上帝抵抗军我从Lactococcus raffinolactisBGTRK10-1, Isoschizomer生态RI,展品离子浓度具体明星活动

文摘

限制性内切酶是主要的防御系统对外国DNA,负责维持基因组的完整性。Lactococcus raffinolactisBGTRK10-1表达上帝抵抗军我II型restriction-modification酶的活动所示类似生态国际扶轮;上帝抵抗军我保护DNA甲基转移酶生态RI乳沟。该基因编码上帝抵抗军我酶克隆和过表达大肠杆菌。纯化酶显示最高的比活度较低温度(13°C至37°C)和稳定后存储在50%甘油−20°C。单价离子的浓度在反应中最佳的活动所需的缓冲区上帝抵抗军我限制性内切酶是100毫米或更高。识别和乳沟序列上帝抵抗军我确定限制性内切酶5′- g / AATTC-3′,表明上帝抵抗军我的限制性内切酶是一种isoschizomer生态RI。在反应中缓冲盐浓度较低,上帝抵抗军我展示明星活动,专门识别和削减另一个替代序列5′- / AATTC-3′,留下相同的粘性的片段作为结束生态国际扶轮,这使得他们clonable成线性化向量。基于序列比对的系统发育分析指出了共同的起源上帝抵抗军我与前所述restriction-modification系统生态RI-like restriction-modification系统。

1。介绍

限制内切酶通常伴随着同源甲基转移酶(1]。两种酶合作形成一个restriction-modification系统(RM系统)。RM系统是重要的原核生物的基因组完整性的维护。生物过程的范围,利用RM系统还包括参与DNA换位(2和重组3]。此外,有证据表明,限制和修饰酶的基因可能在自私的元素(4,5]。

限制内切酶表现出高序列特异性底物绑定和使用通用的DNA裂解机制,因此是很好的模型系统理解DNA识别和磷酸二酯键水解。限制性内切酶的分类根据其亚基组成,代数余子式的要求,识别网站,裂解位点,和行动模式定义不同类型(I、II、III和IV)。限制内切酶II型DNA重组技术是必不可少的工具。看起来今天的现代分子生物学和生物技术产业发展没有II型限制性内切酶。因为他们的重视在基因分析和克隆需要不断发现新的。数据显示变基(6,http://rebase.neb.com]总结所有的信息了解每一个限制性内切酶和任何相关的蛋白质,有超过3945个基因限制性内切酶的特征和生化反应,3834 II型限制性内切酶,299个不同的特异性是已知的。六百四十一年到2010年,限制性内切酶是商用,包括235不同的特异性7]。由于大量的基因组测序,发现新的假定的限制和修饰基因正在迅速上升。相比之下,限制性内切酶,生化特征的数量已经下降到30年前的水平。

限制内切酶II型homodimeric或四聚物的酶切割DNA的定义网站4 - 8 bp在长度和需要毫克^{2 +}离子对催化8]。对于许多限制内切酶II型,发现改性条件(低离子强度、高pH值,存在不同的金属辅因子,和有机溶剂)可以减少他们的底物特异性9- - - - - -13]。在nonoptimal限制条件下,通常这些内切酶裂解退化序列,这不同于标准识别网站只有一个核苷酸。这个变更在小说消化DNA特异性造成乳沟,相似但不相同的序列被定义为酶星活动。修改特异性限制性内切酶(star)可以利用活动促进重组DNA技术因为受控条件相同的酶可以识别不同的DNA序列和分裂在额外的位置(9]。

与相同的限制内切酶识别网站隔离不同的生物称为isoschizomers [7,14]。的秩我发现核酸内切酶Rhodobacter sphaeroides是一个isoschizomer的吗生态RI。酶识别序列GAATTC和坚持它在同一位置(G / AATTC)和氨基酸序列的身份分享50%15]。有趣的是,妈妈我承认CAATTG序列,识别序列的不同生态RI(和秩我)只在外部碱基对。比较的妈妈我用的氨基酸序列EcoR我和秩我发现只有低水平的总体相似所以序列之间的同源性生态国际扶轮和秩我有更强的意义16]。

本工作描述第一次的发生生态在lactococci RI-like restriction-modification基因。目的是克隆、净化和生化和基因lactococcal描述小说上帝抵抗军限制性内切酶。上帝抵抗军我限制酶过表达和纯化的同质性大肠杆菌使用pMAL表达式和净化系统。结果表明,上帝抵抗军我限制性内切酶,尽管isoschizomer的生态RI,显示了不同的特征。特征之一,可以进一步利用明星的活动上帝抵抗军我这是限于识别网站的一个变种,经过乳沟叶子相同的凝聚力作为结束生态国际扶轮和上帝抵抗军我限制性内切酶,所以消化后获得的片段可以克隆没有额外的处理。

2。材料和方法

2.1。菌株和文化条件

Lactococcus raffinolactisBGTRK10-1原地甜kajmak隔绝来自绵羊奶不使用发酵剂的家庭Vlašić山区,中部波斯尼亚和黑塞哥维那(17)(表1)。初步应变分类是根据其发酵能力使用API 50的背影(SA API系统;Bio-Merieux、Montelieu-Vercieu、法国),温度的增长(30°C, 37°C,和45°C),生长在盐(4%和6.5%),pH值和宽容。最终分类的分类BGTRK10-1是由使用引物测序的放大16 s rDNA前所述[18]。应变是生长在M17介质(默克GmbH,达姆施塔特,德国)补充葡萄糖0.5% (w / v) (GM17) 30°C。大肠杆菌DH5α从有氧锻炼,HB101 ER2523株种植在Luria-Bertani(磅)汤在37°C,除非另有说明。固体培养基是由添加1.75% (w / v)琼脂(Torlak,贝尔格莱德,塞尔维亚),液体媒体。抗生素的使用在以下浓度:红霉素300μ100 g / ml和氨苄青霉素μg / ml转化株的选择和维护。5-bromo-4-chloro-3-indolyl -β-D-galacto-pyranoside(半乳糖苷)(Fermentas维尔纽斯,立陶宛)添加到磅中等蓝色/白色板材颜色筛选克隆片段的殖民地在最终浓度为40μ克/毫升。

2.2。粘粒图书馆的建设l . raffinolactisBGTRK10-1

总DNA分离l . raffinolactisBGTRK10-1部分消化Xba限制性内切酶。孵化期间进行1 h和通过添加EDTA是停在不同的时间间隔。最佳消化DNA,让碎片30 - 40 kb,一夜之间被纯化和结扎在16°C pAZILcos向量(19)简化与Xba我限制性内切酶和脱去磷酸。结扎串联体形成高分子量的检查在琼脂糖凝胶和封装到噬菌体粒子使用包装设备(安捷伦科技)。封装粘粒转染到大肠杆菌HB101镁细胞克隆的选择是在300年拉板含有红霉素μ克/毫升。构造粘粒图书馆大肠杆菌是存储在磅含有15% (v / v)甘油−80°C。

2.3。DNA操作

总DNAl . raffinolactisBGTRK10-1孤立了修改方法所描述的霍普伍德et al。20.];对数期细胞和溶菌酶进行预处理(4毫克/毫升,15分钟37°C)与SDS治疗之前。的质粒隔离大肠杆菌QIAprep旋转Miniprep工具包使用根据制造商的建议(试剂盒、希尔登,德国)。标准同时变换用于质粒转移大肠杆菌(21]。与限制性内切酶消化是根据供应商的指令(热费希尔科学)。DNA片段从琼脂糖凝胶纯化使用QIAqick凝胶萃取设备制造商所描述(试剂盒、希尔登,德国)。DNA的结扎和T4 DNA连接酶(美国安捷伦科技)根据制造商的建议。铂™TaqDNA聚合酶高保真(美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆)被用于PCR扩增DNA片段的GeneAmp PCR系统2700热循环仪(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。PCR产物纯化QiAquick PCR净化设备(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的建议。DNA测序是由Macrogen测序服务(Macrogen欧洲,荷兰)。中使用的引物PCR扩增的LraI操纵子(lraIR和lraIM基因)如下:LraRM-Fw (5′-GTATAGAAAGAAGAATCG-3′)和LraRM-Rev (5′-GCAGGGTAATGTTCCTCAC-3′),而以下引物用于超表达上帝抵抗军我限制性内切酶(lraIR基因)pMALc5X向量:LraI-Fw (5′-ATGTCGAGAAAAAATCAGTCG-3′)和LraI-Rev (5′ctcAAGCTTTCTAATTAATCCTTTTTTGC-3′;欣dIII限制网站是下划线)。总DNA (1 ng)和17.9μl再蒸馏的水,2.5μl 10 x PCR缓冲(热费希尔科学),1μ1.5 l混合核苷酸(10毫米)μl (MgCl₂(25毫米),1μ每个引物的l (10 pmol),和0.1μl(铂™TaqDNA聚合酶高保真。使用2700年GeneAmp PCR循环执行(应用生物系统公司),PCR程序由初始变性在96°C(5分钟),30周期的变性(30年代在96°C),退火(30年代在40°C)和聚合(2或1分钟68°C),和一个额外的扩展步骤5分钟在68°C。使用白金™PCR的碎片LraI操纵子放大TaqDNA聚合酶高保真被克隆到pAZIL向量简化Sma我。

2.4。重组上帝抵抗军我限制性内切核酸酶超表达大肠杆菌和净化

PCR片段组成lraIR基因的终止密码子(ATG)通过LraI-Fw / LraI-Rev底漆和铂™TaqDNA聚合酶纯化高保真,消化欣dIII和克隆到pMAL-c5X向量消化厦门我和欣dIII限制性内切酶和转化为ER2523主管细胞(新英格兰生物学实验室有限公司英国)之前转换与pAZIL-LraRM构造(表1)。转化株被选在LA培养皿含有2%葡萄糖,氨苄青霉素100μ300克/毫升,红霉素μ在23°C g / ml。确认的片段出现在适当的方向被限制性内切酶分析(与获得囊我和欣dIII消化)和测序。表达的重组蛋白进行了23°C通过感应0.1毫米异丙基β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)。净化(细胞溶菌作用、亲和色谱法和劈理融合蛋白与Xa蛋白酶)执行根据生产指令(pMAL蛋白质融合和净化系统;新英格兰生物学实验室,英国有限公司)。纯化重组LraI限制性内切核酸酶是存储在厘米−20°C缓冲区(20毫米Tris-HCl pH7.4, 200毫米氯化钠,EDTA 1毫米,和1毫米德勤)包含50%的甘油。

2.5。核酸内切酶分析

核酸内切酶活性被孵化化验各种程度的纯化上帝抵抗军我建议使用酶缓冲时间生态RI(50毫米Tris-HCl, pH值7.5,10毫米氯化镁,100毫米氯化钠,特里同x - 100 0.02%,与100年补充μg / ml BSA;包含1热费希尔科学)μ每50克pBluescipt SK +质粒DNAμl反应混合物1 h在37°C。一个单位的酶活性被定义为纯化上帝抵抗军我的酶,它能够完全减少1μg的质粒DNA 1 h。

反应缓冲区组成的影响上帝抵抗军我酶活性是化验在不同商业缓冲区(缓冲B(蓝色;10毫米Tris-HCl pH值7.5,10毫米氯化镁,100μg / ml BSA),缓冲g(绿色;10毫米Tris-HCl pH值7.5,10毫米氯化镁、氯化钠50毫米,100μg / ml BSA)、缓冲O(橙色;50 mM Tris-HCl pH值7.5,10毫米氯化镁,100毫米氯化钠,100μR g / ml BSA)、缓冲(红色:10毫米Tris-HCl pH值8.5,10毫米氯化镁,100毫米氯化钾,100μg / ml BSA)、缓冲探戈(黄色:33毫米Tris-acetate pH值7.9,10毫米醋酸镁,66毫米醋酸钾,100μg / ml BSA)和缓冲推荐使用生态国际扶轮;热费希尔科学)用于反应1 U的纯化上帝抵抗军我酶和1μg的质粒DNA 1 h在37°C。测量纯化的活动上帝抵抗军我在不同温度1 U的纯化酶上帝抵抗军我和1酶是孵化μg 1 h的质粒DNA在不同的温度下(13°C, 23°C, 30°C, 37°C, 45°C, 60°C,和80°C)。酶活性测定的商业生态国际扶轮限制性内切酶(热费希尔科学)是用作控制。反应是停在另外1/10的体积停止解决方案(50 mM EDTA pH值8日50%甘油、0.02%橙G)和产品被在1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2.6。的决心上帝抵抗军我乳沟网站

确定的确切位置和核苷酸序列在双链DNA的乳沟的站点上帝抵抗军限制性内切酶,pBluescript SK +作为模板。质粒和重组酶消化上帝抵抗军我;完整的消化是经琼脂糖凝胶电泳和消化M13F和M13R测序引物(Macrogen欧洲,荷兰)。同时控制,整个实验是与商业进行的生态国际扶轮限制性内切酶(热费希尔科学)。

2.7。生物信息学分析上帝抵抗军我同系物

在NCBI核苷酸和蛋白质序列搜索数据库进行了与爆炸22)使用lraIR/ LraIR和lraIM/ LraIM序列。限制和甲基化酶酶之间的系统发育推断得到的大型版本6.0 (http://www.megasoftware.net/)。第一个30蛋白质参考序列生态RI-like核酸内切酶和甲基转移酶酶选择根据BLASTP搜索结果和LraI restrictase和LraI甲基化酶序列分别是修剪和对齐使用Clustal W (23使用默认参数。系统发育树构建的最大似然(ML)方法使用Tamura-Nei模型。引导1000复制用来推断毫升树的信心水平。

DNA片段携带基因的核苷酸序列编码上帝抵抗军我restriction-modification系统和16 s rRNAl . raffinolactisBGTRK10-1提交ENA基因库在加入数字LT222052 LT854837,分别。

3所示。结果与讨论

3.1。的识别上帝抵抗军我(生态RI-Like)甲基化酶的活动l . raffinolactisBGTRK10-1

嗜中温乳酸细菌l . raffinolactis流行在乳制品,如原料奶、天然乳品发酵剂,各种各样的奶酪。l . raffinolactisBGTRK10-1是一种天然的隔离从原地年轻甜美kajmak生产Vlašić中部山区的波斯尼亚和黑塞哥维那(17]。应变BGTRK10-1被选中,是因为其强大的autoaggregation表现型。为了构造应变粘粒库BGTRK10-1克隆编码基因(s)聚合能力,应变的总DNA与多个限制性内切酶(包括消化生态国际扶轮)。它已被观察到生态国际扶轮不削减孤立的DNA,在几次,与其他使用限制性内切酶。这是怀疑应变具有RM系统(名叫上帝抵抗军l . raffinolactis),同样认识到DNA序列生态国际扶轮RM系统。因此,甲基化酶活性的菌株l . raffinolactisBGTRK10-1,保护其DNA从消化生态国际扶轮限制性内切酶,很意外地发现了在常规实验室工作。

限制内切酶,通常称为限制性内切酶,广泛存在于原核生物。限制性内切酶的主要功能是防止外来基因物质,特别是对噬菌体的DNA。几个restriction-modification系统在lactococci已确定。大多数质粒编码的噬菌体抗性机制和功能,这是非常重要的菌株用于乳制品行业而言,预防噬菌体感染和细胞溶菌作用25- - - - - -29日]。

3.2。选择克隆携带上帝抵抗军我从粘粒RM操纵子库

粘粒DNA分离Xba我粘粒图书馆大肠杆菌HB101和1μg总粘粒克隆的DNA混合受到消化生态国际扶轮限制性内切酶直接转化为DH5之后α主管细胞。粘粒DNA分离获得的转化株抵抗复检生态国际扶轮限制性内切酶消化。一个粘粒,名叫pAZILcosLra提供阻力生态国际扶轮限制性内切酶消化被选中作进一步分析:subcloning和DNA测序(表1)。

3.3。LraI操纵子为RM系统提供了阻力生态国际扶轮限制性内切酶消化

本地化的最小遗传单位在粘粒pAZILcosLra负责消化的阻力生态国际扶轮限制性内切酶,粘粒pAZILcosLra消化了一些限制性内切酶(Xba我生成了四个片段,欣dIII-three片段,班我第四碎片,生态RV-three片段)然后subcloned pBluescript SK +矢量与相应的限制性内切酶消化。只有一个构造,pBSLraCla(获得班我),重建了阻力生态国际扶轮限制性内切酶消化(表1)。的班我4239个基点的DNA片段为抵抗携带完整的信息生态国际扶轮消化完全测序引物行走。四个完整(生态RI-like核酸内切酶,生态RI-like甲基化酶,假想的蛋白质,和站点特定的整合酶),一个截断(五肽重复包含蛋白质),和一个部分(N(5) -(羧乙基)鸟氨酸合成酶)开放阅读框(orf)显示班我的DNA片段(图1)。位置LraI RM操纵子的基因组应变BGTRK10-1表明操纵子的可能性是通过水平基因转移;守恒lactococcal五肽重复包含的蛋白质的基因的中间被打断后立即由LraI RM操纵子和甲基化酶基因定点整合酶基因。这个事件发生在遥远的过去表示,额外的突变积累在五肽的基因重复的第一部分包含蛋白质,很可能由于nonfunctionality。restrictase和甲基化酶基因之间的距离是10核苷酸没有启动子和核糖体结合位点,在其他EcoRI-like操纵子,强烈表明多顺反子RNA转录从上游启动子和翻译共识苏格兰皇家银行(AGGAGA) 4核苷酸远离ATG restrictase基因的密码子。

确认的功能上帝抵抗军我restriction-modification操纵子,一个地区,包括(lraIR和lraIM)基因放大使用LraRM-Fwand LraRM-Rev引物(详细信息请参阅部分2。2)和克隆到pAZIL向量构造pAZIL-LraRM。构建携带只有这两个基因完全测序而抵抗生态国际扶轮限制性内切酶消化被确认在体外。

3.4。克隆、超表达和纯化上帝抵抗军我限制性内切核酸酶

质粒克隆pAZIL-LraRM用作放大矩阵的开放阅读框编码上帝抵抗军我和引物LraI-Fw和LraI-Rev限制性内切核酸酶。自欣dIII限制网站已经集成到LraI-Rev底漆,获得扩增片段最初处理欣dIII提供定向克隆PCR片段到表达载体pMAL-c5X,消化了厦门我和欣dIII限制性内切酶。结扎混合变成了ER2523细胞以前pAZIL-LraRM转换函数的向量表示上帝抵抗军甲基化酶,为了保护转化细胞的核酸酶的活动上帝抵抗军我对自己的。转化株的ER2523 / pAZIL-LraRM pMAL-cX5LraI成功获得选择进行了23°C时在300年洛杉矶选择性板块(红霉素μ100 g / ml和氨苄青霉素μg / ml)含2%葡萄糖以减少酶的表达。三个克隆(名叫pMAL-cX5LraI-29, pMAL-cX5LraI-31, pMAL-cX5LraI-42表1)选择限制性内切酶分析,完成测序,超表达的酶。上帝抵抗军我限制核酸酶被一夜之间成功地在所有三个克隆与0.1毫米IPTG诱导23°C和纯化使用直链淀粉树脂和劈裂Xa蛋白酶(劈开麦芽糖结合蛋白之间的融合蛋白,克隆提供释放完全相同的蛋白作为天然)。过度的上帝抵抗军一夜之间我在上述条件下限制性内切酶(与0.1毫米IPTG诱导23°C)代表的结果类似于其他研究人员观察到结果(30.]。可能的解释可能是限制性内切酶的表达在更高的温度是有毒的。

纯化上帝抵抗军我从所有三个限制性内切酶克隆存储在厘米−20°C缓冲甘油为50%。

3.5。功能分析,确定离子强度和温度的最佳提纯上帝抵抗军我核酸内切酶活性

考虑到上帝抵抗军我RM系统提供完整的保护消化生态国际扶轮核酸内切酶,它认为它承认并劈开相同的核苷酸序列。由于质粒pBluescipt SK +包含一个生态国际扶轮网站限制多克隆地区用于净化的功能分析上帝抵抗军限制性内切酶。具体活动(1 U)的纯化上帝抵抗军我确定限制性内切酶生态国际扶轮反应缓冲区(热费希尔科学)37°C。不同级别的上帝抵抗军我在选择限制性内切酶表达观察克隆,但具体活动(U /μ克纯化蛋白质)几乎是相同的(1 U / ng)中克隆pMAL-cX5LraI-29、pMAL-cX5LraI-31 pMAL-cX5LraI-42(图2)。

确定最佳温度上帝抵抗军我活动,纯化酶与pBluescipt SK孵化+矢量在温度从13°C到80°C。上帝抵抗军我在较低温度下酶显示最高的活动(13°C和37°C)之间,在45°C和高温部分切割DNA(图3)。然而,这是一致的最佳生长温度应变BGTRK1-10 (30°C)。简单,因为第一次的描述生态在1970年国际扶轮限制性内切酶(31日),已报告500多isoschizomers或预测水平很高的认同(50 - 70%)指向广泛分布在不同类群的物种和指示可能共同的起源。看来,一些特定的特性,如最佳工作温度,分化取决于酶的最适生长温度产生细菌,这就是为什么我们认为上帝抵抗军我表现出更好的活动在较低的温度。这是发现商业生态RI(用作控制)显示高活动45°C相比上帝抵抗军我酶指向这两个酶的区别。

此外,稳定的上帝抵抗军我酶测试后不同时期的存储在−20°C;上帝抵抗军我酶没有失去活动存储超过六个月后−20°C CM缓冲甘油为50%。

建立最优反应缓冲盐浓度上帝抵抗军B我酶活性不同的商业缓冲,缓冲,缓冲,缓冲啊,R缓冲,缓冲探戈和缓冲推荐使用生态RI(热费希尔科学)。上帝抵抗军我酶表现出高缓冲和具体活动和100毫米高盐浓度(图4,推荐使用的缓冲区生态RI,缓冲2 x探戈和缓冲O),除了在缓冲区R(红色)(10毫米Tris-HCl pH值8.5,10毫米氯化镁,100毫米氯化钾,和100年μg / ml BSA)(图4;缓冲R)。注意到,在缓冲区离子强度较低,上帝抵抗军我酶表现出特定的明星活动,减少向量在另一个位置(图4;缓冲区1 x探戈,缓冲B,缓冲G)。

有趣的是,在B缓冲区和缓冲区G商业生态国际扶轮限制性内切酶表现出较弱的活动,部分消化。

3.6。上帝抵抗军我是一个Isoschizomer生态国际扶轮

双链裂解DNA的测序上帝抵抗军我酶显示上帝抵抗军我认识到相同的酶核苷酸序列(5′- G / AATTC-3′),正如所料,和削减它在同一位置(G和之间)生态国际扶轮酶(图5)离开相同的粘性的目的。相同的乳沟结果上帝抵抗军我从所有三个克隆酶纯化支持我们的结论上帝抵抗军我酶是一个isoschizomer生态RI。

3.7。决心的裂解位点上帝抵抗军我活动

限制性内切酶的重要特征之一是其高特异性序列为了充分提供保护的功能基因组的完整性。此外,它成立nonoptimal条件的限制性内切酶可能会表现出修改的特异性,这样相同的限制性内切酶可以识别和分裂DNA在其他位置规范[32]。为生态国际扶轮限制性内切酶,发现在低离子强度和高pH值酶转换让它能够识别和摘要缩短tetranucleotide序列5′- / AATT-3′(32]。这个活动被称为明星活动,通常称为““邻中也检测到酶的名称和其他限制性内切酶和可以用来分裂DNA克隆目的的其他网站。为了被用于克隆明星限制酶活性(i)应限于有限数量的序列变异,(2)提供相同的粘性结束结扎成向量,和(3)是由多变的控制条件。

确定的裂解位点上帝抵抗军我活动,消化后获得的672个基点的片段pBluescipt SK +缓冲与低离子强度(1 x探戈;热费希尔科学)(图6(一))被克隆到pAZIL向量简化上帝抵抗军孤立的质粒(名为pAZIL-LraI672 pbs;表1)选择白人殖民地第一次检查的DNA片段分析672个基点的限制上帝抵抗军我的酶,然后排序。整个片段的序列以及相邻区域的矢量显示克隆片段来自672个基点pBluescipt SK +被切断了上帝抵抗军我酶活性在位置(701生态国际扶轮)和在其他位置(29)的5′-AAATTC-3′序列存在。同样为三个独立的克隆测序结果证实额外的识别和裂解位点上帝抵抗军我活动5′- / AATTC-3′序列。可以肯定的是,只有AAATTC序列识别和裂解上帝抵抗军我活动,而不是其它序列替代变化GAATTC网站内搜索分析其他替代品的存在质粒序列。因为所有选择与一个核苷酸的变化识别序列存在于pBluescipt SK +(除了AAATTC,在位置29岁以下GAATTG识别序列,在647位置;CAATTC, 850位置;TAATTC位置2824被发现),但没有裂解,我们得出这样的结论:上帝抵抗军我活动具体识别和劈开退化的只有一个变体识别序列(5′- / AATTC-3′)。进一步测试获得的结论pBluescipt SK +质粒pAZIL序列进行了分析和接受消化上帝抵抗军我条件下酶诱导星活动。获得的消化与预测的预期结果完全相关(9个职位/碎片)(图6 (b)),所以我们可以得出结论上帝抵抗军我的活动仅限于只有一个变体识别序列给予相同的粘性结束后,在最优条件下使产生的碎片上帝抵抗军我活动clonable没有进一步的处理上帝抵抗军我或生态国际扶轮对待向量。

上帝抵抗军我限制性内切酶明星活动符合所有给定的要求:它只承认一个变量序列的映射和克隆可以使更精确的限制,提供相同的粘性末端兼容生态RI(包含大多数克隆载体),完全是由低离子浓度和/或高博士控制这两个因素诱发明星的活动上帝抵抗军我限制性内切酶、低离子强度(缓冲区1 x探戈)和缓冲高pH值(缓冲R, pH值8.5),也影响生态相比之下,国际扶轮,但上帝抵抗军我认识到只有一个额外的序列表达更具体的明星活动。

3.8。系统的相似性上帝抵抗军我和其他人属于Restriction-Modification酶生态RI-Like集团

搜索的限制性内切酶识别5′-GAATTC-3′526年变基透露目前公认的序列生态RI-like蛋白质。蛋白质分析表明,爆炸196限制性内切酶在NCBI数据库(从各种微生物)份额超过50%的身份至少50%的蛋白质覆盖率上帝抵抗军我的酶。观察最高身份的限制内切酶链球菌(猪链球菌68%,链球菌dysgalactiae64%,变形链球菌64%)。有趣的是,相似但更高的身份观察上帝抵抗军我又一次甲基化酶,与链球菌(链球菌pseudopneumoniae74%,猪链球菌73%,变形链球菌73%,链球菌dysgalactiae68%)。观察相似比例的身份还在核苷酸水平(大约70%)上帝抵抗军我restrictase和甲基化酶基因。事实上,大多数生态国际扶轮isoschizomers,不像其他限制性内切酶,有着高水平的身份,表明他们的共同起源(7]。

系统发育树构建的上帝抵抗军我restrictase(图7(一))和甲基化酶(图7 (b))的酶。系统发育分析显示上帝抵抗军我同系物(限制性内切酶和甲基化酶)可分为两个主要的分支,一个(可另外细分,包括关闭同源染色体(革兰氏阴性细菌和蓝藻门)和其他同系物组成物种属于厚壁菌门的门。属的位置Fibrobacter(门:Fibrobacteres)仅由两个物种是有趣的;restrictase酶属于一个分支,而甲基化酶蛋白质属于其他(图7)。

4所示。结论

我们发现了一个强有力的II型限制性内切核酸酶l . raffinolactisBGTRK10-1,名叫上帝抵抗军即识别和乳沟序列上帝抵抗军我确定限制性内切酶5′- g / AATTC-3′,表明上帝抵抗军我的限制性内切酶是一种isoschizomer生态国际扶轮但具有不同特点。特点之一,已经彻底研究了明星的活动上帝抵抗军我仅限于一种变体的限制性内切酶识别网站和削减另一个替代序列5′- / AATTC-3′留下相同的粘性的片段作为结束生态国际扶轮,消化后容易获得的片段克隆没有额外的处理。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

教育部、科学和技术发展的塞尔维亚共和国、塞尔维亚、支持这项工作(批准号173019)。

引用

1. t . a . Bickle d·h·克鲁格,“生物DNA的限制,”微生物学和分子生物学的评论卷,57号2、434 - 450年,1993页。视图:谷歌学术搜索
2. y . a b·海克曼,美国诉马修·e·w·5月,n . l .克雷格和f . Dyda“意想不到的DNA重组结构多样性:限制性内切核酸酶连接,”分子细胞,5卷,不。6,1025 - 1034年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. m·谬克g . Grelle j . Behlke r·卡夫d·h·克鲁格和m .路透社“EcoRII:限制性内切酶发展的复合功能吗?”EMBO杂志,21卷,不。19日,5262 - 5268年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. t . Naito k Kusano,小林,“restriction-modification系统的自私行为,”科学,卷267,不。5199年,第899 - 897页,1995年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. 小林,”行为自私restriction-modification系统移动元素及其对基因组进化的影响,“核酸的研究卷,29号18日,第3756 - 3742页,2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. r . j .罗伯特t . Vincze j . Posfai和d . Macelis”变基一个数据库进行DNA限制和修改:酶,基因和基因组,”核酸的研究卷,38 D234-D236, 2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. A . Pingoud g·g·威尔逊,w . Wende”II型限制内切酶——历史的角度来看,“核酸的研究,42卷,不。12日,第7527 - 7489页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. a . Pingoud和a . Jeltsch”II型限制性内切酶的结构和功能。”核酸的研究卷,29号18日,第3727 - 3705页,2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. t . i Tikchonenko e . v . Karamov b . a . Zavizion和b s Naroditsky”EcoRI *活动:酶改性或附带的核酸内切酶的激活?”基因,4卷,不。3、195 - 212年,1978页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. m·纳斯里和d·托马斯,“放松特定核酸内切酶的识别序列HlndIII,”核酸的研究,14卷,不。2、811 - 821年,1986页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. m·纳斯里和d·托马斯”变更的特异性pvuII限制性内切核酸酶,”核酸的研究,15卷,不。19日,7677 - 7687年,1987页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. f·巴兰尼,TaqI“明星”反应:链偏好揭示形成氢键供体和受体网站在标准序列识别中,“基因,卷65,不。2、149 - 165年,1988页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j . Bitinaite Schildkraut(希尔德克劳特),即,“自有的特异性DNA末端放松SgrAl限制性内切核酸酶,”美国国家科学与美利坚合众国,卷99,不。3、1164 - 1169年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. r·j·罗伯茨和k·莫里“限制性内切核酸酶。”生物化学和分子生物学的关键评论,4卷,不。2、123 - 164年,1976页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. f·h·斯蒂芬森b·t·巴拉德h·w·波伊尔,j·m·罗森博格和p . j .格林”比较的核苷酸和氨基酸序列RsrI EcoRI限制内切酶,”基因,卷85,不。1,1-13,1989页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. t . Chuluunbaatar t . Ivanenko-Johnston m . Fuxreiter et al .,”一个EcoRI-RsrI嵌合限制性内切核酸酶保留父母序列特异性,”Biochimica et Biophysica学报(BBA)——蛋白质和蛋白质组学,卷1774,不。5,583 - 594年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. a . Terzic-Vidojevic米,g . Uzelac et al .,”表征的乳酸细菌隔绝手工Travnik年轻的奶酪,香膏和甜kajmaks四季,”食品微生物学39卷,27-38,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. b . Jovčićj . Begovićj . Lozo l . Topisirović和m . Kojić“十二烷基硫酸钠利用动力学和应变假单胞菌的抗生素敏感性sp, ATCC19151”生物科学档案,卷61,不。2、159 - 164年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. m .曲b . Jovcic i Strahinic et al .,“克隆和表达小说lactococcal聚合因素从Lactococcus lactis无性系种群。lactis BGKP1。”BMC微生物学第265条,卷。11日,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. d·a·霍普伍德j . m .围涎,j·f·蔡特et al .,基因操作的链霉菌属:一个实验室手册,1985年。
21. d . Hanahan”研究转变大肠杆菌与质粒分子生物学杂志,卷166,不。4、557 - 580年,1983页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. s . f . Altschul t·l·马登a·a·谢弗et al .,“豁裂的爆炸和PSI-BLAST:新一代的蛋白质数据库搜索项目,“核酸的研究,25卷,不。17日,第3402 - 3389页,1997年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. m·a·拉金g . Blackshields n . p .布朗et al .,“Clustal W和Clustal X 2.0版本,”生物信息学,23卷,不。21日,第2948 - 2947页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. h·w·波伊尔和d . Roulland-dussoix互补分析大肠杆菌DNA的限制和修改,“分子生物学杂志第41卷。。3、459 - 472年,1969页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. c·希尔,k .皮尔斯,t·R·Klaenhammer”接合质粒pTR2030编码两个噬菌体在lactococci防御机制,限制修改(R + / M +)和流产感染(Hsp +),“应用与环境微生物学,55卷,不。9日,第2419 - 2416页,1989年。视图:谷歌学术搜索
26. s . Moineau s Pandian, t·r·Klaenhammer”限制/修改系统和限制性内切酶更有效lactococcal噬菌体,最近在乳制品行业出现了“应用与环境微生物学卷,59号1,第202 - 197页,1993。视图:谷歌学术搜索
27. k·d·j . O ' sullivan Zagula, t·r·Klaenhammer”体内由LlaI限制是由三个基因编码的,安排在一个操纵子llaIM,共轭Lactococcus质粒pTR2030,”细菌学期刊,卷177,不。1,第143 - 134页,1995。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. n . Nyengaard f . k . Vogensen, j . Josephsen”Restriction-modification系统lactococcus lactis,”基因,卷157,不。十三至十八1 - 2,页1995。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. a·马德森和j . Josephsen”的克隆和表征lactococcal plasmid-encoded II型限制/修改系统,LlaDII,”应用与环境微生物学,卷64,不。7,2424 - 2431年,1998页。视图:谷歌学术搜索
30. D.-H。钟,j·r·哈迪,j·法卡斯和j . Westpheling”CbeI的识别和表征,一种新型耐热性的限制性内切酶从Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725和新的HaeIII-like酶亚科的一员,”工业微生物学和生物技术杂志》上,38卷,不。11日,第1877 - 1867页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. r . j .罗伯特“限制性内切酶如何成为分子生物学的中心,“美国国家科学与美利坚合众国,卷102,不。17日,第5908 - 5905页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. b . Polisky·格林·d·e . Garfin b·j·麦卡锡h·m·古德曼和h·w·波伊尔,“特异性底物识别的EcoRI限制性内切核酸酶,”美国国家科学与美利坚合众国,卷72,不。9日,第3314 - 3310页,1975年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2018 Marija Miljkovic et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。