于牙科临床实践,在这项研究中一个SLA(喷砂、large-grit acid-etched;Straumann AG)植入,为了效果有利osteogenesis-related功能在人类msc。我们预期获得的结果用人体干细胞和商业口腔植入表面将提供重要的见解表面改性钛植入体的发展未来的临床应用。为此,我们把锰离子到SLA植入表面通过湿化学处理,然后检查腐蚀行为和osteogenesis-related使用主要人类脂肪细胞功能派生的多功能干细胞。

2。材料和方法

2.1。样品制备

生产sla类型植入物表面,商业纯钛磁盘(ASTM 4级,15毫米直径3毫米厚)使用large-grit喷砂2O3爆炸粒子。其次是双重腐蚀过程使用一个混合解决方案的H2所以4表面和盐酸(SLA)。样本随后在去离子水清洗。表面锰改性SLA的样本是由两步湿化学处理,根据前面描述的方法(10]。简而言之,SLA样本沉浸在5 M氢氧化钠60°C 24 h,然后在去离子水超声清洗了30分钟。治疗后的样本进一步处理在5毫米MnCl热水地2解决方案在180°C 4 h Teflon-lined反应堆(Mn-SLA表面),然后彻底清洗和风干。

2.2。表面特征

微观和纳米级的表面形态调查样本评估通过场发射扫描电镜(FE-SEM;s - 4800、日立、日本东京)。三维表面微形貌和粗糙度值样本,由共焦激光扫描显微镜(LSM700样品形貌;卡尔蔡司、从、德国) 区( )利用LSM软件(禅,卡尔蔡司)。晶体结构和化学成分的研究由薄膜表面进行x射线衍射(XRD);X 'Pert-APD,飞利浦,阿尔梅罗、荷兰)和X射线光电子能谱(XPS;K-Alpha;英国热科学、东Grinstead)。

2.3。锰离子释放测量

锰离子释放Mn-SLA样品评估了电感耦合等离子体原子发射光谱(icp - aes);720 ICP-OES、安捷伦、圣克拉拉、钙、美国)在两个不同的测试条件下,即,a dynamic mode with gentle shaking of the samples at 50 rpm and a static mode without any shaking of the samples. Each of the five Mn-SLA sample disks was immersed in 1 mL of physiological saline solution (0.9 mass% NaCl) in a sealed bottle at 37°C with or without gentle shaking (at 50 rpm). At the indicated immersion time points, the Mn-eluted solution was retrieved and replaced with new saline solution. The concentration of Mn ions released from the Ti samples into the solution was measured after 4 h and also 1, 3, 7, and 14 days of immersion. Measurements were repeated three times for each sample.

2.4。腐蚀行为测试:电化学测量

SLA和Mn-SLA表面的耐腐蚀能力进行了测试在生理盐水(0.9质量% NaCl水溶液)。所有的研究标本在乙醇超声清洗5分钟。在露天条件下腐蚀进行了测试。电化学测量进行了稳压器(habf - 501 g, Hokuto电工,东京,日本)和函数发生器(hb - 111, Hokuto电工)。silver-silver氯电极(Ag) / AgCl)和一个铂黑电极作为参考和对电极,分别。标本被固定在一个特别设计的聚四氟乙烯(PTFE)支架装置(其它地方描述的32]。调查样本接触电解液的暴露面积是0.35厘米2(直径6.7毫米),作为工作电极。浸泡后的标本在37°C到测试解决方案,在腐蚀电位开路条件( )测量24 h。Ag / AgCl电极校准的潜力与饱和甘汞电极(SCE)。渐变阳极潜力应用于一个常数1 mVs的扫描速度1从最终的价值 1.5 V南加州爱迪生公司。

2.5。细胞培养实验
2.5.1。细胞培养

人类多能间充质干细胞(MSC)来源于脂肪组织(PromoCell、海德堡、德国)使用MSC生长培养基培养(c - 28010, PromoCell)。细胞培养的湿度低于100%和5%股份有限公司2,在37°C。每3天中被改变。电镀后的细胞在Ti磁盘24-well文化板块、成骨分化与MSC诱导成骨分化培养基(c - 28013, PromoCell)。

2.5.2。早期的细胞增殖试验

细胞培养24和48 h Ti磁盘上24-well文化在最初播种密度板 细胞/。早期的细胞增殖是由比色测定评估使用细胞计数Kit-8 (CCK-8 Dojindo分子技术、东京、日本)如前所述( 每组)(5]。

2.5.3。评价细胞形态传播

细胞形态学、细胞骨架的安排和粘着斑形成附着人类msc在调查样本评估样品形貌和FE-SEM观测24和48 h的初始播种密度 细胞/。粘着斑分布的联系和组织的肌动蛋白细丝附着msc被确定后肌动蛋白的双重染色并使用稀释vinculin单克隆anti-vinculin (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),goat-anti-mouse免疫球蛋白(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记phalloidin (Sigma-Aldrich)根据前面描述的方法5]。传播细胞的形态,包括细胞形状和依恋的形成装置,在调查样本被FE-SEM进一步评估。附着msc在研究了Ti样本顺序磁盘用2%戊二醛和1%锇酸固定,然后用一个提升的一系列醇脱水。临界点干燥后,黄金−钯膜,扩散细胞的形态FE-SEM所观察到的样本。

2.5.4。实时聚合酶链反应(PCR)粘附,Osteogenesis-Related基因表达分析

人类msc被播种在Ti磁盘24-well文化在最初播种密度板 细胞/。我们调查关键整合素基因的信使rna表达水平(β1,β3)和细胞骨架粘附蛋白(RhoA、蛋白和vinculin)已知影响后续osteogenesis-related细胞功能(5,26- - - - - -28,33在24和48 h的文化。

Osteogenesis-related基因表达在人类msc在SLA中成长和Mn-SLA样品评估后7和14天的文化。关键的转录因子基因的表达调控成骨细胞分化(Runx2 osterix)和成骨细胞表型的基因(I型胶原蛋白(COL)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OC)和osteoprotegerin(功能)是评价细胞生长的调查样本。反转录进行总RNA提取使用细胞培养七Ti磁盘,和实时PCR进行如前所述[5使用引物见表)1。数据分析使用2- - - - - -ΔΔCT方法,它针对GAPDH正常化。各种基因的表达水平表示为褶皱的差异基因表达的结果相对于控制SLA表面。

表1
引物序列实时聚合酶链反应。
2.5.5。碱性磷酸酶(ALP)活性

评估人msc生长在高山活动样本,细胞培养对Ti磁盘7和14天(在最初播种密度 细胞/)。总细胞细胞溶解产物以高山活动2-amino-2-methyl-1-propanol缓冲区,pH值10.3,在37°Cp-nitrophenyl磷酸作为衬底。吸光度的变化为405 nm使用标( 每组)。被表示为nanomoles高山活动p硝基酚(PNP)解放/微克总细胞的蛋白质。

2.5.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测骨钙素蛋白生产的msc

蛋白质浓度的终端成骨细胞分化的标志(OC)分泌粘附细胞在调查样本细胞培养基测定与商用OC酶联免疫试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)在14和21天的文化(在最初播种密度 细胞/)。OC上层清液中蛋白质含量样品的细胞培养基测定在450 nm根据制造商的指令( 每组)。对数据进行归一化总细胞的蛋白质含量。

2.6。统计分析

三个独立的细胞培养实验进行。使用非参数Mann-Whitney执行统计分析 测试评估群体之间的差异。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。样品的表面特征

图1显示的表面形貌和粗糙度值调查样本。在低FE-SEM放大(×1000),SLA和Mn-SLA样本几乎相同的表面形态(图显示1(a))。两个表面表现出喷砂/酸浸过程产生的表面形态特征,即。细micropits (1 - 2μ米维)叠加macrorough凹陷了。在更高的放大(×30000),SLA和Mn-SLA样本表现出显著差异在纳米级别表面形态(图1(a))。SLA纳米尺度下表面是光滑的,而Mn-SLA表面表现出不同的表面纳米结构的形成大约50 nm的维度(图1(b))。数据1(c)和1(d)地形测量图像和调查样本的表面粗糙度值取决于样品形貌。类似FE-SEM观察结果,没有显著差异在3 d表面微形貌或粗糙度值在两个表面之间。平均表面粗糙度值(Ra)的SLA和Mn-SLA样本 和 ,分别(图1(d))。这些发现表明,湿化学处理产生均匀的表面纳米结构没有改变原来的微米尺寸SLA植入物的表面特征。


图1
SLA和Mn-SLA表面的表面特征。(一)FE-SEM调查的图像表面在1000年和30000××的放大。(b)高放大率FE-SEM图像显示的表面纳米结构的尺寸修改的SLA和Mn-SLA表面。(c) 3 d地形测量样品形貌图像。(d)表面粗糙度值取决于样品形貌(Ra:平均值;中移动:均方根值;Rt:最大peak-to-valley高度值)。

薄膜的x射线衍射模式调查样本如图2。SLA样本表现出氢化钛的存在(δ-TiH2JCPDS # 25 - 982),这是一个典型的表面特性发现acid-etched钛植入物(34,35]。相比之下,Mn-SLA表面没有显示TiH2峰,这表明氢的湿化学处理导致解吸样品表面氧化层的SLA。湿化学处理使用Mn-containing解决方案导致Mn-containing水晶TiO的形成2复合薄膜样品表面的SLA。Mn-SLA样本表现出锐钛矿TiO的形成2结构(JCPDS # 21 - 1272)和一个小的峰值氧化锰(Mn2O3;JCPDS # 78 - 0390)。


图2
薄膜的x射线衍射模式SLA和Mn-SLA样本。

SLA和Mn-SLA样品的化学成分取决于XPS分析如表所示2。少量的铝(Al)检测在SLA和Mn-SLA样本,这是由于那一刻2O3毅力残余存在植入表面喷砂后的过程。碳(C)、氮(N)和钠(Na)检测表面污染物。Mn-SLA样品表面锰含量的2.9%。

表2
化学成分的调查表面x射线光电子能谱(原子%)。

Ti2p XPS测量光谱和高分辨率光谱,o1群,Mn2p Mn-SLA示例如图3。的价值285.0 eV c1线被用作修正参考。Mn-SLA Ti2p地区的样本,Ti2p3/2和Ti2p1/2分别检测到458.6和464.4 eV。的Ti2p3/2峰值为458.6 eV和2 p的结合能分裂1/22 p3/2( )由于是Ti吗4 +TiO的化学状态2(36,37)的结合能o1群水平Mn-SLA样本530电动汽车,这是典型的无水氧化,O2 -状态(37,38]。在641.8 eV (Mn2p Mn2p峰出现3/2)和653.4 eV (Mn2p1/2),这与Mn的结合能2O3(39]。此外,弱的肩膀Mn2p之间的结构观察3/2和Mn2p1/2峰,这是由于一个小卫星峰在647.4 eV。这一发现可能表明额外的锰的存在2 +状态(40]。因此,锰的表面薄膜Mn-SLA样本似乎存在于两种氧化态,Mn2 +和锰3 +。


图3
调查x射线光电子谱和高分辨率光谱Ti2p, o1群,Mn2p Mn-SLA样品。
3.2。锰离子释放的决心

图4显示了锰离子的浓度从Mn-SLA样品释放到盐溶液在两个不同的测试条件下,由icp - aes分析。Mn-SLA表面显示持续的离子释放。在动态模式(温柔颤抖的样品50 rpm), Mn-SLA样品释放大量的锰离子高于在静态模式下(没有任何晃动的样品)。Mn-SLA样本数量相对较高的锰离子释放到生理盐水后3天的孵化( 在动态模式和 在静态模式下),随着时间的推移,这减少了。锰浓度浸泡24小时后 静态模式和 为动态模式。累计总浓度的锰离子释放Mn-SLA样本的动态和静态模式为14天的孵化 和 ,分别。这些结果表明,Mn-containing TiO2湿化学处理获得的层可以作为一个有效的平台,锰离子的交付在SLA植入物表面附着的细胞。


图4
锰离子的释放Mn-SLA样品在两个不同的测试条件下(有或没有摇晃的样品),由电感耦合等离子体原子发射光谱(icp - aes)分析。给出的数据 ( )。
3.3。由电化学腐蚀行为的样本测试

24小时期间的腐蚀电位Mn-SLA样品沉浸在生理盐水远远高于SLA示例(图5(一个))。此外,Mn-SLA样品的腐蚀电位的值是稳定的。它表明,表面氧化层上形成Mn-SLA样本极大地抑制了腐蚀反应,这可以保持甚至沉浸在生理盐水后24 h。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
腐蚀行为的研究样本由电化学测量。(a)开路电位和(b)极化曲线测试样品的生理盐水。

Mn-SLA表面的极化曲线也显示一个独特的模式(图5 (b))。Mn-SLA表面的电流密度的变化在实验的初始阶段的时间是陡峭,因为Mn-SLA表面的腐蚀电位远高于SLA的表面。然而,Mn-SLA表面是被动,直到1.2 V (Ag) / AgCl)和被动Mn-SLA表面的电流密度小于SLA的表面。因此,看来Mn-SLA样品的耐腐蚀性能远优于SLA样本。这些研究结果表明,对腐蚀反应通过钝化膜屏障作用可以提高了湿化学处理将SLA中锰离子植入。

据报道,纳米锐钛矿TiO2获得的涂层热液治疗提高Ti-based植入物包括纯钛的耐蚀性和Ti13Nb13Zr41]。在这项研究中,一个两步湿化学处理产生Mn-containing电影以及晶锐钛矿TiO2SLA中植入物的表面结构。我们之前的一项研究报告采用相同的治疗在目前的研究条件,薄Mn-containing TiO2电影由湿化学处理大约是0.5μ米厚的(10]。因此,提高耐蚀性的Mn-SLA样品应由致密的表面氧化层由锐钛矿的TiO2结构与结晶锰的形成2O3结构。因此,预计Mn-incorporating过程使用湿化学处理可以用作表面处理方式可以改善微观结构的耐腐蚀钛植入体。

3.4。早期人类MSC响应受表面Mn修改
3.4.1。早期的细胞增殖和Adhesion-Related基因的mRNA的表达

在早期人类干细胞增殖没有区别(表示为CCK-8的吸光度值)之间的SLA和Mn-SLA表面(图24和48 h的文化6(a))。我们研究了表面Mn修改是否会影响adhesion-related基因的mRNA表达人类的msc当引入SLA植入。显著的差异被发现在关键adhesion-related基因的信使rna表达水平之间的msc两个调查样本(数据6(b)和6(c))。在孵化24小时,的表达β1,β3整合素基因在细胞生长调节Mn-SLA表面与SLA表面( ;图6(b))。此外,RhoA mRNA表达水平,蛋白,和vinculin细胞粘附过程中扮演着中心角色(5,9,42),在细胞生长显著增加Mn-SLA表面与SLA表面( ;图6(b))。在孵化48 h,没有信使rna表达水平的差异β1,β3整合素亚基之间的SLA和Mn-SLA表面(图6(c))。Mn-SLA表面仍然支持更高级别的RhoA和蛋白mRNA表达与SLA表面在48小时( ;图6(c))。


图6
早期的反应主要人类间充质干细胞表面调查。(一)细胞增殖早期表达为吸光度值24和48 h的孵化。定量实时聚合酶链反应分析的mRNA水平β整合素基因(β1,β3)、RhoA蛋白,在细胞生长和vinculin调查表面在24 h (b)和(c) 48 h的文化。值 三个独立的实验。 两个表面之间。

研究已经证明,过度的β1,β随后3整合蛋白成骨细胞诱导良好的成骨细胞分化在微型和纳米钛植入表面(5,33,43]。Vinculin、蛋白和RhoA细胞骨架蛋白,充当重要的监管机构integrin-mediated细胞粘附和整合蛋白与肌动蛋白细胞骨架5,33,42,44]。因此,这些细胞骨架粘附蛋白的表达模式调节integrin-mediated胞内信号也有助于后续osteogenesis-related msc的信号通路。考虑adhesion-related早期基因的mRNA表达模式在这项研究中,Mn公司产生更有利的早期细胞事件后续osteogenesis-related所需功能anchorage-dependent成骨细胞在植入物表面。

3.4.2。细胞形态和传播粘着斑msc的发展

图7显示了人类对SLA的MSC传播的形态和Mn-SLA样本评估样品形貌观察。Mn-incorporated SLA表面支持更好的细胞传播与控制SLA表面24和48 h的孵化时间。在24 h, SLA表面细胞生长表现出相对较弱的细胞质扩展。相反,细胞Mn-SLA表面显示更广泛传播形态与细胞质的扩展。在48 h,传播人类msc成长两个表面上显示一个更外观,即。,larger cells and more cytoplasmic extensions compared with cells observed at 24 h. Most of the spread cells on the SLA and Mn-SLA surfaces were polygonal in shape, but cells on the Mn-SLA surface displayed a more accentuated cytoskeletal arrangement (actin filaments) and enhanced focal adhesions (vinculin expression) compared with the SLA surface (Figure7)。


图7
合并后的样品形貌图像传播人类间充质干细胞的研究显示肌动蛋白细胞骨架表面(绿色)和焦粘连(红色)在24和48 h的孵化。

连同样品形貌观察、细胞形态和传播的发展好附件装置在msc附着调查样本进一步评估FE-SEM观察。类似于样品形貌的发现,细胞Mn-SLA表面显示更多的传播形态在24和48 h(图8)。Mn-SLA样本上的细胞生长表现出更强调好附件装置,即。filopodial(图附件8(b))。研究已经证明,vinculin招募和强烈激活附着部位integrin-extracellular矩阵复杂的细胞接口(44]。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
FE-SEM图像显示传播人类间充质干细胞的形态学研究表面在24和48 h(孵化。(a) FE-SEM传播的图像细胞24小时(放大×600)。(b)更高的放大图像,图像显示了传播细胞的形态与lamellipodial预测(星号)和filopodial粘连(箭头所指)孵化的24小时。

因此,发现一个更大的数量的filopodial附件,并发增加病灶粘连,并增加重要的粘附在细胞生长相关基因的表达Mn Mn-SLA样本表明表面改性提高msc早期细胞事件,事件需要随后诱导osteogenesis-related胞内信号SLA中植入物表面。

3.5。人类MSC分化成骨的影响表面Mn修改
3.5.1。Osteogenesis-Related基因表达

评估后的早期细胞反应诱发表面Mn修改,我们调查Mn-incorporated SLA植入物表面的成骨的能力通过评估osteogenesis-related使用实时PCR分析基因表达。我们评估某些主调节器基因的信使rna表达水平的成骨细胞分化(Runx2和osterix)在人类文化msc在7天。Runx2的mRNA表达和osterix明显调节人类msc Mn-SLA表面生长与修改的SLA表面( ;图9(a))。它已经表明,Runx2的msc分化成preosteoblasts[至关重要45),osterix osteoblast-specific转录因子的preosteoblasts为成熟成骨细胞的分化45]。这些发现表明,表面锰改性用湿化学处理是有效地启动的第一步osteogenesis-related级联的msc、upregulation关键骨特定的转录因子,在sla类型植入物表面。


图9
定量实时PCR分析osteogenesis-related mRNA水平的基因在人类间充质干细胞种植在7和14天的调查表面文化。(a)转录因子基因的mRNA水平成骨分化(Runx2和osterix)在7天的文化。成骨细胞表型的基因的mRNA水平(I型胶原蛋白(COL),高山,骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OC)和osteoprotegerin(功能))7 (b)和(c) 14天的文化。值 三个独立的实验。 两个表面之间。

然后我们评估不同的成骨细胞表型标记基因的mRNA表达表明早期阶段(坳和高山)和中间(BSP)成骨细胞分化和成熟的成骨细胞功能(OC) 7和14天的孵化。调节转录因子基因的表达与表面锰改性导致相应增加成骨细胞表型的基因表达数据9(b)和9(c))。在7天,人类msc Mn-SLA表面的生长表现出更大的标志基因的表达水平(早期坳,1.9倍;高山,1.4倍),中间(BSP)的1.2倍,和终端(OC, 1.4倍)比SLA表面的成骨细胞分化阶段( ;图9(b))。在14天,细胞生长Mn-SLA表面仍然显示成骨细胞表型的基因表达水平升高,除了坳(图9(c))。高山(3.6倍)和BSP(2.6倍)mRNA表达显著增加Mn-SLA表面( ;图9(c))。此外,成熟的成骨细胞表型的基因的mRNA表达,即。,OC (1.4-fold) and OPG (1.9-fold), was notably increased in MSCs by surface Mn modification ( )。功能的发现增加了OC和mRNA表达Mn-SLA表面表明表面锰改性促进完整msc为成熟成骨细胞的分化microrough sla类型钛植入体。

3.5.2。高山活动和OC蛋白质产量

后评估人类msc的成骨分化影响表面锰改性在mRNA水平、高山和OC表达进一步评估也在蛋白质水平。人msc生长在高山活动调查样本如图10 ()。Mn-SLA表面细胞种植高山活动表现出明显大于这些SLA表面文化(7天 )。在14天,表面呈现出急剧增加了高山的活动相比,7天的孵化,但Mn-SLA表面表现出更强的高山活动比SLA表面( ;图10 ())。

(一)
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(b)
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图10
(一)高山活动的人类间充质干细胞种植在SLA和Mn-SLA表面在7和14天的文化。(b) ELISA结果的检测骨钙素蛋白质含量由人类间充质干细胞分泌到培养基中生长在文化的调查表面在14和21天。值 三个独立的实验。 两个表面之间。

然后,我们调查是否表面锰改性事实上促进终端成骨细胞分化的msc当引入SLA植入物表面。为此,我们评估了OC附着蛋白生产由ELISA msc。人类msc种植Mn-SLA表面分泌大大增强OC蛋白进入细胞培养基14和21天的孵化与SLA表面( ;图10 (b))。这些发现表明,表面锰改性通过湿化学处理明显促进完整人类msc分化为成熟成骨细胞,当应用到SLA钛植入体。

在这项研究中,我们把锰离子进入临床口腔植入表面湿化学处理。合成表面显示改善骨髓间充质表达良好的耐蚀性,并鼓励人类osteogenesis-related细胞行为,包括完整的成骨细胞分化的早期细胞传播和推广。我们的研究结果表明锰的有效性作为一个潜在的候选人元素现代口腔植入物的表面化学改变为了发展钛植入体与成骨的能力和增加与其他研究结果一致报道,植入可以改善生物相容性表面Mn修改(11- - - - - -13,16- - - - - -18]。

然而,有宽的锰离子浓度差异诱导有利osteogenesis-related细胞功能(10- - - - - -13,17,23]。Mn补充以上5.5 ppm显著降低细胞周期的增殖阶段(S和G2 / M)和mRNA的表达坳至高山在人类MG63成骨细胞的细胞,而1.65 ppm没有施加任何抑制作用在这些细胞功能23]。Yu et al。11)准备Mn-containing二氧化钛涂层的微弧氧化和评估osteogenesis-related细胞行为鼠骨髓msc。他们表明,锰含量较高的涂料诱导更多的坳分泌和细胞外基质矿化,锰离子的释放高锰含量涂层大约是1 ppm在3天的孵化(11]。另一方面,成骨分化,包括osteoblast-related基因的mRNA表达,高山的活动,和OC蛋白质分泌,增强了锰离子释放水平相对较低(约0.25 ppm 3天在10天的孵化和0.35 ppm)在大鼠骨髓msc生长在高氮不锈钢锰含量为16% (17]。

相比之下,成骨细胞功能增强在更高浓度的锰离子释放13]。更多Mn释放(大约在3天3 ppm)从修改后的钛表面诱导从MC3T3-E1细胞更好的响应,包括增殖、高山活动,和矿化结节形成,比钛表面Mn释放较低(2.5 ppm 3天)13]。锰离子释放在孵化24小时仍高于锰离子浓度施加osteogenesis-promoting效应在其他研究11,17,23),包括目前的研究(1.61 ppm 24 h和2.08 ppm 3天在静态测试模式)。有趣的是,osteogenesis-related基因表达明显增加大鼠骨髓msc种植在Mn-containing acid-etched获得的钛表面等离子体离子注入掺杂甚至在一个相当低的Mn释放(10磅24 h(孵化)(12),这是几乎相同的水平成年人血液Mn含量(平均值,十亿分之9.3)[46),不少低于骨Mn含量(平均值3.9 ppm) [47]。我们假设各种研究试验条件的差异,包括细胞类型(例如,人类或动物起源和细胞株)的类型,培养法(直接或间接),钛的表面特征样本,导致了不同的结果。因此,进一步详细的研究需要严格控制的实验设计来清楚地阐明行动的模式底层表面Mn-containing钛植入体的增强成骨的能力。

考虑各种报告的结果表面上的有利影响Mn-containing植入材料,这似乎并不是现实的目前公布的确定所谓的最佳浓度的锰离子从固体生物材料表面诱导骨愈合效果更好。此外,锰离子释放完全不能被视为机制增强表面Mn-modified钛植入成骨的影响。改进的生物Mn-incorporated钛植入体获得的结果似乎是由于额外的关键因素,如植入的微型和纳米级表面地形。我们假设表面纳米结构表现为协同作用有助于增强Mn-SLA表面的成骨的能力通过增加表面积和提供更好的安克雷奇网站早期细胞粘附。

4所示。结论

本研究评估和表面特征在体外成骨的能力表面Mn-modified微结构Ti口腔植入。我们把锰离子到当前使用临床口腔植入物的表面,在这个研究SLA植入物表面,通过湿化学处理。合成表面的耐蚀性和osteogenesis-related细胞功能调节的Mn公司被电化学测量和检查评估的反应主要人类msc。湿化学处理了Mn-containing纳米晶体TiO2薄膜在SLA植入表面没有任何改变原始微米尺寸的复杂的表面形貌。处理过的表面表现出改进的耐蚀性,持续的锰离子释放,和增强osteogenesis-related MSC函数。Mn-incorporated钛氧化物层增强早期细胞事件,包括传播和粘着斑的形成,提升全SLA中人类msc分化为成熟成骨细胞植入物表面。这些结果表明,锰改性表面用湿化学处理是一种有效的方法来产生一个钛表面与成骨的能力的提高和良好的骨整合界面稳定在现代临床口腔植入。

数据可用性

数据请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由韩国政府资助(NRF - 2020 r1a2b5b01001581)。