猴子细胞因子诱导神经干细胞分化Notch信号

文摘

哺乳动物中枢神经系统(CNS)更新受损细胞的能力有限的大脑或脊髓损伤后非人灵长类动物如猴子还是人类。移植的神经干细胞(nsc)是一种潜在的治疗中枢神经系统损伤因其多能性和分化能力。细胞因子发挥重要作用在中枢神经系统发展和中枢神经系统损伤的修复。然而,详细的细胞因子信号反应猴子神经干细胞研究很少。在先前的研究中,我们孤立nsc的成年猴子的大脑,发现在猴子nsc细胞因子的影响。现在,我们进一步分析了细胞因子的调控机制等猴子nsc增殖骨形态发生蛋白4 (BMP4) BMP4 /白血病抑制因子(生活),或维甲酸(RA) / Forskolin。数据显示BMP4抑制细胞增殖逮捕,但这并不影响nsc的具备干细胞。BMP4 /生活促进了猴子nsc的astrocyte-like分化和RA / forskolin诱导的神经元分化猴子nsc。BMP4 /生活和RA / forskolin诱导猴子NSC分化通过调节信号。这些结果提供了一些理论依据NSC治疗大脑或脊髓损伤再生医学。

1。介绍

哺乳动物中枢神经系统(CNS)能力有限替代损伤后细胞丢失。移植的神经干细胞(nsc)是一种潜在的治疗中枢神经系统损伤因其多能性和分化能力。nsc分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,根据复杂的信号。尽管nsc显示神经元分化的潜力在体外后,大多数的细胞分化成astrocyte-like细胞被移植在活的有机体内(1,2]。的发现机制的外部刺激,如细胞因子,调节细胞分化和信号通路调节最终的细胞命运很重要,有利于神经系统修复。

猴子NSC分化不仅通过内源性基因控制,如切口,Wnt,和骨形态发生蛋白(BMP)基因家族,但也由外生因素,如表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子2 (FGF2),白血病抑制因子(生活)。BMP、转化生长因子-的成员β总科,一直牵连antineural因素抑制增殖和促进胚胎干细胞的分化(ESCs) nonneural命运在体外和在活的有机体内(3- - - - - -5]。此外,BMP信号与其他合作发展途径,如切口(6,7和Wnt信号通路4,8),协调细胞命运,细胞增殖和分化。

生活是白细胞介素- 6细胞因子家族的一员。在活的有机体内研究表明,删除制药业或Stat3破坏nsc的星形胶质细胞分化[9,10),这表明生活可能影响NSC分化发展中大脑通过激活转录因子Stat3。因此,BMP和生活保持鼠标ESCs的自我更新11]。然而,却很少有报道BMP /生活猴子nsc的效果。

维甲酸(RA),一个活跃的导数维生素A,经常被报道在胚胎发育起着重要的作用,细胞增殖和分化。结果的基础上在体外研究RA促进经济增长逮捕[12)和诱发小鼠ESCs的分化扰乱生活/ Stat3信号(1,13]或诱导不同基因的表达,如营反应元件结合蛋白(分子)和糖原合成酶激酶3β(Gsk3β)[10]。因此,类风湿性关节炎是广泛应用于干细胞和再生医学治疗的ESCs分化成特定的细胞谱系(1,14]。同时,Forskolin,腺苷酸环化酶激活剂,强有力地诱发的神经分化脂肪干细胞(15)和恶性神经胶质瘤细胞(16]。高浓度的ESCs forskolin可以诱导神经细胞分化[17]。然而,RA的信号通路/ forskolin诱发猴子NSC分化尚不清楚。

nsc提出作为一个候选细胞替代疗法由于其可塑性。不同的生长和分化的影响因素对细胞增殖细胞类型和物种之间的差异。的功能等因素BMP4 /生活和RA / forskolin尚不清楚。此外,信号通路和机制,这是决定命运的猴子nsc缺乏理解。我们组取得了nsc从成年猴子的大脑18]。在目前的研究中,BMP4,加上FGF2的低浓度,减少猴子nsc的扩散。猴子nsc BMP4治疗后仍然保持Sox2表达式。BMP4 /生活或RA / forskolin治疗也减少了NSC增长和可能直接猴子NSC分化成星形胶质细胞或神经血统。此外,Notch信号通路参与了抑制增殖和诱导分化。我们研究了细胞因子函数和信号通路的激活在猴子NSC分化,这些发现可能受益人员旨在修复NSC移植的神经系统。我们还提供可能的理论依据NSC-mediated细胞疗法在再生医学。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

雄性猴子(猕猴属fascicularis4公斤3岁)被用来隔离猴子nsc,如我们之前所述纸。研究严格符合动物福利法案的要求。猴子在全身麻醉下接受手术按照协议得到动物伦理委员会的批准。研究后的动物实施安乐死。我们生产猴子nsc检查在本研究使用我们发表的论文中描述的方法(18]。nsc培养在37°C公司5%₂孵化器与N2 DMEM / F12补充,B27, GlutaMAX,青霉素和链霉素,20 ng / mL FGF2, 20 ng / mL EGF, 0.5 ng / mL肝素。猴子nsc消化和通道每6天。HCN细胞(nsc)来自成年大鼠海马SGZ (subgranular区)。国家安全委员会已经建立一个稳定的细胞系,作为礼物从弗雷德·h·盖奇博士索尔克研究所,美国。

2.2。细胞因子治疗

nsc在6-well镀或24-well盘子涂上poly-L-ornithine (0.5μg / mL)和层粘连蛋白(5μg / mL)。诱导培养条件如下:(1)对照组:基础培养基(含N2 DMEM / F12, B27, 5 ng / mL FGF2);(2)BMP4组:基础培养基与100 ng / mL BMP4补充;(3)BMP4 /生活组:基础培养基补充50 200 ng / mL BMP4和ng / mL的生活;(4)拉/ forskolin组:基础培养基补充1μM RA和5μM Forskolin。

2.3。免疫荧光染色

细胞被固定为4% PFA在室温下15分钟后跟透化作用在PBS含有2.5% Triton x - 100 15分钟。然后,与3%正常驴血清非特异性反应被封锁(杰克逊免疫研究)在室温下1 h。细胞主要抗体孵育Sox2(1: 1000年,研发),Ki67(1: 750年,热费希尔)Tuj1(1: 300年,Abcam)和S100β(1:300年,Abcam)一夜之间在4°C。与PBS Tween-20 0.1%洗涤三次后,细胞暴露在二级抗体室温3小时(1:1000年,杰克逊免疫研究)。主要和次要的抗体被溶解在PBS补充Tween-20 BSA为3%和0.1%。核染色,细胞治疗10 ng / mL DAPI 10分钟。细胞免疫荧光染色的图像捕获用倒置荧光显微镜(尼康TE2000)。总共6个领域的每一个好(3井/组)被随机选择盲法评估使用10 x光显微镜的细胞数量。

2.4。克隆形成实验

猴子nsc与dispase II(罗氏)和分离消化成单细胞悬液。电镀后6-well板块在生长介质,他们在显微镜下观察每3 - 4天共21天。每3天中被刷新。殖民地沾染色后21天。

2.5。细胞增殖实验

猴子nsc (5×10⁴细胞/)被播种到96孔板,和MTT试验进行检测细胞增殖通过测量光密度在450 nm 0, 48岁,80和168 h后细胞因子治疗。

2.6。实时定量PCR (qPCR)

从猴子nsc使用试剂盒提取的总RNA,根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸模板合成使用互补脱氧核糖核酸合成装备。qPCR执行使用实时PCR试剂盒SYBR绿色染料和参考染料火箭ABI 7500实时PCR系统。反应参数建立了根据制造商的指示(40 15分钟周期在95°C, 10 s在95°C,和32 s 60°C)。GAPDH作为一个内部参考控制。基因的引物序列补充表所示S1。

2.7。统计分析

意味着±标准差的数据作为三个独立的实验,分析了双尾学生的t以及。统计学意义是 。

3所示。结果

3.1。BMP4抑制猴子NSC增殖和猴子NSC维护Sox2表达式

猴子nsc来自海马和颞叶皮层18]。猴子nsc BMP4治疗表现出一个多极不同形态与控制(图1(一))。同时,Sox2和巢蛋白表达在猴子nsc培养高水平的EGF, FGF2,肝素与细胞培养在控制中(图1 (b))。我们最初观察到单nsc形成克隆的能力作为一个方法来证实猴子nsc的特点(图1 (c))。

如我们之前的研究中,所示BMP4调节猴子nsc的扩散18]。我们进行了时间进程实验更好地理解BMP4的功能。nsc来自成年猴子的大脑显示一些差异从人类nsc,我们从人类胚胎干细胞分离(5]。在FGF2的存在,猴子nsc表现出活跃的增殖,细胞增殖减慢BMP4和FGF2在168 h(图1(一))。72 h后治疗,BMP4产生了实质性影响的数量和形态nsc。细胞被夷为平地,面积较大BMP4后治疗。BMP4 nsc的增长率降低。此外,细胞数量显著减少BMP4刺激后48 h(数据未显示)。与此一致的是,MTT测定的结果也显示类似的变化(图1 (d))。

除了这些调节NSC自我更新的影响,生存和分化(19],BMP4诱导细胞周期退出和静止20.]。我们进一步确定是否BMP4-induced抑制增殖导致猴子nsc的静止。BMP4撤回时,nsc开始增殖,表现出类似的形态后对照组7天。最引人注目的是,在3天后BMP4被撤回,nsc维护Sox2表达式(图1 (e))。结果表明,BMP4有能力促进nsc静止状态。此外,nsc仍显示干细胞特性,比如Sox2-positive。

3.2。BMP4-Treated nsc功能性表达BMP信号机械

识别可能的信号通路导致BMP4的功能,我们评估了“规范化”BMP-Smad信号通路和检查BMP-Smad信号的下游基因的表达,如骨形态发生蛋白受体2 (BMPR2) Smad4, DNA结合的抑制剂1 (Id1)和Id2 [11,21]。值得注意的是,nsc对待BMP4表示BMPR2 Smad4, Id1, Id2上级(图2(一个))。

此外,三个BMP-targeted基因的表达、肌肉部分同源框基因2 (MSX2) [22,23GSK3],转酮醇酶(TKT),β更大程度上似乎诱导,BMP4 FGF2的存在。相比之下,低氧诱导因子- 1α(Hif1α)表达应对BMP4没有改变(图2 (b))。这些基因是自我更新的候选人效应器;TKT参与细胞增殖(24GSK3)和β抑制Wnt信号,需要适当的自我更新和分化nsc [4,10]。

虽然在静止Notch信号是非常重要的,维护和星形分化的胚胎和成年nsc [8,25),对切口的交互信号通路在猴子nsc BMP信号通路。在这里,我们也调查了Notch信号的可能作用在猴子nsc BMP4-mediated改变。BMP4的猴子nsc Notch3转录的大幅提高,新的高度,Hes1, Hes5基因(Notch-responsive基因(图)2 (c))。这里给出的数据提供的证据表明,BMP部分控制猴子通过切口NSC增殖信号通路。

3.3。nsc逮捕回应BMP4的增长/生活或RA / Forskolin治疗

探讨BMP /生活或RA的影响/ forskolin猴子nsc,我们观察细胞形态学的变化在这些细胞因子的治疗。在对照组,猴子nsc展出一个未分化的形态。然而,许多显著差异观察当nsc处理BMP /生活的不同时期,和许多细胞形态类似glial-like细胞BMP4 / LIF-treated文化(图3(一个))。治疗后在168 h,拉/ forskolin诱导nsc区分和显示典型的神经表型,如neuron-like细胞体和长流程(图3(一个))。

它已经表明,BMP4抑制细胞生长在我们的研究中。其他人已经报道,生活可以促进细胞自我更新,生存和分化在中枢神经系统26]。评估深度的增长变化猴子nsc BMP4 /生活,我们下一个计算细胞数量在4个时间点。当培养BMP4 /生活,观察细胞数量从最初的减少48 h和扩散显著降低在168 h(图3 (b))。关于细胞生长,我们还观察到一个递减的OD在168 h MTT实验,反映细胞增殖的百分比(图3 (c))。总之,这些数据显示大幅下滑后nsc增殖的BMP /生活治疗。

RA信号显示促进生存和增殖,调节神经胶质之间的选择和神经元命运在成人神经前体细胞(4,27]。我们下一个调查拉/ Forskolin nsc的反应。经过7天的拉/ forskolin治疗,细胞分裂的过程中逐步放缓(图3 (d)),许多细胞表现出neuron-like细胞体和长流程(图3(一个))。此外,MTT试验表明,细胞增长更为缓慢拉/ forskolin比对照组的细胞在168 h(图3 (e))。基于这些结果,细胞因子的组合BMP4 /生活和RA / forskolin诱导生长被捕。

3.4。BMP4 /生活或RA / Forskolin治疗抑制猴子nsc的扩散

Ki67接下来,我们进行免疫荧光染色,在猴子NSC增殖的一个标志,确认是否逮捕增长归因于NSC增殖。超过24%的细胞被标记Ki67(数字4(一)和4 (c))。治疗后总细胞数减少BMP4 /生活(图4 (b))。

同步增长逮捕、疣状表示完全抑制Ki67表达式由拉/ forskolin治疗(图4(一))。拉/ forskolin治疗减少细胞的数量(图7天4 (b))。Ki67-positive细胞的比例也从58.4%下降到24.5%(图4 (c))。总之,BMP4 /生活或RA / forskolin抑制NSC增殖。

3.5。BMP4 /生活或RA / Forskolin治疗促进了猴子nsc的分化

我们假设的猴子nsc增殖的抑制可能是由于nsc的分化,就是明证神经胶质或neuron-like形态学处理后这些因素。为了进一步验证这个结果,我们也分析了lineage-specific分化,免疫荧光染色。在正常的文化中,猴子nsc表示NSC-specific Sox2有关。治疗后与BMP4 /生活,很大一部分nsc(91%±7.77)分化成S100β阳性星形胶质细胞和扩展许多树突形成一个相互联系的网络数据5(一个)- - - - - -5 (c))。此外,超过80%的Tuj1-positive细胞长轴突的延伸拉/ forskolin曝光后出现,暗示刺激神经分化的人物5(一个)- - - - - -5 (c))。因此,结果表明,BMP4 /生活或RA / forskolin触发猴子nsc分化成神经元或神经胶质细胞谱系。

符合以上这些结果,我们使用BMP4 /生活或RA / forskolin治疗HCN细胞。然后,我们发现HCN细胞可以分化成神经元或神经胶质。Neuron-like分化可以通过拉/ Forskolin,诱导细胞延长很长轴突。BMP4 /生活诱导细胞许多树突和交错延伸到网络(图5 (d))。在基本FGF2、HCN表示NSC-specific标记Sox2(图5 (e))。BMP4 /生活或RA / Forskolin之后,这些细胞分化成神经元或神经胶质细胞表达astrocyte-related基因GFAP和neuron-related Tuj1(图5 (e))。

3.6。切口和Jak / Stat信号通路促进猴子NSC分化

诺已知信号通路导致成人神经前体细胞的选择胶质和神经元之间的血统(28]。我们调查的影响BMP4 /生活在下游基因的表达在nsc Notch信号和评估是否观察到这些细胞因子的影响取决于Notch信号。我们分析的表达Notch1,等级2,等级3,等级4,Hes1和切口的目标基因,Hes5, Jag2 (Jagged2)和delta-like规范等级配体1 (Dll1)。BMP4 /生活诱导增加少量Notch1 Notch2、新的高度和Dll1表达式和Hes1和Notch3表情(图三倍增加6(一))。此外,Jag2表达显著增加了BMP4 /生活(补充图S1 (a))。BMP4 /生活没有改变Ngn1水平(补充图S1 (b))。大多数等级目标基因的表达增加,表明Notch通路激活在猴子nsc BMP4 /对待生活。

生活已被证明改变NSC自我更新以来,部门和分化,所有这些都可能由Jak / Stat通路(9,29日Jak1],我们检查了表达式,Jak2和Stat3基因BMP4后/生活治疗。Jak2,定量分析证实了增加Jak1和Stat3表达诱导的BMP4(图/生活待遇6(一))。

我们分析RA / forskolin猴子nsc的影响,检测到转录反应是否拉/ forskolin诱导神经元分化与神经precursor-related基因的表达有关。微管蛋白的表达β3第三类(TUBB3 Tuj1) microtubule-associated蛋白2 (MAP2),和doublecortin(克莱斯勒)增加拉/ forskolin曝光后,表明神经分化发生(图6 (b))。

符合神经precursor-related基因的激活,颈板基因的表达式同系物的果蝇无尾的基因(及),achaete-scute家庭bHLH转录因子1 (ASCL1和Mash1)和肌细胞增强因子2 c (MEF2C)显著增加,而转录阻遏物的表达神经元分化,如组蛋白脱乙酰酶4 (HDAC4)和抑制因子元素1沉默转录因子(REST)减少猴子的神经元分化期间nsc(图6 (b))。

有趣的是,拉/ forskolin下调Notch通路的表达目标Hes1和Jag1猴子nsc在神经分化阶段(图6 (b))。因此,切口途径也参与了由拉/ Forskolin分化诱导。

4所示。讨论

我们获得了成人的nsc猴子的大脑在我们之前的研究18]。在目前的研究中,我们进行了额外的详细研究猴子nsc的信号机制来确定BMP4 /生活星形胶质细胞诱导分化和RA / forskolin诱导神经分化。我们最初克隆形成、特征标志基因的表达巢蛋白和Sox2和细胞生长速率。然后,观察细胞生长抑制和大多数BMP signaling-related基因的表达(Id1 BMPR2 Smad4, Id2 MSX2,和TKT)调节在猴子nsc BMP4对待。然而,猴子nsc仍然保持Sox2-positive,不分化,BMP4治疗。这表明BMP可能引发规范化Smad通路下游靶基因的表达,诱导猴子NSC静止。

此外,我们的结果显示一个基因,抑制Wnt信号(GSK3β)和Notch信号基因(Notch3,新的高度,Hes1 Hes5)是调节在猴子nsc BMP4对待,Hif1除外α。Hif1α表达式并没有改变BMP4,可能由于使用常氧培养条件。这些结果暗示猴子nsc BMP4的影响是通过多个信号通路的作用像BMP, Wnt和Notch信号通路。

通过跟踪猴子nsc的变化,我们看到一个减速后的细胞增殖BMP4 /生活和RA / forskolin治疗。相应减少的百分比Ki67-positive细胞也被观察到。此外,BMP4 /生活引发了胶质猴子nsc的分化,导致细胞形态学变化和S100β与这些因素的函数表达式,一致HCN细胞。暴露在RA / forskolin引起猴子nsc的神经分化,被神经differentiation-related基因的表达和颈板基因,低水平的分化抑制因子基因,减少细胞生长。基于这些发现,BMP /生活或RA / forskolin可能足够的针对移植干细胞分化治疗。

以前的研究证实了Notch信号通路影响nsc广泛的细胞过程,包括细胞分化[8,9,28]。因此,我们研究了Notch信号通路是否参与的变化引起的猴子nsc BMP4 /生活或RA / forskolin治疗。大多数切口家族基因的表达,比如Notch1, Notch2, Notch3,新的高度和切口目标基因Dll1调节BMP4 /生活治疗。相比之下,Jag1 Notch通路基因的表达和Hes1减少拉/ forskolin曝光。我们的研究首先表明BMP4 /生活和RA / forskolin提升猴子NSC分化至少部分通过Notch信号通路。

BMP4的胶质分化/ LIF-treated nsc涉及不同的通路,人生如果激活Stat3保持未分化状态的老鼠的ESCs [30.]。一系列的研究表明,astrocyte-inducing细胞因子函数作为bHLH的负调控因子抑制神经发生(31日]。BMP施加一个antineurogenic影响神经上皮的细胞诱导的表达antineurogenic bHLH蛋白(31日,32]。此外,我们探讨了反应相关基因和信号通路激活的猴子nsc BMP4 /对待生活。Hes1的表达、Hes5 Jak1 Jak2和Stat3增加在猴子nsc BMP4 /生活治疗。这一发现支持了假设BMP4 /生活促进了分化星形胶质细胞通过bHLH监管者和Jak / Stat通路。

BMP4的关键角色,BMP4 /生活,和拉/ forskolin治疗在控制这些猴子nsc的最终命运呢?什么是这些因素在NSC移植应用程序的功能?在未来的研究中,我们将试图回答这些问题,探索内在的关键信号通路中大量的相应基因激活这些因素。识别的关键信号通路可能提高我们理解细胞移植和细胞疗法提供了一些有用的理论。

5。结论

我们进行了详细的分析与细胞因子治疗后猴子nsc BMP4, BMP4 /生活,和风湿性关节炎/ Forskolin。基于我们的研究结果,BMP4可能诱发猴子NSC静止并通过Smad影响细胞增殖信号通路。同时,BMP4 /生活和RA / forskolin可能促进分化的猴子nsc通过调节信号。因此,猴子nsc可能最初作为移植细胞治疗神经退行性疾病的潜在来源。信号的识别机制激活这些细胞因子的NSC再生医学治疗提供了理论依据。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和补充信息。

的利益冲突

Ce, Zhengliang高,欣欣汉高级作者。作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的一般程序,上海市卫生和计划生育委员会(201740091)、上海自然科学基金(zr1445400 19日),中国国家自然科学基金(81901031和81901031号)、上海市自然科学基金(16 zr1430600),药物研究的国家重点实验室,上海药物研究所,中国科学院(SIMM1705KF-10)和科研项目,培养大学医学院、嘉兴。

补充材料

图S1: Jag2的表达(a)和Ngn1 (b)在猴子nsc BMP4 /对待生活。 。表S1: qPCR为各种基因的引物序列。(补充材料)

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