微晶纤维素交付的重组蛋白质抗原对小鼠的丹毒

文摘

这项研究描述了开发的疫苗使用微晶纤维素(Avicel ph - 101)作为输送载体的重组蛋白质抗原对丹毒。重组SpaA、表面保护蛋白质,革兰氏阳性病菌Erysipelothrix rhusiopathiae是融合cellulose-binding域(CBD)木霉属harzianum内切葡聚糖酶II S3N10肽。表达的融合蛋白(CBD-SpaA)大肠杆菌和随后Avicel ph - 101。的抗原性CBD-SpaA绑定到Avicel评估了酶联免疫吸附(ELISA)和共焦激光扫描显微镜(样品形貌)化验。考试的免疫原性,成群的老鼠免疫具有不同构造(可溶性CBD-SpaA Avicel涂上CBD-SpaA,整个菌苗大肠rhusiopathiae(积极控制)和PBS(负控制))。免疫接种在两周后,小鼠1 x10的挑战⁷CFU的大肠rhusiopathiae、涂CBD-SpaA Avicel诱导保护性免疫的小鼠。总之,这项研究表明微晶纤维素的可行性的交付系统重组蛋白亚单位疫苗大肠rhusiopathiae感染的老鼠。

1。介绍

疫苗是治疗配方给病人引起免疫反应,导致抗体生产(体液)或细胞介导的反应,最终将打击各种恶性肿瘤(1]。有很多方法通过接种疫苗交付,这被认为是最有效的预防方法对各种传染病。疫苗运载系统(即。,micro- or nanoparticles, liposomes, and virosomes) have been investigated for improving vaccine efficacy [2- - - - - -5]。此外,各种疫苗类型开发传统疫苗克服的缺点。在疫苗、重组蛋白抗原,或其片段,已经使用并视为新的候选疫苗。发展这种类型的疫苗避免安全问题与衰减病毒或细胞培养时常规病毒疫苗(6,7]。然而,一些重组蛋白抗原有致命缺陷(低稳定和免疫原性)由于缺乏关键元素,可以刺激免疫反应(8]。使用佐剂和重组蛋白疫苗,已经提出了改进免疫原性(9]。不同的策略都进行了广泛的探索,以提高保护抗原的免疫原性通过固定无机或有机矩阵(10]。

纤维素是植物细胞壁的主要组成部分和一个葡萄糖残基的线性聚合物。它是自然抗生物降解能力由于其不溶性,硬度,和包装在一起,形成长晶体的倾向。它是惰性,医学安全,便宜,使一个有效的免疫吸附,或为蛋白质纯化和固定化载体材料,(11]。Cellulose-binding域(CBD)是指蛋白质模块将坚定地绑定到各种类型的纤维素。纤维素之间的强大吸引力和CBD已经应用在许多领域,尤其是对免疫学(12]。在以前的研究中,纤维素珠子(Sigmacell 20®或Orbicell™纤维素粒子)附加到CBD-fused重组蛋白用于肠外疫苗接种对金鱼13],CBD的自由形式的免疫原性性质与CBD-cellulose比较复杂,使用细胞因子的生产作为免疫指标。小Orbicell珠(1 - 10μM)诱导的抗体水平等于浓度产生的蛋白质和疫苗佐剂的公式相比,大Sigmacell粒子(10 - 20μ米)。同样,Lunin et al。(2009)研究CBD的固定化的纤维素吸附剂提高特定抗体的合成和发现免疫吸附不是immunotolerant和纤维素可以诱导细胞因子参与体液免疫反应的调节生产8]。

丹毒是一个非常严重的猪疾病造成巨大的经济损失。大肠rhusiopathiae丹毒的病原体,是革兰氏阳性杆状的,non-spore-forming, non-motile,细菌病原体(14]。虽然减毒活疫苗或重组疫苗目前管理控制这种疾病,他们的效果是不一致。甚至的致病性机制尚未阐明15- - - - - -18]。因此,需要有更先进的、有效的系统对丹毒的疫苗接种。

在这项研究中,我们开发了Avicel(微晶纤维素)与抗原并研究其特性。此外,antigen-immobilized Avicel疫苗皮下注入老鼠来分析我们的新开发的实际免疫原性antigen-immobilized Avicel重组蛋白疫苗。总体来说,该研究凸显了发展一个有效的重组蛋白vaccine-immunosorbent系统来防止猪大肠rhusiopathiae感染。

2。材料和方法

2.1。菌株和文化条件

的E。rhusiopathiae15个血清型菌株被隔离在韩国从患病的小猪。,大肠杆菌DH5α[F^{- - - - - -},ϕ80 d虫胶ZΔM15,结束A1hsdR17 (rK^{- - - - - -},可⁺),吃晚饭E44,这- - - - - -1,λ^{- - - - - -},娱乐A1,gyrA96)是用作克隆宿主菌株和质粒维护。的大肠杆菌BL21宿主菌株(F^{- - - - - -},hsd年代加,ompT,rB^{- - - - - -},mB^{- - - - - -})(美国Novagen),窝藏λ导数,DE3用于基因表达。

2.2。克隆和重组质粒结构

该基因编码的CBD木霉属harzianum内切葡聚糖酶II,用人工₃N₁₀链接器,从pEKPM-EcGAD-Lk-H6放大(安,2004;Hyemin公园,使用特定的引物(2012)提出:5′-GAAGGAGATATACATATGCAGCAAACTGTTTGGGGG-3′,相反:5′-CTTCTTATCGGATCCGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGCTGCTGCTAATGCATTGAGCGTAGTA-3′),强调人物的介绍了在融合™优势PCR克隆工具(美国Clontech)。的斜体字母表示的限制性内切酶。聚合酶链反应(PCR)产品包含CBD和S₃N₁₀链接器引入了pET-28b(+)质粒(美国Novagen),之前消化濒死经历我和BamH即基因组DNA的隔离E。rhusiopathiaeDNeasy血液和组织工具包(试剂盒,德国)是根据制造商的指示。表面保护性抗原基因(SpaA)被放大E。rhusiopathiae基因组DNA,通过使用引物PCR(转发:5′-ACTCCGCCAACTAGCTCTGGATCCGATTCGACAGATATTTCTG-3′,相反:5′-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTTAAACTTCCATCGTTC),强调碱基对介绍了核聚变的结扎。的斜体字母表示的网站BamH我和Xho我。

2.3。CBD-SpaA蛋白质的表达和纯化

质粒窝藏pKPM-CBD-Lk-SpaA-H6变成了大肠杆菌BL21 (DE3)。转化株的生长在2次中包含50μ克/毫升卡那霉素在37°C。当一个一个_600年0.5了,0.5毫米-异丙酯β-thio-D-galactopyranoside (IPTG)添加和文化发展为一个额外的3 h 37°C。细胞被离心收获和球打乱了声波降解法进行进一步分析。重组融合蛋白纯化从上层清液Ni-NTA琼脂糖(试剂盒、德国),使用一个Econo-Pac色谱柱(美国Bio-Rad)根据制造商的指示。使用BCA蛋白质测定蛋白质浓度估计工具包(皮尔斯,美国)。

2.4。结合CBD-SpaA Avicel上

绑定进行化验根据先前所描述的方法,用轻微的修改(19]。简而言之,Avicel (ph - 101,σ,< 50岁μ米)与500年(0.1毫克)混合μCBD-SpaA的g蛋白在4°C 2 h。上层清液离心后收集,用于确定未化合的蛋白质用BCA化验设备。量的蛋白质绑定到Avicel决心从最终的区别和上层的起始值。非特异性蛋白质绑定到Avicel被洗涤了0.5 M氯化钠。

2.5。sds - page及免疫印迹分析

sds - page(钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳)执行根据的方法拉姆勒(20.]。免疫印迹分析,蛋白质分离10% sds - page凝胶膜转移到硝化纤维素(NC)。NC膜被封锁的磷酸缓冲盐(PBS)含5%脱脂牛奶和洗了三次PBST (PBS渐变20 0.1%)。膜是孵化与探测器单克隆抗体(美国圣克鲁斯生物技术)或mouse-derived抗血清与细菌的准备E。rhusiopathiae在室温下,1 h (RT)。特异性抗原的反应与免疫球蛋白碱性磷酸酶(美联社)抗体(美国σ)使用AP共轭衬底可视化工具包(美国Bio-Rad)。

2.6。制备多克隆抗血清老鼠

准备老鼠多克隆抗血清E。rhusiopathiae,有没有specific-pathogen-free (SPF)小鼠皮下注射formalinized全细胞疫苗E。rhusiopathiae内两次间隔2周。然后,两周后采集的血液样本和血清抗体效价测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。

2.7。抗原性评价

微量滴定装置带(热科学、芬兰)涂在一夜之间与100年在4°Cμ每口井的l固定化CBD-SpaA Avicel。几个稀释(1×10⁴5×10⁴1×10⁵,5×10⁵Avicel粒子)Avicel涂布CBD-SpaA三个一组进行测试。盘子洗了三次PBST阻塞和5%脱脂奶在PBST 1 h rt,抗血清来源于鼠标E。rhusiopathiae(1:50 0)添加到盘子里,然后放在一个摇臂平台2 h rt检测的免疫原性特点,盘子被孵化的1:20 00稀释辣根过氧化物酶(合)anti-mouse整体免疫球蛋白抗体(英国通用电气医疗集团)1 h rt,光学密度在450 nm读读者使用TECAN无穷2000 PRO板(TECAN、奥地利)。

2.8。共焦激光扫描显微镜(样品形貌)

Avicel粒子(1×10⁵)涂上CBD-SpaA孵化与抗血清E。rhusiopathiae(1:50 0)为2 H rt与PBST洗涤三次后,该固定化CBD-SpaA孵化与荧光素(FITC) AffiniPure F (ab) 2片段山羊Anti-Mouse免疫球蛋白(H + L)(美国杰克逊ImmunoResearch实验室)30分钟在4°C。板又洗了,Avicel粒子涂CBD-SpaA与3.7%多聚甲醛固定在RT 10分钟,其次是安装与VECTASHIELD山中(美国向量实验室。)。免疫荧光法是评估使用LSM 510元激光扫描显微镜(德国卡尔蔡司)。

2.9。小鼠免疫和挑战

四十SPF小鼠(5周)被随机分配到4组,每组八和皮下注射4μ克可溶性CBD-SpaA、Avicel涂上CBD-SpaA ERT2T-A包含整个菌苗E。rhusiopathiae15(积极控制型)和PBS(负控制)与油性佐剂乳化,分别。两周后注入,所有组与1×10挑战皮下注射⁷CFU的E。rhusiopathiae(15型)。老鼠死亡率每天监测接下来的十天。

3所示。结果

3.1。CBD-SpaA表达融合蛋白在大肠杆菌

如图1,pKPM-CBD-Lk-SpaA-H6构建CBD SpaA融合的表达。的构造,SpaA CBD的融合t . harzianum内切葡聚糖酶II通过人为的年代₃N₁₀肽完全抵制大肠杆菌肽链内切酶的糖基n端和6个组氨酸。表达的融合蛋白(CBD-SpaA)大肠杆菌BL21 (DE3)窝藏pKPM-CBD-Lk-SpaA-H6。sds - page和免疫印迹(图的结果2)表明,CBD-SpaA成功表达预期的分子量(77.6 kDa)没有被蛋白质水解降解,CBD-SpaA过表达在一个较高的水平(35%)对细胞总蛋白的百分比。此外,大多数CBD-SpaA在可溶性表达形式,而我们之前的工作中,极端的溶解度降低大肠杆菌派生的谷氨酸脱羧酶发生与CBD(融合后21]。

3.2。涂层的Avicel CBD-SpaA蛋白质

CBD-SpaA蛋白质从原油通过Ni-NTA列细胞溶解产物纯化的洗脱咪唑(250毫米)。洗脱分数包含CBD-SpaA纯度为85.1%。细胞溶解产物纯化CBD-SpaA和原油被绑定到微晶纤维素Avicel ph - 101和Avicel CBD-SpaA绑定的浓度是由剥离的蛋白质从珠子沸腾。Avicel显示绑定能力为3.11±0.015 (纯度:94%)纯化CBD-SpaA和1.92±0.001 (纯度:81%)原油细胞溶解产物(图3)。

3.3。抗原性Avicel CBD-SpaA绑定

的抗原性CBD-SpaA绑定到Avicel被间接ELISA试验评估。如图4,增加了吸光度值检测比例涂上CBD-SpaA Avicel粒子的数量,而没有CBD-SpaA Avicel负控制显示一个值低至PBS。共焦激光扫描显微镜(样品形貌)用于可视化的抗原Avicel涂上CBD-SpaA(图的属性5)。纯化的融合蛋白注定Avicel和孵化anti-serum整体大肠rhusiopathiae,其次是goat-mouse IgG-FITC。样品形貌图像显示绿色荧光分散几乎同样Avicel表面涂上了CBD-SpaA如图5。

3.4。在免疫小鼠保护性免疫

检查是否保护可以通过免疫诱导无副作用Avicel涂上CBD-SpaA,我们注入每个蛋白质(免费CBD-SpaA和CBD-SpaA Avicel涂布,ERT2T-1包含完整的细胞疫苗(积极控制)从CVAVC在大韩民国,和PBS(负控制))在老鼠和老鼠与挑战大肠rhusiopathiae。所有的负控制老鼠死后七天内的挑战。与阴性对照组相比,5 8 (p < 0.0001, Fisher精确检验)小鼠ERT2T-1免疫组和6 8 (p < 0.0001, Fisher精确检验)免费CBD-SpaA免疫组小鼠,活了下来。Avicel涂上CBD-SpaA,免疫组小鼠显示,100% (p < 0.0001, Fisher精确检验)免疫系统对抗挑战大肠rhusiopathiae(图6)。然而这个群体没有显示显著差异与自由CBD-SpaA免疫组(p = 0.467, Fisher精确检验)。这些结果表明,微晶纤维素可以作为输送载体的重组蛋白质。

4所示。讨论

抗原子单元或合成肽是一个有前途的替代病毒疫苗。他们也被认为是比死亡更安全的疫苗系统/灭活或整个细胞/病毒减毒活疫苗。DNA重组技术的发展使得亚基疫苗更有效,因为生产和净化过程可以精心设计来获得高收益的一个定义良好的产品(22]。然而,一些研究表明,可溶性免疫原很少产生高滴度的抗体不使用强大的佐剂(23,24]。克服典型的低免疫原性的蛋白质疫苗,和地址需要有效的疫苗和有效的输送系统,研究人员已经在分子生物技术的发展方向25]。最近,重组生物技术的进展已经导致了基因工程的发展聚合物与氨基酸残基的确切顺序和准确性。重组蛋白质聚合物,如elastin-like聚合物(elp),仿绸聚合物(slp)和silk-elastin-like蛋白质聚合物(SELPs)已报告将控制释放,再循环疗法,和修复治疗方案26]。纳米结构如金纳米粒子和病毒样颗粒最近也达到利益为他们提供清单好处(药物输送27,28]。

在我们的研究中,Avicel被选为免疫吸附纯化的重组蛋白亚单位疫苗和交付,因为它是高惰性生物材料便宜,而且安全。这应该防止蛋白质亚单位疫苗能在恶劣条件下退化(极端的pH值或温度)。如图4免疫反应Avicel粒子浓度的增加而增加,确认其适用性更好的疫苗免疫吸附系统。高免疫力增加达到了Avicel浓度可能是由于Avicel SpaA的选择性涂层。

我们的研究结果清楚地表明,Avicel好的CBD-SpaA绑定特定疫苗交付的能力。绑定能力可视化使用样品形貌成像如图5。众所周知,水疗蛋白质是有效的保护性抗原大肠rhusiopathiae感染(29日]。最近的报告表明,SpaA Spa-type主要血清型1,1 b和2 (30.最常见的涉及猪丹毒]。SpaA位于氨基酸之间的保护域29 - 414 (30.]。这个特定的氨基酸序列本身可以引起高度保护性抗体大肠rhusiopathiae感染(15]。投递代理和免疫吸附剂,Avicel进一步提高其效力,我们发现在我们的实验。

5。结论

在这项研究中,我们开发了一个疫苗使用微晶纤维素,Avicel ph - 101提供重组蛋白质抗原对丹毒。CBD-SpaA,重组蛋白表达大肠杆菌和绑定到Avicel ph - 101。看得出来我们的数据表明,100%的存活率可以通过使用Avicel涂有抗原大肠rhusiopathiae挑战老鼠。因此,体外免疫原性试验验证了体内实验的挑战。

在我们的新开发的疫苗系统、蛋白质纯化是不必要的。这降低了生产成本,使成本效益,重组蛋白疫苗的系统。具体地说,我们的交付系统使用Avicel涂CBD-SpaA可以提供一个吸引人的疫苗接种战略丹毒。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Wooyoung全和金Yeu-Chun贡献同样这项工作。

确认

本研究从KRIBB研究提供资助计划项目。这项工作是支持的先进生物质研发中心(ABC)全球前沿的项目由科技部资助的ICT (ABC - 2015 m3a6a2074238)。

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