文摘
赞成和抗氧化剂的作用减少直肠癌发病率(RC)手术,术前,术后治疗仍有讨论余地的,有争议的。氧化还原状态的静脉血管的血液和组织60 RC患者(米0G2)和20个捐助者通过研究传统和spin-trapping电子顺磁共振(EPR)。信号的强度血浆铜蓝蛋白(CP),转铁蛋白(TF),和不稳定的铁池(唇)温度T = 77 K以及过氧化物产生率和一氧化氮(NO)水平在T = 300 K是测量。降低CP和TF活性和降低水平没有增加唇和superoxide-generating利率水平是血液中检测到的物种。相关分析的五年存活率作为提取的值的函数。结果表明,相应的电子顺磁共振信号强度的“本地”和“被困”顺磁中心可能用于RC发展背后的分子机制的理解和治疗。
1。介绍
生物电子转移(ET)运行的能量过程是至关重要的细胞。等负责的生长和凋亡细胞,因此,可以在进步发挥重要作用的病理过程。这种转移是由链蛋白结合的氧化还原(reduction-oxidation)单位。氧化还原的基本单位的血液血浆铜蓝蛋白(CP),转铁蛋白(TF),“自由”铁(也称为不稳定铁池、唇),NADPH氧化酶,伊诺的中性粒细胞和血小板(1]。提到的活动单位可以调查电子顺磁共振(EPR),也为电子自旋共振的ESR)技术。使用的EPR技术的基础研究人类和动物的器官和组织建立了规范和病理学和发达国家在1960 - 80年代2- - - - - -10]。看来这个领域正在经历第二次出生在最近几年,包括大量应用在癌症相关研究(11- - - - - -21]。
EPR利用率在肿瘤相关的各个方面与相应的引用和解释实验研究/技术细节给出了我们的出版物(11,13在[]和另外的血液调查22]。从最后一个可能错误地得出结论,EPR“本地”(内在)顺磁中心不是一个敏感的工具调查血的病理条件下的氧化还原状态。从另一边23]EPR 16-doxyl硬脂酸作为自旋探针测量血液样本蛋白构象变化显然证明了其在癌症患者诊断工具包括结直肠癌(CRC)包括直肠癌(RC)和结肠癌24]。电子顺磁共振信号的强度变化相对应的全血CP和TF的乳腺癌患者放疗的影响下在(图25]。
在人体组织包括顺磁中心主要包含铁铁的分子复合物3 +(主要是转铁蛋白和血红蛋白提供)、铜铜2 +离子(血浆铜蓝蛋白),“自由”的激进分子。人类血浆铜蓝蛋白是一种糖蛋白中血浆(约300μ健康的成年人们g / ml)的分子量132 kDa。CP EPR谱的组织通常是检测信号从铜2 +离子谱线的g = 2.05。血浆铜蓝蛋白与铁代谢铁的催化氧化2 +从而促进铁的结合3 +apotransferrin。CP氧化四个铁2 +离子和参与four-electron转移到氧气,从而阻碍非酶的氧化的铁生产“免费”激进分子(26]。Apotransferrin EPR-silent,但当它铁3 +离子可以观察到一个不同的电子顺磁共振信号与g4.3从顺磁铁3 +离子由于高自旋(电子自旋年代= 5/2)铁在TF。
(3 - 4)克铁分布在身体的隔间。在正常受试者都是蛋白质绑定。大约70%的总铁循环,主要在红细胞血红蛋白。多达25%的铁是存储在细胞胞质haemosiderin铁蛋白或溶酶体。只有0.1%的全身铁循环在等离子体中,所有绑定到TF。“免费”铁是有毒的血液和组织(26]。在许多病理过程,包括肿瘤生长、血液和组织中的“自由”铁增加由于decompartmentalization铁蛋白的铁离子和破坏其他血红素和nonheme蛋白质。EPR谱的“免费”铁(不稳定铁池、唇)检测到附近的一个广泛的信号g = (2.2 - 2.4)9,14,15]。
与正常对照组比较,肿瘤细胞产生更多的“自由”的激进分子。当“免费”自由基产生的过度和不可控的,他们和他们的衍生产品可能与多种细胞大分子反应,如脂质、蛋白质和DNA和可以调节基因表达(27,28]。氧化还原状态,等干扰与活性氧(ROS)的合成和降解的基质蛋白,进而影响细胞生存,入侵和转移(29日]。基质金属蛋白酶(MMPs)能分解细胞外基质蛋白,增强癌细胞的入侵。一般来说,假设MMP的合成和/或激活是增加了氧化应激等由激活中性粒细胞和ROS,例如[29日,30.]。
最近的数据显示,更重要的是中性粒细胞和血小板在肿瘤生物学和重要的角色。Neutrophil-to-lymphocyte和platelet-to-lymphocyte比率已经被提议作为独立的癌症患者的不良预后的标志,包括CRC (31日]。中性粒细胞的作用是有争议的。现在假设有两个中性粒细胞表型,所谓的抗肿瘤N1中性粒细胞和protumorigenic N2中性粒细胞。N1中性粒细胞显示直接抗肿瘤效应引起的活性氧产量。以及依赖抗体的细胞毒性与此同时,N2中性粒细胞被认为通过细胞外基质重建促进癌症的发展,加速血管生成和lymphangiogenesis,通过protumorigenic细胞因子和免疫调制生产(32,33]。
在这项研究中,我们报告的氧化还原状态的测量静脉血(也提取的中性粒细胞和血小板)的直肠癌患者包括EPR的顺磁中心在液氮温度T = 77 K和spin-trapping EPR的反应性氧/氮物种(ROS / RNS)过氧化物()和一氧化氮(NO)在室温下自由基(RT)展示RC在血液和氧化还原状态的特性来演示EPR RC研究能力。获得的结果与从肿瘤的血管和上级直肠动脉。延续了我们许多在上雕琢平面的作品与一些初步结果呈现在34,35]。
2。材料和方法
静脉血60病人呆在乌克兰国家癌症研究所治疗(34男性和26名女性,平均年龄61±2.3年)阶段II / III (米0G2据美国癌症联合委员会第七版的分类(36),其中T因素是原发肿瘤的墙渗透的程度;N因素是淋巴结转移的状态;M因素显示存在远处转移;和G级的描述直肠癌症)的腺癌进行了研究。疾病的诊断,阶段,存在转移建立了根据循证医学的要求(在相应的形态,clinical-instrumental检查)。调查小组内没有其他疾病的诊断。所有参与者表达了他们事先书面同意参加研究。随后的过程都是按照道德标准的负责任的人体试验委员会(机构和国家)和1964年的赫尔辛基宣言和后来的修正案。20国集团(g20)的结果几乎健康人(9人,11岁女性56±4.1年)作为控制的价值观。
0.5毫升的6毫升静脉血样本收集肘静脉注入试管0.1毫升的抗凝血氨羧络合剂B溶液(3%),然后冻结,并存储在一个特殊的模具在液氮CP的估计,TF,“免费”铁水平由EPR在T = 77 K。其他(5.5毫升)被用于没有水平和产生率的测定全血中自由基、中性粒细胞和血小板在RT用Fe /二乙基二硫代氨基甲酸(Fe / DETC)和1-hydroxy-2, 2, 6日6-tetramethyl-4-oxo-piperidine盐酸盐(TEMPONE-H)从Sigma-Aldrich旋转陷阱。中性粒细胞被隔离在一个双密度(ρ= 1.077克/厘米3和ρ= 1.119克/厘米3)Ficoll-Verographin + 4°C的梯度离心法在45分钟(400克37]。血小板提取一系列血离心后+ 4°C根据程序中描述(38]。EPR测量是通过使用re - 1307(苏联、俄罗斯)和力量esp - 300(力量、德国)电子顺磁共振光谱仪(9.5 GHz的光谱仪操作在微波频率)在室温和液氮温度(T = 77 k)。EPR测量的技术细节和样品准备与自旋陷阱(其他地方11,13,15]。
此外,跟随血液循环系统的变化与腺癌,样本的直肠上动脉和血管的肿瘤组织21个RC患者(12人,9女性)和9消化性溃疡患者(5男4女,平均年龄为59.1±2.8年)期间获得手术干扰被冻结,存储在一个特殊的模具在液态氮,调查。
统计分析是使用起源GraphPad棱镜6和7.5程序。不同的参数被认为是可靠的,p < 0.05。
3所示。结果与讨论
图1显示了典型的EPR谱捐助机构和患者的血液样本在液氮温度下RC。排除共振频率的影响到EPR谱的转变,是很常见的重新计算和现在的光谱光谱的单位g -因素而不是磁场强度后,简单的关系 h是普朗克常数,是一个微波EPR的频率,是波尔常数,和B是一个磁场强度。
有行与g = 2.05, 4.25 g =光谱在图1和图21;他们的强度对应于CP活动和TF内容,相应。另外,由于信号高铁血红蛋白(g = 6.3)和“免费”铁(嘴唇,g = 2.2 - 2.4)可被检测到。
CP的EPR强度的结果比较,TF,唇对捐赠者和RC病人在图所示2。由此可见,CP和TF水平RC病人的血少2和3倍比捐助者、分别,而增长10倍的唇水平(p < 0.05)。
kaplan meier分析以确定和比较5年生存与CP, TF,嘴唇活动(图/水平3)。患者的5年总生存期(OS) CP的活动 0.42 a.u。(n = 34)为60%,中位生存(SM)没有达到。该集团的< 0.42 a.u。操作系统(n = 26) = 28%,平均时间是23个月(χ2= 4.08,p = 0.044,图3(一个))。为 0.22 (n = 29),还没有达到SM, OS = 60%。为(n = 31 p < 0.22),平均时间是27个月(χ2= 3.16,p = 0.076,图3 (b))。子群的< 0.23 a.u。操作系统(n = 33) = 58%, SM是没有达到;与 0.23操作系统(n = 27) = 30%,平均时间是17个月(χ2= 4.96,p = 0.026,图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
数据生成的过氧化物自由基和NADPH氧化酶的激进派伊诺的血液中性粒细胞和血小板聚集在桌子上1。从这些可以看出血小板的产生率是控制8 - 14倍的物种(р< 0.001)。
根据超氧化物产生率数据,患者可以分成3组不同的5年存活率(图4(一)):与高活动(> 3.20海里/ 105细胞·敏,n = 11,意味着= 3.45±0.11);(2)中度活动(范围2.50 - 3.20,n = 18日意味着= 2.75±0.03,p < 0.05);(3)活动较低(< 2.5,n = 21,意味着= 2.35±0.05,р< 0.05)。五年OS组1为39%,SM = 22个月;对于子组2和3,SM是没有达到和操作系统值的56%和62%,相应的(χ2= 0.88,p = 0.35)。
(一)
(b)
RC病人没有显著降低水平的生产(3次,р< 0.01)。的患者这个值< 0.41 nM / 105细胞·敏,OS = 31%, SM = 23个月时间的值> 0.41 nM / 105细胞·敏OS = 66%, SM没有达到(χ2р= 0.078 = 3.11)。
关于没有血小板的产生率,高的小组活动伊诺(> 0.34海里/ 105细胞·min) OS = 64%, SM是没有达到,伊诺的小组活动较低(≤0.34 nM / 105细胞·min) SM = 29个月(p = 0.4,图4 (b))。
中性粒细胞过氧化物的生成率的数据允许将五年生存结果分成两组:一个从60名患者(30%)相同的值作为控制一个,其余(2)1.5 - 2倍(р< 0.01)更高的值。在对应的双重角色,中性粒细胞在肿瘤进展(见引言部分,31日- - - - - -33])。为统计分析我们调查小组分成两个子组:与产生率> 0.31 nM / 105细胞·敏(n = 28)的操作系统= 40%,SM = 39个月观察;和(2)产生率< 0.31 nM / 105细胞·敏(n = 32)操作系统= 78%和SM是没有达到(χ2р= 0.043 = 4.1,数据没有图形)。一氧化氮的担忧,没有显著相关性中性粒细胞的没有发现水平和生存五年(χ2р= 0.13 = 2.3)。
氧化还原状态的重要改变血液中观察到的物种表明相应的变化也可以获得在肿瘤组织和血管的肿瘤组织。EPR谱从肿瘤的血管和血管附近的RC病人的组织图所示5。EPR对RC组织的主要特征是一个信号与g = 2.03。这个信号的强度对应的水平NO-FeS蛋白复合物形成的互动中没有•FeS-proteins线粒体呼吸链的膜,特别是蛋白质的N和S集群在NADPH-ubiquinone还原酶和琥珀酸脱氢酶,分别为(13]。血管的肿瘤,高水平的a.u NO-FeS-protein复合物(1.8±0.11。m = 26)相比,发现直肠上动脉(0.58±0.05 a.u . .26例)和对照组(动脉组织的消化性溃疡患者,0.15±0.02 a.u。,n = 9)(其他信号的本质呈现在图5详细描述(13])。
我们已经测量了一氧化氮浓度的船只spin-trapping技术。获得的数据在数据6和7。如下,与血液的物种,没有RC病人的动脉中水平高于消化性溃疡患者的组织(p < 0.01,图6)。没有浓度之间的相关性spin-trapping EPR和电子顺磁共振信号强度与g = 2.03肿瘤组织的血管变得明显从图7(r = 0.84, p < 0.05)。这表明内在电子顺磁共振信号的强度在g = 2.03能够(至少在某些情况下)作为衡量再多没有应用的自旋陷阱虽然EPR本身可以被当作病理变化的一个指标。没有可靠的相关性水平调查组织和存活率。
可以看到,没有生产在RC组织高和通信与我们以前的观测对其他肿瘤类型(11- - - - - -13]。现在让我们讨论可能的机制导致的水平不降低,超氧化物生产过剩RC病人的血液中物种(铜和铁的可行的方法改变相关的电子顺磁共振信号广泛在引言部分回顾了)。主要生成一氧化氮生成的源是诱导一氧化氮合酶(间接宾语)。号酶是复杂oxido-reductases可能产生ROS以及,或代替,没有。具体来说,没有生产,NOS酶需要代数余子式四氢生物蝶呤(BH4)。BH4参与电子转移在两步氧化L-citrulline通过精氨酸N -hydroxyarginine中间。没有BH4, NOS酶无法生成没有氧化精氨酸和成为“分开”,即减少氧气分子,由电子流的NOS还原酶域,可以生成过氧化物或其他活性氧(39- - - - - -42]。
4所示。结论
腺癌的RC患者(Т2-4N0-2M0G2)的增长伴随着血液氧化还原状态的变化。即CP活动和TF水平降低,导致出现“免费”的铁和增长水平。结果显示使用内在的EPR的可行性顺磁中心的相对简单的调查血液氧化还原状态。redox-forming状态部分血液与五年生存率。
同时,由于辅酶ii·N-oxidase的变更和伊诺超氧化物-没有生殖活动的中性粒细胞和血小板,一氧化氮生成活动减少,而过氧化物产生率增长。虽然超氧化物产生率之间的关系,发现五年存活率,没有可靠的相关性水平调查血液物种,建立动脉组织和生存。再次强调,没有水平和生物反应之间的联系应该进一步广泛研究[40]。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
信息披露
完成这项工作的一部分的框架合作协议之间的右眼Kavetsky研究所和喀山联邦大学和支持的项目竞争力增长的喀山联邦大学(5 - 100)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者感谢支持教授瓦西里是核电站Chekhun(基辅)和博士谢尔盖·尼基丁(喀山)为本协议的化身和谢尔盖Orlinskii博士和格奥尔基Mamin(喀山)有用的讨论和健康的批评。