微生物群的比较和无机阴离子含量胃食管返流疾病患者的唾液和胃食管返流无病的人

文摘

口腔是一个最复杂的微生物环境;然而,复杂的唾液微生物群的性质和水平的无机阴离子的唾液科目有或没有胃食管反流病(GERD)是知之甚少。试点研究的主要目标是评估不同唾液细菌群落组成和无机阴离子浓度GERD患者和GERD-free人之间。因此,唾液微生物群在两组是由这些属:链球菌,普氏菌,Porphyromonas、韦永氏球菌属、脑膜炎、嗜血杆菌、梭菌属、罗氏菌属和纤毛菌属。然而,属放线菌的相对丰度,Atopobium, Stomatobaculum, Ruminococcaceae_ (g2),韦永氏球菌属,和纤毛菌属明显高于在GERD患者的唾液样本,而属Porphyromonas, Gemella,消化链球菌属,和这群脑膜炎更丰富。氯的浓度、磷酸和硫酸根离子在人工唾液中不同科目和采样时间。这些研究结果拓宽我们的知识的唾液微生物群落组成和化学GERD患者的唾液和GERD-free个人。

1。介绍

口腔是一个最复杂的微生物环境殖民的一组微生物起着关键作用在维持口腔内稳态(1]。然而,现有的证据表明,口腔微生物群也是各种口腔疾病密切相关,包括牙周炎,peri-implantitis,龋齿(2,3),和潜在的系统性疾病,包括糖尿病、心血管疾病、骨质疏松症、呼吸道疾病、风湿性关节炎、和某些癌症4,5]。因此,深入了解各种疾病的致病机制,影响发展是极其重要的。

口腔生物膜的发展受到各种因素的影响,包括环境和行为因素和宿主的免疫反应微生物的入侵。因此,宿主的免疫因素,尤其是在唾液中发现,会影响对口腔疾病的易感性。唾液中含有一种抗菌蛋白先天和适应性免疫介质的混合物,它可以产生重大影响人类口中的微生物殖民(6]。抗菌蛋白除了先天和适应性免疫介质,几种有机酸和无机离子存在于口腔液体,对口腔环境的影响(7]。有机酸形成细菌发酵期间,导致减少唾液的pH值,建立一个合适的环境解散牙齿矿物质和牙本质。搪瓷的溶解度也取决于钙和磷酸盐离子的浓度在人类唾液或牙菌斑8,9]。氟化物在唾液和菌斑是重要的预防龋齿的主要通过补充矿质的齿面10]。其他无机阴离子、氯化物和硫酸盐等,也是人类唾液的关键部件(11]。因此,分析唾液样本中阴离子结合唾液微生物群需要预见引起蛀牙的细菌代谢的程度。

胃食管反流病(GERD)是一种最常见的和控制疾病在初级和二级保健环境和条件中,胃的内容流回食道和口腔。这通常发生由于疲软的食道的肌肉环底部。GERD有很高的患病率在世界各国(10 - 40%的人口)。夜间GERD的特点是在睡眠期间胃酸反流到食道。在许多GERD症状,胃灼热,返流,不明原因胸痛、慢性咳嗽、吞咽困难或痛苦,和哮喘可以区分。牙酸蚀病由胃酸可能GERD的另一个标志的人还没有有经验的典型症状(12,13]。这种疾病的症状也可以影响口腔微生物群落结构(14,15]。然而,尽管口腔微生物群的重要性分析,很少有人注意的特征在胃食管返流疾病患者唾液微生物群,这可能影响微生物群落结构。到目前为止,应该进行进一步的研究以比较GERD患者的唾液微生物群的GERD-free个人。此外,在个性化医学的背景下,是非常重要的变化来识别一个口腔细菌社区举办相关的生物基因和生活方式因素。

这个试点研究的主要目标是利用细菌16 s rRNA基因扩增子测序方法获得完整的唾液微生物群患有GERD GERD-free个人以及探索可变性在俄罗斯人的唾液微生物群资料。其他目标的研究来确定人类唾液中无机阴离子的水平和比较唾液无机阴离子浓度没有GERD患者和。

2。材料和方法

2.1。患者入选标准

在我们的研究中,所有的参与者(57%的男性和43%的女性)被诊断为根据建立的标准。组患者由十四个人,包括GERD患者。对照组由十二GERD-free参与者。胃食管返流疾病的验证是基于全面使用各种方法来评估临床研究的主要的功能状态分析负责反流性食管炎的症状复杂的形成。验证GERD,我们使用临床研究方法,包括esophagogastroduodenoscopy。

人员参与本研究从池中被选中的病人被喀山州立医科大学(喀山、俄罗斯)在夏天,2017。所有人参加了这项研究没有注册在其他卫生设施。一般来说,女性没有怀孕和所有个人没有I型和II型糖尿病,冠心病、风湿性疾病、红斑狼疮、艾滋病毒感染和没有使用抗生素前3个月的研究。表1显示了GERD患者的人口统计学和临床特点和GERD-free控制。分类变量是在应急策划表和估计使用气²测试和耶茨连续性校正。连续的数据正态分布进行了测试使用Kolmogorov-Smirnov测试。学生的 - - - - - -测试是使用正态分布值。

患者的唾液GERD (rd)和GERD-free个人(hc)收集未经刺激15毫升无菌猎鹰管。晚上返流症状有时会更加明显,因为胃酸进入食道更容易当病人处于水平位置。因此,唾液样本(~ 2毫升)收集清晨之前的个人卫生口腔空腹。参与者被要求不吃的和喝的,至少8 h,而不是与牙科粘贴在早晨刷牙前抽样。总共三个样本(s1, s2和s3)收集从每个主题的时间间隔4 - 5天。在一个小时内,唾液样本在10000×g离心,然后分为液体和固体阶段。由此产生的液体部分另外过滤通过一次性注射器过滤器(孔隙大小,0.2毫米),然后分析。沉淀唾液样本用于DNA提取和口腔微生物群落结构分析。研究胃液pH值,每个病人接受esophagogastroduodenoscopy,用于收集胃液的2 - 3毫升无菌生物材料容器(总的来说,一个样本收集)。

按照批准的指导方针进行了研究实验涉及人类的话题。依照喀山医学伦理委员会的要求州立大学(喀山、俄罗斯),书面知情同意了所有的人学习。

2.2。微生物DNA提取、PCR扩增

总DNA提取唾液样本(实相)使用FastDNA旋转工具(美国议员生物医学)和FastPrep-24均质器(美国议员生物医学)根据协议由制造商提供。提取的DNA量化NanoDrop 2000分光光度计(美国热费希尔科学)和进一步用作PCR模板。Bakt_341F (5 - - - - - -有条件现金援助ACG GGN GGC WGC AG-3 )和Bakt_805R (5 - - - - - -广汽TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3 )被用来放大V3 V4可变区域的细菌16 s rRNA基因。每个样本都放大一式三份(25周期)和准备测序如前所述16,17]。消极的控制与无菌水MQ DNA提取过程中获得证实没有污染。最后库包含16 s rRNA基因测序HiSeq 2500测序系统(美国Illumina公司)联合KFU-Riken实验室,喀山联邦大学(喀山、俄罗斯)。16 s rRNA基因扩增子序列对每个样本进行重复以确保再现性(两个技术复制了),这些数据是作为手段。可用的序列读取分析样品在加入SRA: PRJNA598080。

2.3。微生物数据分析

获得的数据进一步分析了使用生物信息学管道QIIME版本1.9.1 [18,如前所述16,17]。分类法的辣子鸡(标识阈值97%)被分配根据参考序列的最佳匹配从人类口腔微生物数据库(19)根据核糖体数据库项目(20.]。辣子鸡代表<总数的0.1% 16 s rRNA读取也取消了。α多样性评估在OTU层面使用QIIME脚本计算Chao1,香农,辛普森指数。连续的数据正态分布进行了测试使用Kolmogorov-Smirnov测试。α多样性的比较和分类单元的相对丰度的差异在使用Mann-Whitney两组样本进行了分析测试和克鲁斯卡尔-沃利斯检验(非正态的分布值)。值< 0.05被认为是显示统计学意义。阴离子含量之间的相关性进行了分析与RStudio(基于斯皮尔曼等级相关系数)。

2.4。分析方法

分析阴离子的含量,样品过滤唾液与MQ水稀释20倍。氯、磷酸和硫酸浓度样品测定使用热科学Dionex ics - 900离子色谱系统配备了电导检测器,一个IonPac AG22 ( )保护柱,一个IonPac AS22 ( )分析柱。4.5毫米的流动相由Na₂有限公司₃/ 1.4毫米NaHCO₃1.2毫升的流量最小¹。数据采集和仪器控制进行Dionex Chromeleon软件。酸度测定起动器5000米和STMICRO8电极(排开公司(美国)。对这些数据的统计评价,Mann-Whitney测试或使用了克鲁斯卡尔-沃利斯检验(非正态的分布值)。值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。人口和临床特点

我们进行了一项研究来评估可能的细菌成分的差异和无机阴离子含量与胃食管返流疾病患者唾液回流无病的控制。人口统计学和临床特点的受试者参与表中演示了这项研究1。GERD患者未发现显著差异和GERD-free控制与年龄、性别、吸烟行为,齿数,牙刷的频率。

3.2。微生物群结构分析

共有630万个高质量的序列没有嵌合体是通过调查获得的76份唾液样本(26个学科,3样品/主题),读取每个样本的平均数是82568(从52969年到109545年)。在hc08s3和rd11s3样本的情况下,接收到的数据被排除到下游分析因为低序列的计数。α多样性指数计算OTU水平显示在图S1(补充信息)。的辣子鸡的唾液GERD-free控制范围从75年到105年,和辣子鸡GERD患者唾液的变化从74年到108年( )。我们也测量了Chao1、香农和辛普森指数个人的微生物群。然而,Chao1没有显著差异,香农,辛普森指数两个学习小组之间(图S1、补充信息)。

细菌群体的特定的配置文件基于类级别显示在图S2(补充信息)。总共7门,14类,17个订单,25科38属唾液样本中确认。最确定的类对象在两组的唾液Bacteroidia,杆菌,Fusobacteriia, Negativicutes,放线菌,Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria,占总数的88.3%细菌16 s rRNA基因序列。唾液微生物群是由这些属:链球菌,普氏菌,Porphyromonas、韦永氏球菌属、脑膜炎、嗜血杆菌、梭菌属、罗氏菌属,纤毛菌属(图1)。这些都属占75.1%的序列。没有其他属相对 。不同的患者的唾液微生物群的整体构图GERD,另外GERD-free人调查。的相对丰度属放线菌、Atopobium Stomatobaculum, Ruminococcaceae_ (g2),韦永氏球菌属,和纤毛菌属明显高于在GERD患者的唾液样本,而属Porphyromonas, Gemella,消化链球菌属、脑膜炎更丰富在这组(克鲁斯卡尔-沃利斯检验, )(图2)。

3.3。无机阴离子水平唾液和胃液pH值

我们进一步的唾液浓度氯相比,磷酸,硫酸根离子在GERD-free控制那些在GERD患者的唾液中发现三种不同的采样时间。图3显示框块检测无机阴离子浓度在所有研究参与者的唾液,根据建立两组。唾液中的意思是氯浓度的控制较低意味着相比在GERD患者的唾液氯浓度( vs。 ,分别);然而,在这些阴离子含量没有显著差异两者之间创建组( )。其他两个阴离子,GERD-free之间也没有显著不同的值控制和GERD患者,和类似的意思是磷酸盐和硫酸盐含量分布在人的唾液中发现两组( vs。 和 vs。 ,相应的)。此外,独立的采样时间,类似的结果为每个人。然而,值得注意的差异在一些患者的唾液无机阴离子浓度。例如,一些病人含有较高的氯,磷酸,硫酸根离子在唾液(图3)。我们另外分析唾液样本中氟化物浓度;然而,不到的极限水平检测在许多学科和没有进一步分析。胃液pH值是另外分析了样本,和类似的意思是pH值(-2.0 ~ 1.9)被发现在GERD患者胃液和GERD-free控制(数据未显示)。

3.4。相关分析

唾液无机阴离子的浓度之间的关系GERD-free个人和GERD患者中演示了数据4(一)和4 (b)相应地,。因此,氯显著水平,与磷酸和硫酸浓度呈正相关的唾液GERD-free个人( 和0.40,分别)。最后,磷酸盐和硫酸盐含量之间的相关系数,对照组为0.54。在病人组,唾氯浓度显著,只有磷酸浓度呈正相关( )。

4所示。讨论

复杂的口腔微生物群的影响宿主的健康已经成为一个最近的研究兴趣的话题。许多研究评估不同的口腔微生物构成各种疾病患者使用下一代测序技术(21- - - - - -25]。在此处描述的研究中,我们使用一个16 s rRNA基因Illumina公司测序方法描述胃食管返流疾病患者的唾液微生物群,以前没有学习好。此外,我们使用离子色谱系统的内容来确定无机阴离子在俄罗斯人民的唾液和胃食管返流疾病。

胃食管返流疾病时的上部消化道没有正常工作,导致胃内容经常流回食道和口腔。夜间GERD的特点是在睡眠期间胃酸反流到食道。由于胃食管酸进入更容易当病人处于水平位置,GERD症状在夜间睡眠有时更加明显。胃灼热、返流、不明原因胸痛、慢性咳嗽、吞咽困难,GERD的一些症状和哮喘。牙酸蚀病由胃酸GERD的另一个标志的人尚未经历了常见症状(12,13]。在GERD患者,胃内容物可能返回到食道,到达口腔导致牙齿侵蚀和腐烂的病变。这种GERD的表现也可以对口腔细菌群落结构的影响(15]。因此,必须研究不同的微生物群的组成和无机阴离子在GERD患者的唾液。

不管学习小组,以下盛行细菌属人类唾液微生物群:链球菌,普氏菌,Porphyromonas、韦永氏球菌属、脑膜炎、嗜血杆菌、梭菌属、罗氏菌属和纤毛菌属。Genus-level的相对丰度分析表明,放线菌,Atopobium, Stomatobaculum, Ruminococcaceae_ (g2),韦永氏球菌属,和纤毛菌属高在GERD患者的唾液,而Porphyromonas Gemella,消化链球菌属、脑膜炎更低的比例。16 s rRNA基因序列密切相关,兼性厌氧链球菌唾液链球菌oralis,先锋的口腔细菌物种(26),发现在人类唾液在高水平。链球菌物种产生乳酸发酵的葡萄糖的主要终端产品(27),因此导致的pH值降低口服液体。链球菌属的一些成员是正常的人类口腔微生物群的一部分,但是能够机会致病性,而另一些则病原体(28,29日]。唾液链球菌可能导致免疫内稳态的创建和身体的炎症反应的调控30.]。这些早期口腔殖民者是紧随其后的是厌氧菌,如普氏菌属的代表,Porphyromonas、梭菌属、韦永氏球菌属(26,31日]。

普氏菌的物种已经与一些口腔感染和健康的口腔微生物群的一部分(31日,32]。他们可以从一些糖,生产各种有机酸包括乙酸和琥珀酸作为主要的最终酸产品(31日]。物种的主要致病属Porphyromonas(不太丰富的唾液患有GERD),一般来说,asaccharolytic细菌;然而,p . pasteri弱saccharolytic可以产生适量的丙酸和少量醋酸,异戊,琥珀酸糖(33]。16 s rRNA基因序列密切相关的物种p pasteri被发现在高水平在两组样品。Capnocytophaga物种是兼性厌氧细菌的正常口腔微生物群的人类和认为是机会致病菌(34)可以产生乙酸和琥珀酸(35]。奈瑟氏菌属细菌等属韦永氏球菌属,嗜血杆菌、梭菌属、罗氏菌属,纤毛菌属在人类唾液检测到显著水平两组。的相对丰度属韦永氏球菌属、纤毛菌属、放线菌和显著提高GERD患者的唾液样本,而属脑膜炎更丰富在这组( )。他们也正常口腔微生物群的一部分,可以与几个口腔感染,和大部分的代表可以生成各种有机酸(36]。这导致唾液pH值降低,最后在牙釉质的退化和龋齿的发展37,38]。

此外,Stomatobaculum和Atopobium的相对丰度明显高于在病人的唾液样本组( )。Stomatobaculum longum孤立以前龈下的斑块的统治人类健康主题报道各种碳水化合物发酵丁,乳酸,异戊,乙酸酸为主要发酵产品(39]。Atopobium parvulum属的代表Atopobium可以从人类口腔和孤立与口臭(作为一个人类消化系统的某些疾病的迹象,伴有病理性增加口腔厌氧微生物的数量,从嘴里一股怪味)(40,41]。然而,a parvulum健康受试者的唾液中也发现了(42)和舌背的个人没有口臭(43]。值得注意的是,除了a . parvulum普氏菌不同物种和唾液链球菌也被发现在舌背的口臭(43]。因为我们采样前的唾液在清晨口腔的个人卫生,这些细菌物种,以及许多其他人一样,可能是参与生产有恶臭的挥发性硫化合物等化合物。

氯、磷酸和硫酸浓度下分析了人类的唾液样本。尽管没有在统计上有显著差异的两国建立这些阴离子组的平均水平,显著的差异在一些患者的唾液无机阴离子浓度。因此,一些患者有更高浓度的氯、磷酸和硫酸的唾液。有趣的是,一个重要的和积极的浓度之间的相关性被发现氯、硫酸和磷酸的唾液只有GERD-free个人。另一方面,积极的氯和磷酸盐含量之间的相关性被发现患有GERD的唾液。这些离子的浓度在唾液中观察到这一研究符合之前的一些作品,关注不同阴离子的分析,如果刺激唾液(7,44]。这些作者也观察氯的浓度之间有很强的正相关关系,硫酸盐,磷酸盐在人的唾液。除了低pH值的人类唾液、牙釉质的溶解度也取决于唾液中的钙和磷酸盐离子的水平或牙菌斑8,9]。羟磷灰石,搪瓷的一部分,它是至关重要的,这些离子丰富足以保持唾液的过饱和状态。釉质表面可以通过沉淀磷酸钙矿物的[remineralized45]。氟离子在唾液和菌斑也很重要因为它们抑制脱矿,提高牙釉质补充矿质过程(10]。此外,氯、磷酸和硫酸唾液缓冲解决方案的重要组成部分;他们稳定pH值的唾液和减少羟磷灰石的溶解性11]。人类唾液pH值取决于几个因素,包括特定的存在有机酸在口腔环境中。此外,由胃酸侵蚀牙齿也可以发生在患有GERD (12,13]。乳酸、醋酸、丙,甲、丁和其他一些有机酸生成的主要产品是各种口腔里的细菌(7]。因此,微生物群落结构应该仔细研究探讨唾液微生物群概要的可变性GERD-free控制和GERD患者。

5。结论

总之,在这个研究中,我们全面表征微生物群和无机阴离子含量胃食管返流疾病患者的唾液样本,而尚未well-investigated之前。我们表明,细菌群落结构的唾液微生物群患有GERD略不同于没有GERD的人。此外,无机阴离子不同的数量在所有科目和采样时间,没有显著差异的平均浓度之间建立了组。然而,值得注意的差异中发现几个病人的唾液无机阴离子浓度。这些数据可以作为进一步研究的出发点口腔微生物群落与胃食管返流疾病的人。

数据可用性

可用的序列读取分析样品在加入SRA: PRJNA598080。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们想感谢Samigullin第一esophagogastroduodenoscopy和所有病人的合作。

补充材料

图S1:α多样性指数的计算与胃食管反流相关的唾液细菌社区无病主题和胃食管返流疾病患者(A-observed辣子鸡;B-Chao1指数;C-Shannon指数;D-Simpson索引)。图S2:唾液细菌群落的分类组成(A)胃食管返流患者无病主题和(B)胃食管返流疾病。细菌群落组成根据16 s rRNA基因的测序显示在类级别。陷害红盒子,唾液细菌社区的摘要与胃食管反流患者无病控制(hc)和胃食管返流疾病(rd)。(补充材料)

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