文摘
感染土拉杆菌内人类疾病的病原体兔热病,导致炎性细胞因子的生产过剩,称为细胞因子风暴。过度肥胖代谢副产物积累在肥胖个体和激活的炎症信号通路f .土拉杆菌内感染。此外,还中瘦素水平升高的肥胖者增加炎症。瘦素是由脂肪细胞产生以来,我们假设增加肥胖女性的脂肪可能会让他们更容易f .土拉杆菌内感染较瘦的人。精益和肥胖的雌性老鼠感染了f .土拉杆菌内免疫病理和易感性监控。血浆和组织细胞因子被多路复用ELISA和实时rt - pcr分析,分别。肥胖老鼠感染更敏感,开发一种更强烈的细胞激素风暴,增加肥胖老鼠的死亡而瘦老鼠。这种增强与炎症反应相关在体外bacteria-infected巨噬细胞文化之外的瘦素导致炎性细胞因子的增加产量。我们认为增加基底肥胖者瘦素表达导致持久的低级炎症反应使他们更容易f .土拉杆菌内感染和提高免疫病理过程的生成细胞因子风暴。
1。介绍
感染人畜共患病原菌土拉杆菌内、人类的病原体兔热病,抒发的炎性细胞因子的生产过剩,最终细胞因子风暴。巨噬细胞吸收后的细菌,f .土拉杆菌内会释放到胞质,启动炎症(1,2]。在致命的感染,过度的促炎细胞因子水平,如干扰素-γ肿瘤坏死因子-α和il - 6,观察血浆表明系统性sepsis-like响应(3,4]。这导致过度免疫病理,包括放松内皮细胞紧密连接、水肿、血容量减少、发热、和心动过缓。而低水平的炎症激活免疫反应所必需的和明确的病原体感染,包括f .土拉杆菌内,过度的炎症引起这种致命的免疫病理反应。
过量摄入热量而导致脂肪细胞的肿胀,局部脂肪组织的激活白细胞(5- - - - - -9]。这激活导致生产促炎细胞因子和发病增加巨噬细胞和T细胞,以控制和去除多余脂肪和fat-swollen细胞(10,11]。激活脂肪组织巨噬细胞il - 1的结果β炎性细胞因子的分泌,进而触发生产和发病12- - - - - -17]。持续压力对脂肪细胞肥厚性导致发病炎症和抗炎细胞因子的连续生产18- - - - - -20.)和慢性低水平炎症在肥胖个体21- - - - - -24]。此外,额外的脂肪细胞在女性被认为有助于增加基底炎症反应。然而,这种炎症不仅限于当地脂肪组织瘦素,释放到血浆,可以激活其他免疫细胞(25]。发现瘦素受体在T和B淋巴细胞,单核细胞和巨噬细胞,刺激这些遥远的免疫细胞的促炎作用12,13,26- - - - - -30.]。
而肥胖会增加一些传染病的风险,有限的或有争议的数据存在于它的作用在一个人的倾向为菌血症和败血症或细胞激素风暴的严重程度31日,32]。由于肥胖和f .土拉杆菌内激活的炎症信号通路,我们假设一个添加剂激活炎症引起的f .土拉杆菌内感染的肥胖者。这增加炎症会导致增加细胞激素风暴,因此,易感性增加f .土拉杆菌内介导的疾病。
2。材料和方法
2.1。道德声明
所有动物程序依法进行指导的护理和使用机构批准的实验室动物和动物保健和使用委员会根据协议- 201208 - 1。
2.2。动物
的同龄女性C57BL / 6 j小鼠从杰克逊实验室(巴尔港,我)购买和维护12 h光/暗周期随意获得食物和水。食源性肥胖是由于提供食物含有60%千卡从脂肪中九个星期(Envigo,休斯顿,德克萨斯州)。雌性老鼠被选为本研究由于传染性疾病和肥胖研究的过去的经验。在一本即将出版的刊物,我们发现了一个深刻的雄性和雌性老鼠的易感性的差异f .土拉杆菌内感染的独立于肥胖以及肥胖相关的信号。此外,雄性和雌性老鼠在不同的利率以及存款过多的脂肪产生深远的差异adipokine生产(33]。此外,女性增加了脓毒症严重程度和死亡率比男性(34,35]。因此,为了关注肥胖的影响,雌性老鼠被选为本研究sepsis-like疾病性更为敏感。
2.3。细菌
土拉杆菌内subspp。holarcticalv(丹尼斯Monack,斯坦福大学)在巧克力琼脂板生长24 - 48小时。盘子被刮无菌和生物收获到无菌PBS 20%甘油和储存在-80°C。浓度的解冻整除随后由串行稀释和用于所有整除。
2.4。动物感染
注射,细菌股票在无菌PBS稀释至指定的浓度。与3 - 5%异氟烷吸入麻醉小鼠皮内注射后上方的侧面季度50 ul的细菌在PBS稀释。动物监测每12小时postinfection第一48小时之后,每8小时。所有动物都重接种之前,每天早上。每兽医动物被认为是终端和人道的安乐死标准当它失去了20%的基线体重。此外,动物被检查疾病的临床症状和敦促考虑终端时昏昏欲睡,不动。
2.5。抽血
血液被画在天0 3和5从retroorbital毛细管窦感染后使用毛细管肝素化和安乐死的时候通过心脏穿刺(T)。每个动物都流血的每隔一天,交替的眼睛是用来防止过敏和眼部损伤。全血分离和等离子体冷冻直到完成后续的实验分析。
2.6。血浆细胞因子分析
细胞因子和趋化因子的浓度在受感染动物的等离子体是由多路复用ELISA (MilliPlex,微孔σ,圣路易斯,密苏里州)和分析Luminex MagPix(奥斯汀,得克萨斯州)制造商的协议。分析了动物个体在每个时间点由multiparametric t检验和分析。
2.7。实时rt - pcr
安乐死的时候,脾脏,肝脏和肺组织是收获,机械分离,在RNAlater淹没。随后,RNA提取使用RNEasy工具包(试剂盒,日耳曼敦,MD)和分析实时rt - PCR使用CYBRFast互译RT-qPCR工具包(Tonbo生物科学,圣地亚哥,CA)和StepOne实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。ΔCt值计算相比GAPDH表达水平和ΔΔCt值相比平均Ct值从感染组织和报告为褶皱变化表达式。
2.8。体外炎症试验
不灭的C57BL / 6骨髓中巨噬细胞(贝资源(NIAID)被播种在7.5 x105每口井96 -孔板的存在与否2 ug /毫升瘦素(微孔σ)。巨噬细胞是由于细菌对这些细胞的趋向性和文化的能力在体外。而f .土拉杆菌内也感染了中性粒细胞在活的有机体内中性粒细胞的寿命(12-36小时)是我们太短在体外文化模式持续~ 60小时。此外,瘦素已被证明不改变从净化后中性粒细胞炎性细胞因子的产生36]。附件隔夜后,巨噬细胞被感染感染复数(MOI) = 40 lv细菌2小时洗和添加20 ug /毫升含庆大霉素杀死细菌细胞外介质,防止过度生长的井。在所有过程中,瘦素是不断出现在媒体在适当井2 ug /毫升。细菌接种后48小时,生产感染巨噬细胞细胞因子的反应是由MilliPlex决定。
2.9。统计分析
由Mann-Whitney U组权重比较测试,而这些群体的生存曲线比较使用Mantel-Cox测试每组10 - 15的动物。血浆细胞因子水平进行了分析通过方差分析与图基的期末测验或重复抽样multiparametric t检验措施。水平的在体外炎症被Mann-Whitney U测试相比。意义决心在p≤0.05级。统计分析和图表生成使用GraphPad棱镜。
3所示。结果
后9周的高脂肪食物,雌性老鼠,平均而言,比控制老鼠正常重10克脂肪食物(图1;由Mann-Whitney U检验p < 0.0001)。小差异检测血液中水平的前20个不同的细胞因子参与各种免疫途径感染(图S1)。血清il - 6、TNF -αgm - csf, MIP-3α和il - 22生成略有升高,而IL-15强烈降低(表S1)。然而,只有观察统计上显著的差异减少sCD40L和IL-21肥胖动物的循环水平(图S2)。
精益和肥胖的雌性老鼠注射8 x105cfuf .土拉杆菌内lv (LD50女性C57BL / 6)和监控下列14天。而50%的精益动物感染中幸存了下来,没有一个肥胖的动物(图中幸存下来2(一);由Mantel-Cox p < 0.05)。每日体重测量表明,作为一个群体,肥胖老鼠多减掉了10%的体重比苗条小鼠(图2(b);由多个t p < 0.02)。减少感染剂量的f .土拉杆菌内增加在野生型瘦老鼠生存。同样,管理5 x105cfuf .土拉杆菌内(LD25)导致瘦老鼠的存活率为75%,而35%的肥胖老鼠(图幸存下来2(c);由Mantel-Cox p < 0.05)。精益和肥胖老鼠生病在这个剂量如图所示用肥胖老鼠体重损失监测体重下降7%多,然后瘦老鼠(图2(d);由多个t p < 0.05)。增加肥胖老鼠的易感性是独立于细菌负荷,为脾负担没有细菌负荷的差异(图2(e);由Mann-Whitne ns)。
f .土拉杆菌内感染导致septic-like反应的过度炎性细胞因子的生产。因此,时序分析19细胞因子和趋化因子参与炎症和免疫反应进行单独的老鼠。这表明,肥胖老鼠感染f .土拉杆菌内有明显高于血浆il - 6的水平,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α相比之下,受感染精益动物(图3、表S1;由多个t p < 0.05)。增加促炎反应证实了细胞因子mRNA转录表达在受感染的组织(图4)。表达的大部分,但不是全部,细胞因子是调节相比,肥胖瘦老鼠。特别是,il - 6的表达,干扰素-γ明显,IL-21基因调节,水平65 - 15 -,和高48-fold肥胖小鼠与精益组织相比,分别。
脂肪细胞肥大引起发病的瘦素的生产,抵抗素和脂联素。事实上,肥胖老鼠感染f .土拉杆菌内瘦素水平升高的炎症发病由多个t检验(p < 0.005)和增加产量的趋势抵抗素成为重要的时候终止(图5、表S2)。此外,有抗炎的一般抑制脂联素与瘦的动物相比,感染了肥胖小鼠炎症反应的高峰期间虽然没有达到统计学意义(表S2)。
(一)
(b)
瘦素受体表达的是几乎所有的免疫细胞和绑定的瘦素增加生产Th1和Th17反应包括il - 6、TNF -α和干扰素-γ。因此,直接影响瘦素对巨噬细胞炎症测定在体外的文化f .土拉杆菌内来华的巨噬细胞。f .土拉杆菌内触发炎症巨噬细胞培养观察到生产il - 6、il - 1β肿瘤坏死因子-α和IL-23(图6)。与其他的研究一致,瘦素与未感染的巨噬细胞在类似于等离子体浓度水平受感染的肥胖老鼠刺激温和增加这些炎性细胞因子的生产。然而,f .土拉杆菌内- - -被感染的巨噬细胞产生更高数量的IL - 6和IL -β相比之下,被感染的巨噬细胞在缺乏瘦素(图6;由Mann-Whitney t检验p < 0.03)。此外,有一个趋势增加产量的TNF -α没有达到统计学意义Mann-Whiteny t检验(p = 0.1379),而生产IL-23不变了瘦素的存在。在一起,这些数据表明,瘦素生产从肥厚性肥胖小鼠脂肪细胞导致加剧炎症加剧了致命的细胞激素风暴引起的f .土拉杆菌内和死亡的风险增加有关f .土拉杆菌内感染。
4所示。讨论
由肥胖导致的免疫功能紊乱与感染的易感性增加许多疾病(37]。然而,协会研究肥胖与脓毒症之间有好有坏的结果要么没有联系,积极的协会,或消极协会报道,综述了(38]。f .土拉杆菌内感染导致疾病通过overactivation炎症反应的细胞因子风暴,导致sepsis-like疾病(3,4]。疾病症状的副作用引起的细胞激素风暴导致严重的免疫病理反应。
而肥胖对脓毒症的影响仍有争议,瘦素在脓毒症中的有害的作用已经被记载在几项研究。欧洲跨国调查结果脓毒症发生的严重病人发现,虽然男性出现更频繁地与脓毒症(63%),女性更有可能患严重脓毒症和高死亡率(或= 1.4)(34]。此外,雌性~ 2.5倍相较于男性血清水平的瘦素(39]。瘦素是一种炎症adipokine以来,这些关联表明,瘦素可能与脓毒性症状。事实上,虽然联想研究证明没有发生败血症和瘦素之间的联系,有一个非常强大的协会之间的女性瘦素和严重脓毒症,包括死亡后住院治疗(或= 4.18)(39]。
同样,hyperleptinemia与多个传染病(敏感性增加40]。此外,瘦素在炎症中的作用和炎症条件已经在多个模型研究[41- - - - - -43]。然而,它仍然是未知的肥胖是否会影响易感性f .土拉杆菌内感染。我们的数据表明这种传染病的敏感性增加通过增强细胞激素风暴的严重程度。虽然疾病的确切机制尚不清楚f .土拉杆菌内感染,它显然是一个腐败的响应(3,4]。我们的数据表明,c反应蛋白的机制是独立于IL-6-mediated生产没有精益和肥胖之间的血清CRP水平差异受感染动物尽管不同程度的疾病(数据未显示)。
报道,这里和其他地方,幽默细胞激素风暴f .土拉杆菌内不是仅仅局限于促炎细胞因子,也包括抗炎细胞因子和趋化因子和监管。促炎和抗炎的存在/监管细胞因子是免疫失调的特点在细胞因子风暴。目前未知是否产生抗炎细胞因子或监管控制的高度炎症或其生产是否直接由感染引起。在这两种情况下,很明显,生产抗炎细胞因子和监管不足抑制或调节过度死亡前促炎反应(35]。无论如何,肥胖老鼠感染f .土拉杆菌内显示一个更强烈的细胞激素风暴在等离子体和局部组织造成增加f .土拉杆菌内易感性。
就不足为奇了肥胖小鼠发病的水平会升高与瘦老鼠相比,其生产和肥胖之间的联系已被广泛记录。然而,只有瘦素与细胞激素风暴和减少生存在我们的研究中,虽然抵抗素只是适度的影响,脂联素水平是减少肥胖动物感染,与先前的报道(20.]。事实上,在在体外试验利用孤立的巨噬细胞,增加瘦素增加了感染后促炎细胞因子的生产f .土拉杆菌内。特定的信号事件导致增加仍有待决定;然而,它是可能的,之间存在着协同JAK / STAT信号通路激活通过瘦素和inflammasome信号通路激活f .土拉杆菌内感染。
类似于先前的报道,肥胖个体水平略高的促炎细胞因子虽然没有达到统计学意义在我们的研究(44]。然而,他们明显调节刺激后(感染)引起的炎症。缺乏统计学意义可以解释为限制的敏感性分析。另外,尽管缺乏统计学意义的,这些微小的变化可能是被一个敏感的免疫系统,能够改变生物反应。无论如何,感染精益和肥胖老鼠激活炎症反应,如预期;然而,在肥胖的老鼠,许多这些相同的炎性细胞因子的水平明显高于在精益控制。
有趣的是,sCD40L和IL-21明显下调之前在肥胖小鼠血清感染。sCD40L块单核细胞激活和激活myeloid-derived抑制细胞(MDSCs)和调节性T细胞(Treg)。MDSCs和Treg函数抑制免疫反应(45]。另一方面,IL-21 pleotropic赞成和抗炎细胞因子的属性。我们预计,在这种情况下,IL-21抑制DC活化的免疫抑制功能和成熟和/或诱导il - 10的生产T细胞和B细胞(B10细胞)占主导地位46]。压制sCD40L因此IL-21将有助于增强炎症在肥胖老鼠。
如上所述,只有雌性老鼠的挑战在这项研究中由于我们过去的经验在传染性疾病和肥胖与脓毒症疾病研究和之前的关联研究[34,39]。我们的研究易感性增加有关f .土拉杆菌内疾病与炎症刺激增加了瘦素的生产。然而,由于雄性和雌性小鼠有不同数量的脂肪以及发病33- - - - - -35),男性肥胖老鼠的易感性可能不同于女性的肥胖老鼠。事实上,我们已经观察到精益男性和女性的易感性的差异f .土拉杆菌内独立的瘦素(未发表的观察)。此外,由于人类肥胖会增加炎症反应相比,精益个人(34),我们预计类似的响应在肥胖tularemic病人;然而,这仍有待确定。
在此,我们证明了肥胖病后雌性老鼠更敏感f .土拉杆菌内感染。事实上,肥胖小鼠血清炎性细胞因子水平升高了f .土拉杆菌内相对于瘦老鼠。此外,肥胖的雌性老鼠有更高水平的炎症adipokine瘦素和脂联素的抗炎adipokine程度都有所降低。在体外研究表明,暴露的巨噬细胞瘦素导致增加炎症反应f .土拉杆菌内感染巨噬细胞感染f .土拉杆菌内一个人。观察增加炎症细胞因子mRNA的增加产量受感染的组织以及血清il - 6的水平,增加干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。这些数据导致的模型中瘦素的表达激活肥厚性脂肪细胞增加免疫细胞的活化提高女性肥胖小鼠的炎症状态报告类似人类肥胖的女性(44]。这高于正常基底炎症启动免疫系统产生更强烈的幽默细胞激素风暴时f .土拉杆菌内感染。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
信息披露
内容是完全的责任作者,不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢丹尼斯Monack博士的f .土拉杆菌内lv应变本和伊娃Iniguez博士用于帮助分析协议。他们要感谢员工的血细胞计数,筛选,以及成像(CSI)核心设施,基因组分析核心设施(GACF)和生物分子分析核心设施(BACF),支持NIMHD批准号8 g12md007592,提供的服务和设施。作者感谢科学研究计划增强(上升)计划,美国批准号R25GM069621-11,寻求支持。
补充材料
补充图 :Obesity-induced等离子preinfection炎性细胞因子水平的变化。等离子体水平的20个细胞因子被多路复用ELISA分析,分析了方差分析Bonferroni期末测验。显示数据的均值和置信区间精益和肥胖的动物之间的差异组(由双向方差分析,p < 0.05)。补充图 :IL-21和sCD40L减少肥胖动物的等离子体相比,瘦老鼠。感染之前,只有IL-21和sCD40L显著改变在肥胖小鼠血浆与苗条小鼠(由Mann-Whitney t检验p < 0.05)。补充表:详细精益和肥胖动物的血浆细胞因子水平(D0)之前和之后的感染f .土拉杆菌内。(补充材料)