文摘

抗菌肽(安培)是获得利益作为潜在的治疗药物。肽来源于牛某B (LfcinB)已报告表现出抗菌活性,和LfcinB RRWQWR序列是已知最小的主题展览抗菌和细胞毒性的活动。我们的目标是检查的影响multicopy RRWQWR图案的安排,对其抗菌活性与罹患卫生保健相关感染病(hcai)。线性和分支肽包含RRWQWR主题使用固相肽synthesis-Fmoc / tBu生成方法,纯化,利用反相高效液相色谱法和特征matrix-assisted激光解吸/电离飞行时间质谱分析。对于每个肽,抗菌活性金黄色葡萄球菌(写明ATCC 25923和33591株)和肺炎克雷伯菌(写明ATCC 13883和700603株)是通过测量评估最低抑制和最低杀菌浓度,在对数生长期。细胞扫描电镜观察到,溶血活性肽的评估。总体的结果表明,与线性类似物相比,多价的演讲RRWQWR主题增强其抗菌活性对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌甚至在耐药菌株。

1。介绍

直到最近,“医院”这个词用来指任何疾病获得下一个病人医疗护理(1),尤其是参照住院病人感染了。最近,一个新的表达式,“罹患卫生保健相关感染病”(hcai),建立了指感染住院。卫生保健相关感染是严重的健康问题的主要危险因素,可以导致死亡2]。

一些微生物,如原生动物、真菌、病毒、细菌和分枝杆菌,可引起hcai,但负责大约90%的感染(3]。各种卫生保健相关感染的细菌感染的发病率变化随着时间的推移,取决于该地区(1]。目前,病原体通常hcai包括引起的金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌,粪肠球菌(4]。

此外,过度和传统广谱抗生素的不当使用,尤其是在医疗场所,增加了对传统抗生素和细菌耐药性的流行导致了增加卫生保健相关感染耐药病原体引起的感染(1]。新的抗菌药物分子的设计有效对抗耐药细菌对抗生素耐药性克服和控制是至关重要的。

一个有前途的组织潜在的领导结构对抗生素抗菌肽(安培),因为它们是自然衍生化合物抗菌活性。新安培的合理设计提供了希望增强生物活性和更便宜、更高效的生产。理性的设计方法包括在硅片的方法。大规模、高质量的生产重组可以通过使用烟草花叶病毒和基因编辑技术,如CRISPR(定期聚集空间短回文重复)重组肽生物合成(5]

在这个AMP集团肽来源于LfcinB蛋白质已报告表现出抗菌活性。肽来源于牛某B (LfcinB)已报告表现出抗菌活性(6]。RRWQWR LfcinB序列是最小的主题,表现出抗菌活性(7,8),以及细胞毒性效应(9]。我们集团的先前的研究已经表明,这个序列图案具有抗菌活性虽然是最小的6,8,9]。我们的目标是检查各种安排的影响的多个副本RRWQWR主题与卫生保健相关感染细菌的抗菌活性。

2。材料和方法

2.1。微生物

所有的微生物都从美国购买类型文化集合(写明ATCC)。确定合成肽的抗菌活性与卫生保健相关感染细菌,金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923和写明ATCC 33591株了敏感和耐药菌株革兰氏阳性微生物种类,分别肺炎克雷伯菌写明ATCC 13883和写明ATCC 700603的敏感和耐药菌株革兰氏阴性的物种。

2.2。抗菌肽

改善RRWQWR图案的抗菌活性金黄色葡萄球菌和k .肺炎,我们的方法是基于主题重复线性或分支衍生肽(10]。使用固相多肽合成的多肽合成-(许可证)Fmoc / tBu方法论,我们组(之前报道的8,9]。记住酰胺化肽有更高的生物活性,肽形成和评估工作进行了使用Rink-amide作为一个坚实的支持,为了获得羧基端肽与酰胺功能。肽的纯度> 90%,确定通过反相高效液相色谱法(rp)分析。肽所预期的分子量,验证了matrix-assisted激光解吸/电离飞行时间质谱(MS MALDI-TOF)。形成的肽被存储为冻干产品。获得二聚肽,di-FMOC-protected赖氨酸,同时使合成的两个肽链(一个α氨基酸组和其他的ε氨基酸组的氨基酸)[6]。四聚物的肽是通过二硫键的形成(图1)。简而言之,纯化肽(RRWQWR)2-K-Ahx-C氧化使用10%二甲亚砜在缓冲区PBS pH值7.5在室温下,依照Leon-Calvijo et al。6]。


图1
表示的四聚物的RRWQWR主题肽分子。

多肽分子合成,表现为“Sintesis y Aplicacion de Moleculas Peptidicas(桑普)”研究小组的理学院所de哥伦比亚。

2.3。确定最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)

肽的抗菌活性测定和控制执行根据美国国家临床实验室标准委员会方法M7-A7 [11]。麦克风和MBC值测定用肉汤采用和生长抑制法(12与一些修改)。短暂,麦克风化验是由液体抑制增长试验在一个未经处理的无菌乘96孔细胞培养板。细菌培养在Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯)。三个殖民地被转移到8毫升Mueller-Hinton肉汤(MHB)和孵化37°C到mid-exponential增长的阶段。文化的浊度测量和调整spectrophotometrically麦克法兰标准0.5,然后稀释至最后一个5×10的浓度7集落形成单位(CFU) /。合成抗菌肽候选人股票的解决方案被稀释的最终浓度每200年,100年,50岁,25岁,12.5和6.25μm .每个浓度三重复重复的评估分析。

井包含MHB细菌培养液仅作为细菌生长控制。额外的控制包括MHB单独和MHB环丙沙星(CIP) (2μg / mL)和细菌作为一种积极的控制。微型板块孵化24 h在37°C,和增长抑制了监测光密度在620 nm (OD620年)。麦克风被定义为最低的肽浓度,抑制细菌增长> 90%。

确定MBC,从每个麦克风的测定是一个整除传播到尼古拉斯。经过18 h在37°C,抑制细菌生长的浓度决定。执行这些测试四次。MBC被定义为肽的浓度最低,细菌的数量减少了99.9%在体外(12]。

2.4。电子显微镜

使用扫描电子显微镜(SEM)观察细菌的形态。金黄色葡萄球菌和k .肺炎菌株生长mid-logarithmic阶段和调整spectrophotometrically麦克法兰0.5标准,对应~ 1×108CFU /毫升。随后,1毫升细菌悬液分成3管,和肽(二聚的和四聚物的分子)添加到两个管3 x麦克风。第三种文化,没有肽,被用作控制。样本孵化耗氧在37°C 2 h,和细菌悬液离心机在1459 g×3分钟,洗两次与Millonig磷酸盐缓冲剂(0.10米,pH值7.4)。SEM,每个样本与1毫升2.5%戊二醛固定在4°C 2 h。固定样本脱水乙醇梯度(70,80,90,和100%)20分钟和离心机1459 g×10分钟。细菌颗粒悬浮在100%乙醇和风干。最后,幻灯片被录音到存根,涂以金使用群体Q150R溅射涂布机,和观察范广达200 - r SEM。

2.5。溶血性活动

人类红细胞来自健康人类的血液样本被离心收获162×7分钟g和水洗三次磷酸盐(PBS)。红细胞(2%血细胞压积在PBS)孵化与肽分子在几个浓度(6.25,12.5,25、50和100μ为2 h M), 37°C。PBS作为消极的控制和无菌蒸馏水作为积极控制溶血(100%的溶血)。盘子随后离心机在1459 g×10分钟在4°C。整除的浮在表面的每个(75μL)转移到一个新的很仔细的96孔板,和溶血性活动是通过测量评估OD492年使用一个容易专家+标。重复的实验,和肽溶血活动计算。

3所示。统计分析

数据使用SPSS 11.0软件进行了分析和提出了均值±标准差。

4所示。结果

4.1。抗菌肽

对于这个研究,五肽(表1通过许可证)包含RRWQWR主题合成,使用手动Fmoc / tBu策略。具体来说,我们生成一个线性LfcinB主题(20 - 25),一个回文序列(PLS),和LfcinB(17-31),这被认为是一个抗菌肽参考,根据Leon-Calvijo结果之前报道et al。6]。回文序列不是回文是但它转移序列为了增加主题肽的大小在一个线性设计,同时保持相同的净电荷。另外一个二聚的肽合成和四聚物的肽作为分支。肽在无菌注射用水解决方案准备,消毒了0.22μm过滤,储存在−20°C。

表1
抗菌肽来源于LfcinB在这项研究中。
4.2。抗菌活性的肽分子设计

我们检查了抗菌活性肽的浓度。具体剂量反应概要文件为每个肽分子,观察和资料根据不同应变评估及其对抗生素的敏感性。

4.3。麦克风和MBC的决心

图2显示了特定的抗菌活动概要文件为每个肽对代表的敏感和耐药菌株革兰氏阳性微生物金黄色葡萄球菌。肽在应变主题没有显著的影响。然而,回文在一般显示抗菌活性肽浓度≥74到148μ克/毫升(≥50到100μ米)的敏感和耐药菌株。同样,LfcinB参考肽,先前报道对其它细菌病原体具有抗菌活性,抗菌活性,但只影响了耐药菌株,在浓度≥100μ克/毫升(≥50岁μ米)。低,这个分子的浓度并没有表现出抗菌活性,且仅浓度≥199μ克/毫升(≥100μ米)表现出显著的抗菌效果。二聚和四聚物的肽分子表现出一个强大的对细菌生长的影响,存在剂量依赖的相关性对敏感和耐药的影响金黄色葡萄球菌,和最强的效果观察敏感菌株,在浓度≥14μ克/毫升(≥6.25μ米)和≥29μ克/毫升(≥12.5μ米)。


图2
剂量依赖性的影响在两个肽金黄色葡萄球菌菌株。

集中表现在μg / mL为每个肽报道在表2。

表2
抗菌活性的合成肽来源于LfcinB RRWQWR主题对卫生保健相关感染病原体。

相反,与革兰氏阴性结果k .肺炎类似的压力测试(敏感和耐药)与所有分析肽分子。图3显示了特定的抗菌肽对每个活动的状况k .肺炎。肽的主题没有实质性影响应变,在任何浓度。回文肽表现出类似的抗菌活性与敏感菌株浓度≥74μ克/毫升(≥50岁μ米);然而更高浓度所需的耐药菌株诱导类似抗菌活性≥148μ克/毫升(≥100μ米)。LfcinB参考肽表现出类似的主题肽抗菌活性菌株,而支二聚的和四聚物的肽都表现出强烈的抗菌活性浓度≤27μ克/毫升(≤12 5μ米)和≤57μ克/毫升(≤12 5μ米),分别对敏感和耐药k .肺炎。


图3
剂量依赖性的影响在两个肽肺炎克雷伯菌菌株。

集中表现在μg / mL为每个肽报道在表2。

根据这些结果,分子包含RRWQWR重复的图案表现出抗菌活性的敏感和耐药菌株革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,按照以下顺序: 每个肽对敏感和耐药菌株的麦克风金黄色葡萄球菌和k .肺炎使用一个汤采用微量分析测定。的麦克风值五肽分子研究对感染生物体如表所示2。

麦克风值RRWQWR主题没有抗菌活性金黄色葡萄球菌和k .肺炎(> 197μg / ml - 200μ米)(图2和3;表2)。类似的结果观察LfcinB参考肽(> 398μg / ml - 200μ米),除了金黄色葡萄球菌多重压力,对重要的抗菌活性是证明(≥100μg / mL -≥50岁μ米,表2)。回文肽有更高的麦克风敏感菌株(≥74μg / mL -≥50岁μ米,表2),比耐药菌株(≥9μ25 g / mL -≥6日μ米,表2),更有效的对电阻应变。值得注意的是,二聚的,对抑制四聚物的多肽具有强烈的活动金黄色葡萄球菌和k .肺炎。

为金黄色葡萄球菌二聚的(≥14μg / mL -≥6.25)和四聚物的(≥29μg / mL -≥6.25μ米)肽表现出更强的抗菌活性比敏感菌株(表上的回文2)。相比之下,回文(MIC≥9μg / mL -≥6.25μ米)肽显示活动相比,四聚物的增加(麦克风≥57μg / mL -≥12.5μ米)和二聚肽(MIC≥55μg / mL -≥25μ米),对耐药菌株。有趣的是,回文肽显示不同的MBC获得敏感(≥148μg / mL -≥100μ米)和耐药(≥74μg / mL -≥50岁μ米)菌株,要求高剂量产生同样的效果,而支链分子二聚的(≥110μg / mL -≥50岁μ米)和四聚物的(≥57μg / mL -≥12.5μ米)诱导敏感和耐药菌株的抗菌效应更大(表2)。

为k .肺炎回文(≥74μg / mL -≥50岁μM)和二聚的(≥27μ5 g / mL -≥12日μM)肽没有表现出任何差异在麦克风敏感和耐药菌株,而四聚物的诱导更高的抗菌肽对敏感(≥29的影响μ25 g / mL -≥6日μ电阻应变(≥57米)μ5 g / mL -≥12日μ米)。

MBC值为每个肽被描述为一个函数的MBC四聚物的肽,因为这个分子表现出最大的抗菌活性菌株进行这项研究。

为金黄色葡萄球菌,四聚物的MBC≥57μ克/毫升(≥12.5μ米)。因此,集中表达的功效剖面单元(μg / mL)对这种生物是四聚物(1 x MBC) >二聚体(1.9 x MBC)≥回文(2.6 x MBC和1.3 x MBC的敏感和耐药菌株,分别)具有类似对敏感和耐药菌株的影响,除了复发的分子。

为k .肺炎,四聚物的MBC≥115μ克/毫升(≥25μ米)。因此,集中表达的功效剖面单元(μg / mL)对这种生物是四聚物(1 x MBC)≥二聚体(0.5 x MBC和1.9 x MBC的敏感和耐药菌株,分别)>回文(1.3 x MBC),具有类似对敏感和耐药菌株的影响,除了二聚的分子。

在的情况下k .肺炎、回文、二聚的,四聚物的肽没有表现出显著差异MBCs敏感和耐药菌株的获得和支化分子(二聚的和四聚物的)诱导较强的抗菌效果。

4.4。扫描电镜

检查二聚的,四聚物的肽影响的方式金黄色葡萄球菌和k .肺炎使用扫描电镜观察微生物的形态分析。如图4未经处理的(控制)金黄色葡萄球菌球形,表面光滑和最小粘液和聚合似的集群在敏感和耐药菌株。敏感的金黄色葡萄球菌(图4(一)),治疗后与二聚的肽2 h,组织成短链的细胞形态改变与和皱纹等表面。四聚物的肽治疗相同的应变诱导细胞的数量减少,异构的外表,和细菌表面的改变。四聚物诱导聚合了几个球大小和细菌表面的突起形成。的耐药金黄色葡萄球菌应变(图4 (b))表现出减少细菌的细胞群与治疗。二聚的肽治疗诱导细胞膜表面变化和异常细胞的形状。四聚物的肽导致异常细胞形状和聚合,随着表面变化。与治疗,细胞内容的泄漏可能导致观察到的骨料的创建。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
扫描电子显微镜(SEM)的图像金黄色葡萄球菌治疗后二聚的和四聚物的肽。

未经处理的(控制)敏感菌株k .肺炎就像典型的coccobacilli,封装,表面光滑,人口不同大小和形状(图5)。与二聚的肽治疗2 h后,敏感k .肺炎(图5(一个))展出杆菌等没有太明确定义的胶囊和形态学改变形状和细胞膜破裂,产生细菌与不规则的边缘。四聚物的肽治疗诱导细胞数量的减少,一个异构人口,protusions在细菌表面的形成。典型的四聚物诱导全损杆菌形状和聚合的几个形状和大小的形成。未经治疗的耐药的k .肺炎应变(图5 (b))表现出一个明亮的胶囊,粘液,表面光滑无明显损伤,而二聚的肽治疗诱导细胞膜表面变化如枯萎和降低亮度,以及减少人口规模和细菌。四聚物的肽的影响更大,表面的变化和不同形状的细胞聚集。在这两种治疗,细胞内容的泄漏可能导致观察到的骨料的创建。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
扫描电子显微镜(SEM)的图像肺炎克雷伯菌治疗后二聚的和四聚物的肽。
4.5。溶血性活动

最后,评估的影响肽对正常人体红细胞,其溶血活性(图调查6)。的比例对人类红细胞溶血的活动2小时后决心通过标准microtitre稀释法。报告为肽浓度μM。


图6
合成肽来源于LfcinB溶血性抗菌活性。符号表示的意思是和范围( )。

图6表明,肽的研究达到了HC50(诱导的浓度50%的人类红细胞的溶解)。回文和四聚物的缩氨酸表现出更强的溶血活性最高(分别为24.8%和49.1%)肽浓度测试(100μ米)诱导人类红细胞的透化作用。查看详细结果(图6),RRWQWR主题没有溶血活性,最大值(7.1%)的溶血活动获得了25μM肽。同样,LfcinB参考肽(7 9%)表现出最大的溶血值为12.5μm .有趣的是,二聚肽浓度表现出最低的溶血性概要文件在所有测试。总之,线性和四聚物的图案增加了溶血性活动;然而,二聚的主题表现出较低的溶血活性(< 5%)。因此,溶血性测试活动概要肽是四聚物的>回文>二聚的> LfcinB参考>的主题。

5。讨论

安培是迷人的前景小说由于其广谱抗生素的活动,包括对耐药细菌LfcinB-derived肽是一个很好的例子。先前的工作表明,RRWQWR主题结构的变化如何影响结果的抗菌活性肽(13),以及一些研究表明,支短肽比直系更活跃(14- - - - - -16]。在这项研究中,我们调查了多价的演示如何LfcinB-derived RRWQWR主题影响其抗菌活性对革兰氏阳性和革兰氏阴性代表卫生保健相关感染细菌。

RRWQWR motif-derived肽(线性和支重复)的设计,目的是开发短肽,增加抗菌活性,降低毒性,减少耦合反应所需的步骤,因此合成的成本。主题包含带正电和疏水性芳香族氨基酸(精氨酸和色氨酸),赋予关键两性分子的特性在生理pH值。

阳离子和疏水理化性质一直利用结构特点以提高抗菌肽的功能(17]。关键的肽的理化参数的计算是通过使用在线工具。如表所示1的净电荷从+ 3 + 12肽不同,这是成正比的抗菌活性。先前的研究已经表明,阳离子的安培促进最初的静电吸引和启用与细菌细胞膜表面带负电荷的组件相互作用[18- - - - - -20.]。然而,最近的研究已经证明,电荷和抗菌活性之间的关系是非线性的,超过一定的阈值(通常是+ 6),增加了正电荷并不能提高抗菌活性(21,22]。即使这里的结果表明,增加设计的图案重复肽诱导更高的净电荷,这与抗菌活性较高,有必要考虑更高的抗菌活性和特异性和选择性之间的关系。motif-derived肽的疏水性范围从3.133(主题)−−1.207 (LfcinB参考肽)。因此,增加疏水性和减少的等电点没有改善抗菌活性研究。

抗菌活性与细菌细胞膜的性质,含有负电荷比哺乳动物细胞膜脂质更丰富。出于这个原因,阳离子和两性分子的肽优先结合细菌通过静电吸引,导致细菌对人类细胞的具体目标(23]。尽管LfcinB展示强大的抗菌活性,对革兰氏阳性细菌(24),革兰氏阴性菌(25)和真菌(26,27),包括病原体耐多药,我们的目标是建立由多价的影响主题介绍著名的卫生保健相关感染的病原体,耐药细菌。我们没有考虑循环形式,因为它曾被报道,尽管LfcinB的自然循环结构,环化不需要抗菌活性(9,28,29日]或在体外在一些肿瘤细胞系(细胞毒性的影响9,30.- - - - - -32]。我们的研究结果表明,三个五分子表现出抗菌活性微生物。主题和LfcinB参考肽没有表现出显著的抗菌活性与这些微生物,虽然可以改善其生物活性与线性或扩展主题重复。有趣的是,三个活跃分子(二聚的回文,四聚物的)表现出广泛的活动在革兰氏阳性和革兰氏阴性物种测试,包括耐药微生物要求总是更高的麦克风和MBC值电阻参考株,分别敏感株(图2;表2)。

结果表明回文,二聚的,四聚物的分子表现出抗菌活性,有较强的抗菌活性(定义为分子较低的麦克风和MBC值)与分支主题重复对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物,以及敏感和耐药菌株(数字3和4;表2)。

有趣的是,二聚的和四聚物的分子有一个降低敏感的麦克风金黄色葡萄球菌比敏感k .肺炎。矛盾的是,这些分子的年代。葡萄球菌压力有一个麦克风高于k .肺炎。这些结果说明这些阳离子分子(二聚的和四聚物的)表现出不同的特异性分子资料对革兰氏阳性和革兰氏阴性,以及敏感和耐药菌株(表2)。这里我们有证明二聚的和四聚物的分子表现出更强的抗菌作用金黄色葡萄球菌。

这个概要文件的差异可能是由于不同的细菌革兰氏阳性和革兰氏阴性物种之间的膜组件和脂质成分(33)和不同的应对环境变化(34,35和抗生素暴露36- - - - - -38]。众所周知,不同的菌株可以有独特的膜成分(38- - - - - -44]。

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性和k .肺炎是革兰氏阴性,都是有关卫生保健相关感染的病原体。革兰氏阳性细菌只有一个膜(周围细胞的细胞质膜),而革兰氏阴性菌有两个:细胞质膜和外膜。这或许可以解释为什么k .肺炎需要更高剂量的肽、抗菌效果类似于观察金黄色葡萄球菌。

而革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的肽聚糖层外的细胞质膜,革兰氏阳性菌的肽聚糖层厚得多。也许这就是原因金黄色葡萄球菌菌株表现出较低的麦克风和MBC值(表2)由于厚肽聚糖层使肽更容易到达表面膜和诱导气孔的形成。扫描电镜显微镜(图52 h后)清楚地表明,3 x麦克风,治疗k .肺炎表面膜相比,表现出较少的毛孔和损害金黄色葡萄球菌(图4在相似的条件下),它显示的戏剧性的变化。细菌表面的修改由SEM照片显示相似的变化与其他抗菌阳离子肽诱导金黄色葡萄球菌(45,46),k .肺炎(47参考菌株。结果显示,我们的假设是这支Lfcin B衍生肽作用机理可能附着在细菌表面,引起的孔隙形成干扰细菌的功能膜的另一个阳离子肽是先前描述。我们的重点是作用机理的研究来阐明它。

Peptide-lipid交互是另一个关键因素。阳离子肽与带负电荷的促进微生物细胞膜的磷脂。然而,重要的是要注意,细胞膜脂质含量是不同的。而革兰氏阳性细菌包含lipoteichoic酸(LTA)或teichuronic酸(TA),在革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)形式的主要脂质成分外层膜的外膜。因此,我们的结果可能表明二聚的,四聚物的分子有偏爱分子像英国网球协会和/或助教,对革兰氏阳性胞质膜,建立静电相互作用,诱发强烈的抗菌活性金黄色葡萄球菌菌株。

支多价分子可能有更高的概率达到细菌微生物和与阴离子建立静电相互作用分子的脂质成分,这取决于应变和革兰氏细菌的分类。一旦二聚体和四聚物分子达到微生物,建立了静电相互作用,从而导致微生物细胞溶解和死亡,也许后续膜透化作用。

新设计的分子的安全是为未来的临床应用需要考虑的一个重要方面。虽然四聚物的和二聚的演示都证明抗菌活性高、广谱的活动,和较低的生产成本,他们的溶血性活动结果表明,最无害的和特定的抗菌分子二聚体,在浓度≤100μ米,而四聚物治疗有限使用低浓度的12个,5μm .肽的没有达到HC50,他们与100年展览(四聚物的49.3%μ米)和显示有趣的抗菌活性。我们未来的工作将包括使用的抗菌作用机制的详细研究这些二聚的,四聚物的多肽及其特异性概要文件的安全。

6。结论

RRWQWR主题重复在线性和支链构象导致有利影响对革兰氏阳性和革兰氏阴性写明ATCC抗菌活性菌株在本研究评估。分子与分支结构是最有前途的即使在抵抗参考菌株。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

确认

作者希望承认Departamento Administrativo de Ciencia y Tecnologia COLCIENCIAS (fp44842 - 154 - 2015),对其金融支持下Convocatoria 656 - 2014“Es Tiempo de回归”。他们也表达他们的感谢制药部门的好客所de哥伦比亚波哥大。此外,他们想表达他们的感谢克劳迪娅l .阿根廷b扫描电镜实验室的哥伦比亚大学Nacional de SEM显微技术的建议。