文摘

静脉曲张是一种疾病发病率和患病率高。静脉壁的平滑肌细胞(smc)的血管内稳态分泌多种物质对刺激的反应。这些细胞可以修改的任何变更的功能和结构等静脉层内皮,导致增加内皮渗透性和释放的物质。因此,知道静脉曲张的细胞和分子机制势在必行。本研究的目的是了解smc的静脉曲张患者接受隐静脉切除术大隐静脉反应细胞缺氧的条件下,确定血管内皮生长因子(VEGF)的角色在这个过程。我们获得了smc从人类隐静脉段静脉曲张患者(n = 10)和器官捐赠者(n = 6)手术。一旦扩大,细胞受到缺氧条件在特定的房间,和扩张是通过分析形态学检查和的表达α肌动蛋白。HIF-1进一步基因表达研究α,VEGF EGLN3 TGF -β1、以挪士和Tie-2使用RT-qPCR进行。本研究揭示了静脉细胞持续缺氧的反应。作为重要的观察基因差异表达,我们能够确定静脉细胞对缺氧敏感。我们假设静脉功能不全导致细胞缺氧与稳态失衡。VEGF起微分作用可以与细胞静止标记在静脉曲张,可能的治疗靶点。我们的研究结果表明smc对缺氧敏感有不同的基因表达。因此,我们可以假设的条件下静脉功能不全导致持续细胞缺氧的情况。这种情况可以解释发生在静脉壁的细胞反应的代偿机制。

1。介绍

慢性静脉疾病是指静脉系统的形态和功能异常,包括一系列的临床表现不同程度的静脉曲张(VV)是最常见的1,2]。在这个病理、家族史、老化、荷尔蒙,肥胖,怀孕是最重要的风险因素(3- - - - - -5]。全世界不同的流行病学研究进行了明显,慢性静脉疾病发病率和患病率大大变量。根据弗雷明汉的研究中,静脉曲张每年的发病率是2.6%的女性和1.9%的男性6]。在西方国家,静脉曲张可以影响高达80%的成年人口(7]。

静脉壁的平滑肌细胞(smc)一个重要的角色在信号的接收和控制静脉壁(8- - - - - -10]。在正常情况下体内,血管细胞维持很低的复制水平和缺乏专业结构(11]。然而,当它能够激活和应对大量的炎症,免疫和血栓性刺激保持完整,它影响内皮。内皮细胞可以执行复杂的功能和对血管壁内稳态的维护至关重要12]。内皮细胞可以分泌多种物质对不同的刺激13]。任何变更的这些细胞可以修改其他静脉的功能和结构层,导致血栓形成等现象的出现,增加内皮通透性水肿,和有毒物质释放,从而导致炎症、缺血,甚至细胞坏死(10,14]。

许多作者揭示了慢性静脉疾病的细胞和分子机制(10,15- - - - - -17]。Shoab et al。18]表明,合成的血管内皮生长因子(VEGF)是患者不平衡VV,揭示疾病的重要性。VV产生扩张的静脉壁和损失的正常流体剪切应力,从而导致细胞缺氧(14,19]。

本研究的目的是了解平滑肌细胞(smc)静脉曲张患者接受隐静脉切除术大隐静脉的反应在细胞缺氧的环境下,在这一过程中确定VEGF的作用。我们检查了缺氧、炎症和静止低氧诱导因子1阿尔法(HIF-1等标记α),egl九同族体3 (EGLN3), VEGF,转化生长因子β1 (TGF -β1),内皮一氧化氮合酶(以挪士),和TEK受体酪氨酸激酶(Tie-2)来满足这些目标。

2。患者和方法

2.1。病人

隐静脉段是在手术过程中获得的器官捐赠者(控制,n = 6)和主题与静脉功能不全(静脉曲张、n = 10)。知情同意参加本研究获得的所有科目。批准的项目是中央大学医院临床研究伦理委员会的Defense-UAH (37/17)。标本第一视觉检查检查是否存在静脉受损区域的墙。研究人口控制的均值= 44 80±0,86岁和静脉曲张= 47岁12±1,26岁。

隐静脉段的对照组获得器官捐赠者,没有历史的静脉功能不全或证明器官提取手术期间回流。段隐静脉在第二组得到的提取主要静脉功能不全患者和临床证实。在这项研究中使用的所有静脉曲张是分为2型根据CEAP分类(C2)。

标本被安置在无菌培养基(MEM;基本介质)和1%抗生素/抗真菌的(从热费希尔科学肉汤,沃尔瑟姆,妈,美国)和存储在4°C转移到实验室,在那里,他们分为两个片段,片段之一是处理从外植体和光学显微镜获得平滑肌细胞(免疫组织化学),和其他碎片被用于分子生物学研究。

2.2。细胞隔离和文化

在无菌条件下在二类层流柜(通讯卫星AV30/70;通讯卫星的SA,马德里,西班牙),部分人类在无菌条件下静脉与MEM刷新几次,然后纵向切开。后去除内皮和外膜层的刮,内侧层是切成小外植体(1平方毫米)。随后他们接受消化一个0,1%的I型胶原酶溶液(沃辛顿)MEM (1 h 37°C)摇晃在洗澡。酶反应是停止通过添加相同体积的培养基然后离心机在200 g 7分钟和丢弃的媒介。这些外植体放置在25平方厘米的文化表面Roux瓶(Nyclon-Intermed;Nunc / S, Roskildo、丹麦),0,5毫升Amniomax完全培养基(美国Gibco BRL,生活技术的卡尔斯巴德,CA)被添加到维护文化表面的湿度,提高外植体的依从性。培养瓶培养在一个垂直的位置在37°C的5%二氧化碳培养烤箱2 h。接下来,2、5毫升Amniomax介质添加/瓶,在前面的条件下水平,烧瓶孵化。被小心地避免运动可能导致外植体变得紊乱。培养基是小心翼翼地取代每周两次。

一旦细胞已经融合,smc亚文化的酶治疗。这涉及撤回介质和冲洗三次2毫升的汉克的平衡盐溶液(Gibco BRL,生活技术),其次是增加2毫升trypsin-ethylenediaminetetraacetic酸溶液在摘要(Gibco BRL,生活技术)和孵化37°C 5分钟。这种酶反应是停在培养基的添加4毫升。合成细胞悬液离心机在200克,持续7分钟,细胞颗粒在9毫升resuspended Amniomax媒介。这些细胞在悬浮再次放在文化的密度3毫升/ 25 cm2 Roux瓶直到汇合的单层孵化器湿润5%二氧化碳大气中得到37°C。

之后,细胞使胰蛋白酶化如上所述,他们被播种在12毫米直径的圆形玻璃盖玻片(Nunclon三角洲表面,热费希尔科学;鲁开德、丹麦)每盖玻片30.000细胞的数量,和他们保持湿润孵化器48小时之前被受到缺氧条件。

这些条件被建立4学习小组:我:细胞健康(CV-SMC)在常氧条件下(也),组2:静脉瘤细胞(VV-SMC)在常氧条件下,第三组:CV-SMC在缺氧条件下(忧郁)第四组:在缺氧条件下VV-SMC。可行的细胞的数量是由台盼蓝排斥和纽鲍尔室数。所有实验进行了一式三份。

2.3。缺氧研究

在常氧条件下平行实验48 h CV和增长VV-SMC细胞受到缺氧的产气囊系统指标(GasPack EZ天然气生成袋;和公司正欲,富兰克林湖,新泽西,美国)减少氧含量≤1%(根据制造商)在6小时。缺氧和厌氧条件确认指标与亚甲蓝溶液饱和每袋。这个解决方案由蓝色变为无色在缺乏氧气(根据制造商)。在缺氧条件下,氧化细胞继续生长的培养基在超过50个小时。

2.4。Alpha-Actin免疫细胞化学

细胞从这个试验被用来确定a-actin的蛋白表达。汇合的smc固定在4%多聚甲醛在4°C 10分钟。一旦固定,细胞水化产物和两次PBS 1 x (pH值7.4)。然后,细胞被洋溢着PBS Triton x - 100年含0.1%,1% BSA, 10%的边后卫在室温下了45分钟。在那之后,主要抗体反α肌动蛋白(稀释1:400)(Sigma-Aldrich)应用在一夜之间在4°C。细胞被洗了三次PBS和孵化1 h与二级抗体室温anti-mouse IgG-biotin共轭(施用)(Sigma-Aldrich)α肌动蛋白检测。然后,样本洗了三次PBS和孵化90分钟在室温下与ExtrAvidin-alkaline磷酸酶(1:200)(Sigma-Aldrich)α肌动蛋白检测。与PBS洗涤后,α肌动蛋白与快红了工具包(Sigma-Aldrich)。细胞核被苏木精染色光复染色的。疣状后,细胞培养是光学显微镜下检查(蔡司)。

2.5。实时rt - pcr

RNA提取通过异硫氰酸guanidine-phenol-chloroform程序使用试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)汇合的smc的文化。RNA被找回的水相,通过添加异丙醇沉淀和孵化一夜之间在-20°C。RNA完整性检查使用1% (w / v)琼脂糖凝胶通过分光光度法和量化。互补DNA合成使用200 ng益生元dT的总RNA,反转录引物(美国Amersham费尔菲尔德,CT)和酶MML V-RT(表达载体)。他们放大了以下具体的互补PCR(表1)。

rt - pcr混合物包含5µl反转录的产品(互补)稀释1:20,10µl智商SYBR绿色Supermix (Bio-Rad实验室)和1µl (6µ米的每个反应引物在最后一卷20µl。rt - pcr进行一个StepOne PlusTM系统(应用Biosystems-Life技术),采用相对标准曲线法(20.]。样本进行10分钟的初始阶段在95°C。互补脱氧核糖核酸扩增的条件是40 95°C的周期15秒,59°C (HIF-1α)或60°C (EGLN3 TGF -β1、VEGF、以挪士,Tie-2 GAPDH) 30年代和72°C 1分钟和15秒的最后阶段在95°C, 1分钟60°C, 15秒95°C和15 s 60°C。荧光测定在每个周期。从每个基因获得的数据是在标准曲线插值由连续稀释混合的研究样本包含在每个盘子。基因表达是规范化记录参考GAPDH基因表达。所有的测试进行了一式三份。结果表达的相对数量mRNA (RQ)。

2.6。统计分析

统计分析,GraphPad棱镜®5.1程序,应用Mann-Whitney U测试。数据表示为均值±平均偏差。设置在p < 0.05(意义),p < 0.005 (),p < 0.001 ()。

3所示。结果

3.1。缺氧对平滑肌细胞的影响健康(CV-SMCs)和静脉曲张的静脉(VV-SMCs)

首先,我们调查了平滑肌细胞的行为从健康和静脉曲张在扩张在体外条件。我们观察到,在含氧培养基,CV-SMCs显示更好的粘附和增殖比VV-SMCs在第一次八小时(数字1(一)和1 (b))。CV-SMCs也有更高的蛋白表达水平α肌动蛋白(图1 (b))。随后,CV-SMCs VV-SMCs受到实验性缺氧条件。在这种情况下,细胞群都观察到有类似的行为(图1 (b))。

研究细胞的行为时,坏死细胞数量的差异观察两组(图1 (c))。在缺氧的条件下(忧郁)CV-SMCs显示显著增加的百分比死细胞对常氧条件(也)(2.96±1.02%也和9.38±0.97%的忧郁,p < 0.005)。显著增加的百分比也观察到VV-SMCs死细胞在缺氧条件下(9.44±1.08%和忧郁和11.78±1.33%,p < 0.05)。当比较两个学习小组在常氧条件下,VV-SMCs显示显著增加的百分比死细胞对CV-SMCs (p < 0.005)。

3.2。表达缺氧的标记

HIF-1的表达α和EGLN3检查,我们的研究结果显示,这些基因的表达显著差异在学习小组实验normoxia和缺氧的条件下(图2)。

为HIF-1 ,CV-SMCs在常氧条件下被观察到的水平明显高于那些在缺氧条件下(93.17±8.42 RQ也与中移动48.61±4.09忧郁,p < 0.005)。在常氧条件下VV-SMCs显示水平显著高于低氧组(136.59±8.72 RQ也与中移动76.07±4.04忧郁,p < 0.001)。当比较CV-SMCs与VV-SMCs组,我们观察到显著提高表达水平(常氧条件下p < 0.05)和实验VV-SMCs缺氧条件(p < 0.005)(图2(一个))。

当研究的基因表达EGLN3,统计上显著的海拔发现CV-SMCs实验性缺氧的条件下(0.81±0.11 RQ也与中移动4.14±0.27忧郁,p < 0.005)。类似的趋势是VV-SMCs观察实验性缺氧期间,尽管水平显著高于CV-SMCs (0.86±0.12 RQ也与中移动6.59±0.44忧郁,p < 0.001)。比较学习小组时,建立了统计上的显著差异的表达水平之间的实验性缺氧条件下EGLN3 CV-SMCs和VV-SMCs (p < 0.005)(图2 (b))。

3.3。血管生成和扩散标记的表情

分析血管生成和扩散,VEGF基因表达,TGF -β1、以挪士和Tie-2研究使用RT-qPCR实验normoxia和缺氧的条件下在体外。我们的结果表明,这些标记物的表达是两个学习小组(图中明显不同3)。

的表达VEGF显示出显著增加CV-SMCs实验性缺氧的条件下(0.67±0.16 RQ也与中移动8.58±0.59忧郁,p < 0.005)。此外,在VV-SMCs实验性缺氧下VEGF明显下降(4.21±0.23 RQ也与中移动0.61±0.09忧郁,p < 0.05)。normoxia条件下,VV-SMCs被观察VEGF的表达水平明显高于CV-SMCs(相比p < 0.005)。当比较两个学习小组,VV-SMCs相比,VEGF表达明显下降的CV-SMCs实验性缺氧条件下(p < 0.005)(图3(一个))。

当TGF - 1研究,CV-SMCs被观察到显著增加表达的条件下实验缺氧(0.50±0.06 RQ也与中移动1.14±0.15忧郁,p < 0.005)。VV-SMCs,没有观察到显著差异表达水平的TGF -β1实验normoxia和缺氧的条件下(0.81±0.08 RQ也和0.54±0.07 RQ忧郁)。当比较两个学习小组,VV-SMCs明显高于TGF -β1的表达水平比CV-SMCs常氧条件下(p < 0.005)。在实验性缺氧条件下,这些VV-SMCs水平明显下降(p < 0.001)(图3 (b))。

的表达水平以挪士没有显著不同的CV-SMCs中移动(0.09±0.02也与中移动0.14±0.03忧郁)。然而,当研究VV-SMCs,显著增加以挪士表达观察实验性缺氧的条件下(0.11±0.02 RQ也与中移动0.36±0.04忧郁,p < 0.001)。比较这两个学习小组,以挪士的表达水平的VV-SMCs在统计学上显著高于CV-SMCs实验性缺氧条件下(p < 0.005)(图3 (c))。

最后,Tie-2进行了研究,并显著降低其表达水平在实验条件下观察CV-SMCs缺氧(7.57±0.49 RQ也与中移动5.87±0.59忧郁,p < 0.005)。VV-SMCs,显著降低Tie-2表达水平也与实验观察缺氧(3.40±0.25 RQ也与中移动2.53±0.14忧郁,p < 0.05)。此外,normoxia条件,Tie-2 VV-SMCs有明显低于CV-SMCs (p < 0.005)(图3 (d))。

4所示。讨论

的各种noxae能够影响静脉壁和它的功能,在以前的研究中显示,稳态平衡和反应的能力不同的条件导致静脉失败(15,16,21,22]。静脉功能不全(静脉曲张)产生静脉壁扩张,导致改变补偿的结构墙,首先在肥大的形式的地区,随后的失败,将成为fibrosclerotic最后的过程13]。这些诱导改变,鼓励和维护的缺血现象,导致细胞活化,进而造成影响静脉壁的功能水平。

缺血过程中发挥着重要作用的过程中静脉壁不足(23,24]。细胞行为让我们推断微血管功能障碍是主要的变更,应考虑(21]。VEGF在血管病理学的重要作用已被许多作者强调,研究提到它在血管生成中的作用和细胞信号(25,26]。Bjarath et al。27)指出,VEGF能引起重建患者的静脉壁的静脉曲张,并可能与遗传因素有关。VEGF可以扮演一个角色在不同的组织细胞反应患者的静脉功能不全,空调影响组织的活动和反应,如皮肤,在静脉溃疡reepithelization过程(25,28]。我们的研究结果表明,在控制、VEGF的表达明显高于在缺氧条件下相比,常氧条件。然而,重要的是,smc的VEGF水平明显高于静脉曲张患者normoxia期间,他们减少长期缺氧的条件下。这些发现表明,细胞从静脉曲张患者患有缺氧可能是处于一种静止的状态,可以显著提高Tie-2等标记。一些作者报道,Tie-2发挥作用的过程中,静止在血管病理学,而在体内平衡,Tie-2是一个潜在的血管生成因子(29日]。VEGF可以影响静脉壁的通透性,直接影响以挪士的水平,这就可以解释这个分子表达的增加缺氧条件下和静脉功能不全(30.]。

炎症是另一个进程的因素,指出对静脉曲张的发展是必要的31日]。金等。32)表现出强烈的VEGF和TGF -的行为之间的关系β1引起组织损伤的病理生理过程。此外,VEGF和TGF -β1已被证明有不同的基因表达水平取决于细胞暴露的条件(33]。我们的结果显示类似的相对表达谱VEGF和TGF -β1;然而,按绝对值计算,VEGF的表达水平高于所有其他的标记研究。

我们的研究结果表明,HIF-1αsmc中差异表达的研究病人和其表达式是逆相关EGLN3的表达。许多作者都认为这个途径对缺氧在慢性静脉疾病管制,导致这些血管生成因子的表达的放松管制34- - - - - -38]。相对于这个事实,EGLN3已被证明作为吸附剂缺氧组织发挥重要作用和对体内平衡也很重要39]。李等人。34,35描述一个HIF-1的重大失衡α在病变血管的肌肉层。

了解静脉壁细胞的细胞行为normoxia和缺氧的条件下基本了解静脉壁以及识别可能的治疗靶点,应该研究。目前的研究中,尽管有一个初步的性格,应该认为细胞均质在同一培养条件。检测之间的显著差异研究人口获得后续的相关性在活的有机体内研究。因此,我们可以假设的条件下静脉功能不全导致持续细胞缺氧的情况。这种情况可以解释发生在静脉壁的细胞反应的代偿机制。在这项研究中,我们演示了两个重要事实。首先,静脉曲张患者的肌肉细胞显示标记研究类似于正常细胞的水平受到缺氧(Hif-1α、VEGF、TGF -β1,以挪士)。,这些细胞稳定遗传或表观遗传变化,维护稳定后的培养基。其次,我们表明,如果缺氧持续从长远来看,这些细胞不再有能力反应有一个失败的因素,试图弥补缺氧(EGLN3)。这一事实使我们之间建立关联的存在一定的标记在病人的血清和反应持续缺氧的能力。此时,新的微rna技术可以帮助建立这样一种关系。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

米格尔·a·奥尔特加和Beatriz罗梅罗平等起到了推波助澜的作用。茱莉亚Bujan Natalio Garcia-Honduvilla分享资深作者。

确认

这项工作是支持由国家卫生研究所卡洛斯三世(FIS-PI18/00846)和B2017 / bmd - 3804 MITIC-CM。