操纵的植物生长调节剂在植物化学的成分和药用植物的DNA保护电位Arnebia benthamii

文摘

Arnebia benthamii家庭的紫草科的濒危植物nonendemic克什米尔喜马拉雅山脉和用于治疗人类疾病。目前的研究是基于开发一个在体外微体繁殖协议相对于感应下的各种次生代谢物在体外条件可能的生物活性。组织培养协议开发答:benthamii第一次在喜马拉雅地区使用不同的组合和适当的媒体配方,包括各种佐剂:Murashige和斯库(MS)媒体、生长激素、糖,琼脂,等等。不同的媒体组合估计的影响,MS +物质(TDZ) +吲哚3-acetic酸(IAA)组合支持更高的再生潜力。大量的化学成分也记录在相同的治疗。的在体外工厂样品还显示一个值得注意的清除羟基自由基的效果相对于DNA免受氧化损伤。的在体外提高植物适合使用抗氧化剂分子的发展。

1。介绍

药用植物治疗制剂治疗人类疾病至关重要。天然植物资源的过度开采鼓励各种程序保护等微体繁殖和增量工厂架构(1,2]。看目前的情况,很大一部分的西北喜马拉雅(NWH)中药材,特别是Arnebia benthamii(墙。约翰斯顿(syn g .不交货)。Macrotomia benthamii(墙)。直流。),have been rendered rare and threatened over the past few years because the demand for various plant products has increased. Even though different initiatives such as habitat protection as well as Seed and Field gene banks have been started, these techniques may still prove inadequate. The tissue culture technique has become established as a very valuable methodology among the different conservation and multiplication practices presently being employed for increasing the number and improving the development of numerous economically important and threatened medicinal plants [2- - - - - -5]。一个。benthamii(墙。约翰斯顿(syn g .不交货)。Macrotomia benthamii(墙)。直流。]家庭紫草科,当地称为Kahzaban,是一种多年生草药生长在喜马拉雅山脉西北部的亚高山和高山地区(6]。它是一种重要的药用植物,突出在59草药的列表在NWH优先保护(6)由于其高灭绝的威胁(7]。它是一个高山草发生在海拔3500 - 4000米,从西方尼泊尔,克什米尔通常在开放的斜坡上用石头或岩石基质。在克什米尔谷地,局限于某些领域如Sinthon, Duksum, Karnah, Gurez, Lolab, Sonamarg,卡吉尔和很少发现(8,9]。它被列为极度濒危nonendemic克什米尔的植物10,11]。答:benthamii已经上市的印度红书数据由于其过度开采用于各种目的(12,13]。许多次生代谢产物(即。,shikonin and its intermediates, alkannins, other naphthoquinones, etc.) have been reported fromArnebiaspp。然而,“Gule Khazaban”,一个非常昂贵的药,是来自答:benthamii(11,13,14]。Arnebia种虫害报道是传统的阿育吠陀药物治疗疾病的喉咙和舌头,发烧,和心脏症状。花儿知道安慰影响心脏病患者(11),而其根源有杀菌和抗菌特性9]。保护现有的种质资源的有用和受威胁的物种,因此,战略需要。Harborne和巴克斯特15)记录的抗癌特性Arnebin 1和Arnebin 3孤立的Arnebia物种,和抗艾滋病活动已经被报道Arnebia euchroma提取(16]。

由于食品的微生物病原体的高发病率和控制抗生素耐药菌株的小说植物提取物(17,18),搜索应该继续繁殖药用植物组织培养生物技术和净化的活性化合物的药用价值开发一种新型的治疗病原体(19]。因此,该研究是采用此开发为贫种质的离体组织培养协议答:benthamii。研究还努力建立的影响植物生长激素诱导的化学成分和抗氧化的潜力在体外提高植物。

2。材料和方法

2.1。化学物质需要

女士中,植物生长激素(BAP / IAA / TDZ / IAA / NAA),氯化汞,琼脂,和溶剂如甲醇(高效液相色谱)、水(高效液相色谱)、乙酸乙酯(高效液相色谱)购买HiMedia,默克公司和其他人。

2.2。工厂收集和验证

整个植物的根和种子答:benthamii收集从Sinthon的克什米尔地区(印度)(3748 m a.s.l。)。几个月的植物收集从2013年7月到9月。植物经过身份验证的克什米尔大学植物标本,植物分类学的中心,加入1748号。

2.3。消毒的种子和媒体选择

种子作为实验材料。种子浸泡一夜之间都用几滴实验室洗涤剂洗净(Labolene)和2 - 3滴渐变20(表面活性剂)洗后运行的自来水。化学消毒的种子是通过治疗用0.1% HgCl链霉素(20分钟),其次是0.1%₂(5分钟)和70%乙醇(45秒)。与热压处理过的种子被洗3 - 4次重蒸馏的水来删除所有的痕迹消毒剂在接种之前Murashige和斯库(MS)基础培养基(20.含有3% (w / v)蔗糖(HiMedia)和0.8% (w / v) Difco Bacto琼脂(HiMedia)。不同的植物生长激素等物质(TDZ),吲哚3-acetic酸(IAA)、激动素(Kn) 6-benzylamino嘌呤(BAP)和吲哚3-butyric酸(IBA)增强了MS培养基为各种形态形成的反应。媒体在121°C 20分钟,消毒和介质的pH值调整到5.5左右。文化在文化孵化室维护 °C 60 - 70%的相对湿度。整个植株与无菌蒸馏水清洗后被移植到花盆包含peat-vermiculite-sand-soil混合物(比1:1:1:1,v / v)。所有的实验都在RBD的方式完成的。每个植物芽的数量和长度都被记录下来。

2.4。各种化学成分的分析

在这个试验中,高四最好的选择是基于植物激素组合shootlet形成。这四个选择治疗被指定为T1、T2、T3、T4和比较植物(T0)收集的自然栖息地。不同的代谢产物进行了分析。

2.5。生物碱

植物样本来自不同的文化条件和浸渍干磨粉形式和2.5 g的每个植物样本提取乙醇(200毫升)和20%醋酸添加4 h。滤液集中大约25毫升和浓缩的。NH₄噢了沉淀的形成。沉淀是进一步用稀释NH洗净₄哦。沉淀是干重,确定生物碱的量。滤液是干和重21,22]。

2.6。酚醛树脂

植物样品粉(1 g)与80%乙醇提取(20毫升)。得到的上层清液蒸发干燥,在5毫升resuspended H₂o . Folin试剂(0.5毫升)被添加到不同的整除(0.1 1毫升),其次是Na₂有限公司₃(2毫升)。最后一卷5毫升用dist.水了。管是保存在一个水浴1分钟和漩涡。阅读是在650 nm标准苯邻二酚(2毫克%)(23]。

2.7。丹宁酸

植物的植物样本(2 g)粉与丙酮提取的3倍(丙酮70%)。的上层清液被dist.稀释3毫升的水。然后,在0.1 M盐酸(即不同的组件。,0.016 K₃[Fe (CN)₆)(1毫升)和0.02 FeCl₃(1毫升))补充道。管保持15分钟后涡流。稳定剂的解决方案(5毫升水,H₃阿宝₄,1%的阿拉伯树胶[3:1:1])补充说,解决方案是revortexed。阅读是在700 nm,决心对没食子酸浓度(1.9毫克%)(24]。

2.8。总类黄酮含量

0.5毫升的植物样品溶液的上层清液(2毫克/毫升)与水混合(2毫升),然后5%纳米₂解决方案(0.15毫升)补充道。然后,10%的间变性大细胞淋巴瘤引起₃解决方案(0.15毫升)添加和允许代表6分钟紧随其后4%氢氧化钠溶液(2毫升),最后成交了5毫升水和允许站了15分钟。在510 nm和水空白吸光度是检查(25]。

2.9。DNA损伤分析

抗氧化剂可能决定通过观察DNA的保护能力在体外植物样品(14]。15μ小牛胸腺DNA的l(25毫克%)是磷酸缓冲盐溶解在20.0毫米(pH值7.4),这个解决方案,添加不同浓度的植物提取物的混合物是孵化在室温下15分钟。然后,氧化物质(即。,1μl(30毫米H₂啊,1μl(20毫米硝酸铁,1μl(100毫米添加了抗坏血酸),和整个反应是1 h在37°C。的反应是停止添加加载染料(40%的蔗糖和0.25%的溴酚蓝)。(0.7%琼脂糖凝胶电泳/ TAE缓冲)运行在100 V观察DNA的变化和由凝胶Doc可视化系统(Labnet,德国)。

2.10。统计分析

整个数据集,采用SPSS软件进行方差分析,和意义是 。

3所示。结果与讨论

3.1。种子萌发和Shootlet形成

消毒种子接种在全职女士和半歇工中补充了赤霉素GA₃-20 (1.5μ米)。完成与观察长芽萌发1/2 MS + GA₃(15μ米)。种子萌发所需的最小时间起始记录20天有78%的种子发芽反应(表相同的治疗1和图1(一))。胚胎拍摄技巧被切除,并进一步在增殖培养基培养使用生长素/细胞分裂素的组合。细胞分裂素BAP和TDZ (1.5 - -10.5μ米)分别使用结合IAA或NAA(浓缩的。范围1 - 10μM)×女士1/2媒介芽的增殖。BAP(4.5的浓度μM)和IAA (4μ米)导致多个芽的平均数(9.1)表现出稍带黑色的基底部分。的数量和浓度的进一步增加,芽和芽的最低数量呈下降趋势被注意到。在另一个试验中,更高的平均数量的多个芽(11)获得了广泛的和健康的芽在1/2 + BAP女士(5.5μ米)+ NAA (5μ米)(图1 (b)和1 (c))。拍摄的技巧答:benthamii×女士1/2基础培养基上培养的补充与不同浓度的TDZ和IAA / NAA导致多个射击与脆性褐色愈伤组织再生的基底区植物组织,与先前的试验相比是相当重要的。最好的反应是得分拍摄技巧3μTDZ和1.5米μM的IAA导致平均20.1多个芽轻微脆性愈伤组织的形成,并与浓度进一步增加10μ米,拍摄数量减少(表被发现2)。在另一个试验中,拍摄技巧培养与不同浓度的TDZ和NAA(0.5 - -10.0结合使用μM)乘法的芽和芽(15.3)的最大平均数量以90%的枪击响应1/2 + TDZ女士(5.0)+ NAA(2.5)较低的脆性褐色愈伤组织形成的基础。然而,应对多个shootlet形成较低相比TDZ / IAA的组合。

不同浓度的IAA / NAA连同BAP / TDZ导致多个射击使用再生浓度进一步增加,导致拍摄数量减少。拍摄的技巧答:benthamii×女士1/2基础培养基上培养的补充与不同浓度的TDZ和IAA / NAA导致多个芽的平均数的20.1倍。这样的结果非常类似于先前的报告番红花(2),莨菪(26),而Cichorium intybus(4,5),TDZ被发现有效地提高shootlet形成。然而,进一步提高在生长素和细胞分裂素浓度没有发现是有利的。同样,器官发生也注意到leaf-derived愈伤组织的Arnebia euchroma(27),Bergenia ciliata(28]。IAA和TDZ的累加效应已经在众多植物等Santolina canescens(29日),柴胡属fruticosum(30.],它证实了,即使是最小的生长素浓度与细胞分裂素相结合积极的射击频率的感应和植物生长。在目前的研究中,结合互动BAP和IBA导致最大的再生芽,这表明他们的相互作用可能导致变化的内源性合成TDZ和IAA,使它不佳或supraoptimal和导致外源性供应满足不同需要的激素(31日]。因此,在a . benthamii提供最优水平的体内激素最大拍摄乘法已经注册成为4μM TDZ和4.5μM IAA。

3.2。根硬化和现场试验

乘法阶段的拉长和semielongated拍摄记录被转移到MS×1/2中补充与不同浓度的IBA / IAA (1.0 - -10.0μ0.5 M)和TDZ (μm - 5.0μ米)的感应和伸长的根(表3)。伸长以及根启动后被发现6-8-week文化时期。长芽的基底区第一变黑,显然变得困难。低浓度的IBA (1 - 2.0μ米)未能促进任何想要的回应。然而,浓度提高时,芽的基底区成为黑,努力,和拉长,从而使水龙头root-like外观,其次是侧根的起始字母,,最高5.3多个黑色短,厚延伸出来记录从主黑硬主根结构等8所示μM IBA和TDZ (4μ米)。再进一步增加浓度没有影响生根。当IBA IAA(1.0 - -10.0所取代μ米),拍摄的基底区再次变得困难,像水龙头root-like结构在不同浓度的IAA。这种组合是卓有成效的根代最大平均根数(8.3)注意到3日μIAA和TDZ (1.5 Mμ米)(表3和图1 (d))。然而,当浓度从3μ米至5.0μ米,没有注意到响应。在某些治疗,易碎的浅褐色愈伤组织不同程度也被记录在不同的浓度。一个协议下形成完整的植株在体外条件和他们的成功转移到温室。细胞分裂素单独使用以及结合茁长素导致某些理想的反应,但最合适的植物生长调节剂被发现的组合软面包卷和IBA和TDZ和IAA最大多个记录。

的在体外提高了植株被成功转移,保存在一个生长室实验室中必要的温度和湿度。最初,帽子文化的瓶瓶包含被移除和文化在体外生植株的答:benthamii保持在孵化室1星期慢慢减少培养瓶内的高湿度条件。之后这些植株从孵化转移到正常情况在体外植株deflasked,琼脂自来水的帮助下被轻微的刷牙。植株被密封在小塑料杯包含一个热压处理过的沙子:土壤:泥炭:蛭石(1:1:1:1)混合物(图1 (e))。盆栽植株被放置在一个生长室的温度20 - 25°C,湿度一到两周的60 - 70%其次是转移到一个温室室。这些植株被转移到温室里,都有超过一个月。然后,植株被转移到净的房子。植株被监控着,他们显示响应他们的成长和发展。植物开始出现增长,这说明他们适应环境的行为。植物转移到温室的数量然后到田野35和64在2013 - 14和2014 - 15,分别。温室里的植物的生存比例是记录为83%和75,而在该领域数量大约是60和67%,分别为(表4和图1 (f))。组织培养技术正在越来越多地利用克隆乘法和在体外保护有价值的种质受到灭绝的威胁。一个有效的程序在体外采用乘法是一个重要的先决条件在体外种质资源保护的技术。目前的调查进行拍摄技巧答:benthamii提供了一个潜在的有效协议这种草药的大众传播和保护。只有一个发表报告在体外的研究答:benthamii(32,目前的研究方法使用广泛的试验与生长激素的使用除了成功的硬化的植株。观察支持从多个芽和起始横向根和最大8.3多个黑色短厚延伸出来记录从主黑色硬质root-like结构3μM IBA和TDZ (4μ米),在早些时候报道了答:euchroma加油,注意到IBA的影响下(27,32,33),因此我们的结果符合。在目前的情况下,IAA被发现是最有效的支持与IBA和NAA相比。IAA在生根的效果可能是由于其更快的吸收比NAA在目前的研究。

在这个实验线,高四最好的选择是基于植物激素组合shootlet形成。四个选择治疗被指定为T1 =软面包卷(4μ米)+ IAA (4μ米),T2 = BAP (6.5μ米)+ NAA (6μ米),T3 = TDZ (3μ+ IAA (1.5 M)μ米),T4 =软面包卷(5μ+ NAA (2.5 M)μ米),而植物(T0 =野生植物)收集的自然栖息地。植物化学的分析的结果应用品种造成的不同类型的芽含有植物生长的各种组合的媒体监管机构(pgr)是描绘在图2。在最近的研究中,观察最高感应的次生代谢物在T3,获得植物大量的酚类(390μg / g)类黄酮(260紧随其后μg / g)和生物碱(235μg / g),这可能是由于特定的影响植物生长调节剂应用于媒体(34]。prg已经产生重大影响的监管生物合成途径在植物各种代谢产物的合成。此外,在体外提高植物记录有较高含量的一些基本的化合物如酚类物质、生物碱和黄酮类化合物。结果符合各种研究人员还报告,发现pgr也可能影响下次生代谢物的产量在体外条件(35,36]。例如,alkamide和无赖的积累紫锥菊angustifolia增加对细胞因子的培养基。代谢产物的生物合成放大是与组织分化,也就是说,丛形成细胞悬浮液或更复杂的结构的形成34),这或许可以解释大量的代谢物的积累在我们的研究培养芽。然而,单宁(123.5μg / g)和萜类化合物(120μg / g)被发现在T0高等植物(图2)。场和之间的整体差异在体外植物可能是由于很多因素如季节变化(32),植株化学成分的变化,和农业气候条件的变化37]。它似乎是相关的接受在体外系统可以作为一个替代来源的代谢物,因此可以利用有效的代这些物质,药物有前途但严重局限在生产14,38]。

3.3。生物活性

氧化物质完全引起DNA降解(图3)。在不同的乙酸乙酯提取物的清除自由基在体外提高植物的Arnebia benthamii保护DNA免受损伤,抗坏血酸(标准)确定。在当前的研究中,甲醇提取物的样品来自各种媒体组合在体外条件显示重要的清除羟基和相对于保护DNA损伤的ct DNA(通道1 - 4)。当前发现的延续以前的报告现场种植植物的DNA的保护作用答:benthamii(14,39]提出一些具有生物活性的化合物的作用清除羟基自由基的13]。这是第一个报告描述的DNA损伤的保护能力在体外提高了工厂,这可能是因为上面确定的各种次生代谢产物的存在。

4所示。结论

在这项研究中,第一个ever-complete协议在体外再生和适应环境场条件下的答:benthamii,NWH濒危药用植物的开发,导致濒危物种保护计划。的在体外提出了植物,尤其是PGR特定的增长,产生了重大影响的存在挥发性/非易失性代谢物。植物提取物的生物功效允许他们尽可能使用在药物制剂对DNA氧化损伤。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由DST, GoI,新德里,批准信不。DST / SSTP / J&K / 11/146 (G) 26/04/2012 Dtd。他们的帮助非常感激。第一作者也感谢的帮助SERB-DST GoI提供财政支持下批准号)YSS / 2014/000590。作者想扩展他们的真诚感谢院长以来在沙特国王大学科学研究的资助这个研究小组(以序列- 271)。

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