文摘

目的。本研究旨在探讨是否骨髓(BM)中内皮祖细胞(epc)对野百合碱(MCT)诱导肺动脉高血压(PAH)在大鼠通过调制门店 渠道(SOC)。方法。雄性SD (SD)中老鼠分为MCT组(n = 30)和对照组(n = 20)。MCT组大鼠皮下注射了60毫克/公斤特定解决方案,和老鼠在对照组注射等量的车辆。经过3周的治疗,右心室收缩压(RVSP)和右心室肥大指数(RVHI)的两组测量,和BM-derived内皮祖细胞被孤立。免疫化学识别和血管生成检测内皮祖细胞被执行。 测量检测执行门店钙条目(跌倒)两组,其次是确定Orai和规范瞬时受体电位(TRPC)通道的表达。结果。经过3周的治疗,有显著的RVSP和RVHI MCT组与对照组相比,表明MCT成功诱导多环芳烃的老鼠。此外,跌倒( 上升)BM-derived epc的MCT组低于对照组。此外,Orai3的表达水平,TRPC1、TRPC3, TRPC6在BM-derived内皮祖细胞在MCT组与对照组相比降低了。结论。SOC活动被抑制在BM-derived MCT-treated大鼠内皮祖细胞。这些结果可能与抑郁相关的表达Orai3, TRPC1、TRPC3,和TRPC6 SOC的主要介质。

1。介绍

肺动脉高压(PAH)是一种致命的疾病,其特征是肺血管阻力的增加(1,2]。它总是会导致右心室(RV)衰竭和死亡3,4]。尽管先进的治疗选择,这种病是不治之症由于进步临床恶化和早期死亡率高得令人无法接受的5,6]。因此,说明关键病理机制的多环芳烃开发仍然是必要的。

积累的证据已经证实过度肺血管重建负责PAH的肺血管阻力升高(7- - - - - -9]。在肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),胞质免费的上升 浓度( )被确定为一个关键诱因推动PASMCs扩散和肺血管收缩,都导致肺血管重建(10- - - - - -13]。此外,深刻的肺血管重建和改变 体内平衡在PASMCs可能导致PAH的发展14]。这些发现支持的致病作用 信号在多环芳烃。

内皮祖细胞(epc)被认为是重要的在维持血管内稳态,可动员骨髓(BM)和本地居民在肺15]。内皮祖细胞被发现一个关键的角色在内皮修复(16,17]。据报道,BM-derived内皮祖细胞可修复受损的野百合碱(MCT)在大鼠肺特定模型的多环芳烃(18]。此外,内皮祖细胞可以诱导新生血管形成,表明承诺内皮祖细胞细胞疗法的临床应用多环芳烃(19]。然而,内皮祖细胞的可能机制调节肺血管重建过程中多环芳烃的发展在很大程度上是未知的。

值得注意的是,门店 通道(SOC)表达在人类内皮祖细胞(20.]。的致病作用 信号在多环芳烃,本研究调查是否BM-derived内皮祖细胞导致通过调制SOC MCT鼠模型中的多环芳烃。研究,我们建立了MCT鼠模型被广泛用于研究多环芳烃在啮齿动物20.- - - - - -22]。然后BM-derived内皮祖细胞被孤立。 测量检测执行门店钙条目(跌倒)BM-derived epc MCT鼠模型和控制,其次是确定SOC监管机构、Orai,规范瞬时受体电位通道(TRPC)表达式。我们的研究结果将提供一个更好的理解多环芳烃发病机制的新观点。

2。材料和方法

2.1。动物和治疗

共有50名男性的雄性SD (SD)大鼠中(重150 - 180克)从北京获得至关重要的河实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)。老鼠被分为MCT组(n = 30)和对照组(n = 20)。MCT组大鼠皮下注射了60毫克/公斤MCT 25毫克/毫升溶液稀释车辆(1:4混合脱水ethanol-normal盐水)。老鼠在对照组注射等量的车辆。本研究机构伦理委员会批准的动物保健和使用。在治疗期间,和一般状况观察日常的行为。

2.2。测量肺血流动力学和右心室肥大

3周的治疗后,大鼠与35毫克/公斤戊巴比妥钠腹腔麻醉(雅培,蒙特利尔,加拿大)。右心室收缩压(RVSP)每组大鼠被插入一个米勒测量导管(美国米勒,Inc ., TX)到房车。此外,RV分开左心室(LV)和隔膜(S)为进一步检测右心室肥大。右心肥大指数(RVHI) [RV / (LV + S)]被计算为房车体重比(LV + S)的重量。

2.3。隔离大鼠BM-Derived内皮祖细胞

每组大鼠被放血,牺牲和BM然后吸气双边股骨和胫骨的老鼠无菌。用密度梯度离心法Histopaque®-1083解决方案(美国女士Sigma-Aldrich)、单核细胞(跨国公司)隔绝BM。产生内皮祖细胞,BM-isolated跨国公司然后resuspended EGM-2 MV中(Lonza,医学博士,美国),播种成纤连蛋白(5μ克/厘米2)涂布six-well板的密度3×106/厘米2并保持在37°C孵化器为8天。EGM-2 MV中是每两天更换一次。

2.4。免疫化学鉴定

经过8天的孵化,fibronectin-adherent内皮祖细胞与10被孵化μ克/毫升的荧光标记acetylated-low-density脂蛋白(Dil-ac-LDL;分子探针,尤金,一夜之间,或者美国)和10μ克/毫升的荧光FITC-labeledUlex europaeus凝集素1 (UEA-1;美国女士Sigma-Aldrich)为4 h在室温下使用一种免疫化学方法(4,23]。这些照片是被Leica-SP5共焦显微镜(德国徕卡),FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL阳性细胞被认为是内皮祖细胞。

2.5。检测血管生成

模仿内皮祖细胞的血管生成,血管网络的形成。短暂,24-well盘子presolidified基底膜基质(美国BD生物科学,MA) 30分钟。内皮祖细胞被播种到24-well包含500个盘子μl EGM-2-MV介质的密度7.5×104细胞/ 2厘米2基底膜基质。孵化5 h后,在10个领域发展中血管网络在显微镜下观察(尼康、日本)。血管网络计算每个字段的长度。

2.6。(Ca2 +]cyt测量

根据前面描述的协议(24,25), ,定义为340 - 380纳米波长的荧光强度比(F340 / F380),监控使用fura-2 acetoxymethyl酯(Invitrogen-Molecular探针,尤金或)然后成像与NIS元素3.2软件(尼康)。

确定不同的振幅 增加特定轴与对照组之间由于跌倒,10μM CPA细胞外地应用,这是一个石棺/内质网 腺苷三磷酸酶抑制剂,诱发 涌入。的 上升(ΔRatio) MCT和对照组被检测到。

2.7。实时聚合酶链反应

从内皮祖细胞总RNA提取MCT和对照组使用试剂盒®试剂(表达载体,伯灵顿,加拿大)。总RNA被决定的质量和浓度的分光光度计(美国热科学NanoDrop 2000)。反转录成cDNA进行混合使用PrimeScriptTM RT主装备(豆类、日本)。Orai的表达水平和TRPC通道被检测到实时PCR应用生物系统公司实时PCR系统7500快(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。引物(正向和反向,5 ' - 3 ')扩增的基因如下:Orai 1: AAGTTCTTACCGCTCAAGAGGCAG AGCGGTAGAAGTGAACGGCAAAGA;Orai 2: TGTGGGTCTCATCTTCGTGGTCTT TGAGCTTGTGCAGTTCCTCGATCT;Orai 3: TAGTGCCTGCACCACTGTGTTAGT ATTGTGGATGTTGCTCACGGCTTC;TRPC7: AGACACGGAAGAGGTGGAAGCAAT AGTTAGGGTGGGCAACGAACTTCT;TRPC6: TCTGGCTGCTCATTGCCAGGAATA AGAGTGGCTGAAGGAGTCATGCTT;TRPC5: AGTTCACACCAGACATCACACCCA TGAACTGGACACACACTCCACACA; TRPC4: AGTTTATCTGCCACACAGCCTCCT and AGTCCGCCATCCCACATCTGTTTA; TRPC3: TCTTCCTGGGTCTGCTTGTGTTCA and TGTCCATGTGAACTGGGTGGTCTT; TRPC2: TCCTGTGAAGATCAGCCATGTGGT and TGTCTGGGTTCAGCAAGTTCTCCA; and TRPC1: ACAGAAGATGCAGAGCACAGACCA and AAGTCCGAAAGCCAAGCAAATCCC. Each sample was analyzed in triplicate. Cycling parameters were set as follows: 50°C for 2 min and 95°C for 10 min, followed by 40 cycles of 95°C for 15 s, 60°C for 30 s, and 72°C for 30 s.

2.8。统计分析

所有独立实验重复三次。所有测量数据都表现为平均值±标准偏差(SD)和分析使用一个未配对的学生的显著差异 以及棱镜5软件(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。P < 0.05的值表示一个具有统计学意义的结果。

3所示。结果

3.1。动物的一般状态

在动物实验中,2和3 MCT组老鼠死在MCT注入第三和第四个周后,分别。因此,45老鼠参加本研究。MCT组治疗3周后,大鼠出现明显asarcia,呼吸困难、胸部和腹水的形成,与肝脏充血和肿胀,心脏扩大,右心室肥大和其他心脏衰竭表现。大鼠对照组并没有表现出任何异常。

3.2。MCT-Induced PAH的老鼠

MCT被用来诱导多环芳烃在老鼠在这项研究。结果表明,大鼠在MCT组发达PAH MCT治疗3周后所反映的显著增加RVSP: 59.40±8.13 mmHg MCT老鼠和27.45±0.89毫米汞柱控制大鼠(P < 0.05,图1(一))。此外,RVHI MCT组(41.69±2.00%)显著增加的价格相比对照组(31.00±1.00%)(P < 0.01,图1 (b))。这些数据表明,MCT成功诱导多环芳烃的老鼠。

(一)
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(b)
(b)
图1
野百合碱(MCT)诱导肺动脉高血压(PAH)在大鼠4周的特定治疗。(一)RVSP每组的老鼠。每组(b)的RVHI老鼠。RVSP:右心室收缩压;RVHI:右心室肥大指数。 P < 0.05, 与对照组相比P < 0.01。
3.3。BM-Derived鉴定内皮祖细胞

内皮祖细胞的形态学变化,观察后文化1,4,6,8天在选择性培养基。经过1天的文化,细胞粘在墙上,但是他们的形态不是统一的,这些细胞被轮(图2(一个));有些细胞多边形或纺锤形(图4天之后2 (b));大多数的细胞多边形或纺锤形(图6天之后2 (c));纺锤形或多边形细胞显示主导增长8天后,铺平石头的安排和透明细胞间隙(图2 (d))。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
的形态变化骨髓(BM)派生的内皮祖细胞(epc)在文化1 (a), 4 (b), 6 (c), 8 (d)天在选择性培养基。

此外,免疫化学识别后进行文化选择性培养基的8天。双沾FITC-UEA-1 Dil-ac-LDL,内皮祖细胞附着的跨国公司被确定(图3(一个))。此外,结果表明,84.40±8.06%的附着跨国公司被认定为double-positive内皮祖细胞,证实高纯度BM-derived内皮祖细胞被成功分离。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
BM-derived内皮祖细胞识别和免疫化学(a),以及血管网络形成测试(b)。
3.4。功能分析的BM-Derived检测内皮祖细胞的血管生成

进一步确认的功能BM-derived内皮祖细胞,vasculogenic内皮祖细胞是血管检测到的网络形成的潜在的测试。内皮祖细胞被播种到基底膜基质为孵化5 h。结果表明,每视野血管网络的平均长度是9.78±0.67毫米(图3 (b))。

3.5。MCT CPA-Induced减少跌倒在BM-Derived内皮祖细胞

确定特定轴可以调节SOC BM-derived内皮祖细胞,10μM CPA细胞外地应用在跌倒检测特定的影响。如图4, 上升(ΔRatio)的MCT组(0.60±0.21)显著低于对照组(0.91±0.23)(P < 0.01),表明其特定CPA-induced减少跌倒。


图4
的 未经中华人民共和国交通部和控制集团的崛起(跌倒)。 与对照组相比P < 0.01。
3.6。其特定的影响Orai和TRPC通道的表达

进一步探讨MCT在SOC的调控机制,我们发现Orai TRPC通道表达式,包括Orai1-3和TRPC1-7。与对照组相比,Orai3的表达水平,TRPC1、TRPC3, TRPC6在BM-derived内皮祖细胞在MCT组显著下调(P < 0.05,图5),这表明MCT减少跌倒可能通过减少这些通道分子的表达。


图5
的表达Orai TRPC通道,包括Orai1 Orai2, Orai3, TRPC1、TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6、和TRPC7 MCT和对照组。 与对照组相比P < 0.05。

4所示。讨论

多环芳烃是一种退化和毁灭性的疾病治疗方案(有限26]。说明多环芳烃的关键机制将促进这种疾病有效的治疗策略的发展。在这项研究中,多环芳烃的MCT鼠模型成功建立,反映在RVSP和RVHI显著增加。此外,跌倒的令人愉快的结果( )增加BM-derived epc的MCT显著抑制大鼠模型。此外,Orai3的表达水平,TRPC1、TRPC3, TRPC6明显减少BM-derived MCT鼠模型的内皮祖细胞。这些数据暗示BM-derived内皮祖细胞可能参与了大鼠的MCT-induced PAH通过抑制跌倒和相关频道的表情。

细胞内的 为细胞增殖信号,作为一种重要的第二信使,发现大量的生理和病理生理过程中发挥重要作用在PASMCs,增生和肥大(27]。跌倒是无处不在的 入口通路参与各种生理功能的控制在不同的细胞类型(28]。当细胞内 商店都耗尽,SOC可以调解 流入,增加 (29日]。此外,TRPC-dependent SOC是确认为一个重要的途径调解MCT-induced PAH的发展(14]。林等人透露,增强跌倒负责慢性低氧诱导肺动脉高压大鼠(30.]。周等人证明了SOC调节内皮研究进展在严重的多环芳烃31日]。这些数据证实在PASMCs SOC PAH的病理作用的发展。然而,SOC可能扮演双重角色在不同的细胞类型。先前的研究表明,跌倒是一个重要因素在调节内皮祖细胞的功能和跌倒抑制减少内皮祖细胞的增殖和迁移在动脉粥样硬化(32]。王等人表示,SOC抑制可以防止H2O2全身的细胞凋亡,从而发挥对内皮祖细胞的保护作用[33]。Lodola等人证明了SOC改建和随后监管的体外血管生成在epc隔绝tumoral患者(34]。在我们的研究中,抑制了SOC MCT在BM-derived MCT-treated大鼠内皮祖细胞。鉴于epc SOC的关键作用,我们推测,BM-derived内皮祖细胞可能防止MCT-induced PAH SOC的老鼠可能通过激活。

此外,Orai和TRPC提出了蛋白质形成SOC (35]。越来越多的证据表明Orai的重要作用和在PAH TRPC通道。Orai1、Orai12 Orai3可以促进PASMCs跌倒,可以作为潜在的治疗目标为慢性低氧诱导肺动脉高压(36]。Dragoni等人建议Orai3是主要在myelofibrosis-endothelial集落形成细胞(ECFCs) EPC子集,从而导致upregulation跌倒的37]。在这项研究中,Orai3表达显著减少BM-derived MCT鼠模型的内皮祖细胞。考虑到关键作用SOC在PAH,我们推测,抑制跌倒Orai3的差别,由于对这些BM-derived内皮祖细胞可能在MCT-induced PAH发挥关键作用。此外,TRPC1跌倒的主要成分和超表达TRPC1能促进SOCE-induced在大鼠肺动脉血管收缩38]。TRPC1缺乏发现影响内皮祖细胞在调节血管生成的功能39]。此外,TRPC3通道被发现参与高血压的发展及其相关并发症(40]。Poteser等人表示,TRPC3可以调节 信号在体细胞内皮祖细胞(41]。TRPC3-mediated 信号在ECFCs发达是一个有前途的战略对提高治疗性血管生成在失败的心42]。此外,TRPC6显示关键参与肺血管的疾病43]。玉等人发现,一个独特的基因变异TRPC6基因的启动子可能导致在特发性肺动脉高压肺血管异常连接异常TRPC6核转录因子-κB活动(44]。此外,功能之间的交互TRPC1 TRPC6可以调解 在内皮细胞,促进肺血管通透性(45]。封锁TRPC3和TRPC6可能是一种有前途的治疗策略,多环芳烃处理(46]。在这项研究中,门店的表达TRPC1、TRPC3,和TRPC6频道是减少BM-derived epc MCT鼠模型,表明BM-derived内皮祖细胞可能参与MCT-induced PAH通过减少这些通道分子的表达。

总之,SOC活动被抑制在BM-derived MCT-treated大鼠内皮祖细胞。这些结果可能与Orai3的抑郁表现,TRPC1、TRPC3,和TRPC6 SOC的主要介质。我们的发现可能的潜在临床应用提供生理依据PAH的内皮祖细胞细胞疗法。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

附加分

突出了。(1)成功MCT-induced PAH的老鼠。(2)跌倒是减少了MCT BM-derived MCT-treated大鼠内皮祖细胞。(3)表达式Orai3 TRPC1、3和6,减少在MCT大鼠内皮祖细胞。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

跑苗,小君Wan的贡献同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81270117,81270117),北京自然科学基金(7162069),该基金中国国家重点研发项目(2016 yfc0905600)。