有机磷Pesticide-Degrading的克隆和表达α- - - - - -β水解酶基因质粒pMK-07授予对抗生素抗力移转

文摘

农业土壤中农药残留持久性选择性地增加了pesticide-degrading pesticide-degrading人口和转移基因其他人群,导致抗力移转到广泛的抗生素。降解农药的酶还可以使异化抗生素诱导基因或蛋白质结构的变化通过诱导突变。目前的工作重点是pesticide-degrading细菌隔离从农业领域发展抗力移转抗生素。这种抗力移转是通过分解代谢的基因簇存在于染色体外的质粒。一个更大的质粒(236.7 Kbp)隔绝芽孢杆菌sp.被下一代测序,测序等重要功能α- - - - - -β水解酶、DNA拓扑异构酶、DNA聚合酶IIIβ亚基,逆转录酶,质粒复制代表X,重组U,转座酶,S-formylglutathione水解酶被发现在这个质粒。在这些中,α- - - - - -β水解酶的酶以降解有机磷农药。的克隆与表达α- - - - - -β水解酶基因意味着特异性的乳沟通过抗力移转现象在宿主体内的抗生素。的对接α- - - - - -β水解酶的光谱抗生素对氯霉素显示高g值(−3.793),链霉素(−2.865),头孢噻肟(−5.885),氨苄西林(−4.316),四环素(−3.972)。本研究得出结论:连续暴露于农药残留可能导致耐多药菌株的出现在野生微生物菌群。

1。介绍

Plasmid-borne在土壤细菌耐药性及其持久性公共卫生造成很大的危害。尽管nonconjugative等遗传成分,可活动的多药耐药性质粒为(1- - - - - -3),细菌耐药性质粒DNA也带来了(4,5]。多药耐药性是很常见的在土壤细菌暴露于杀虫剂(6,7]。此外,滥用杀虫剂的好处可以代谢这些农药的微生物种群。高接触杀虫剂使细菌产生合适的酶降解的污染物。因此,pesticide-metabolizing人群倾向于生长过度(8- - - - - -10]。Pesticide-degrading细菌代谢的农药通过水解乳沟碳和能源(11,12]。通过氧化降解的农药也可能发生,还原、水解、peroxidise,或加氧酶机制13,14]。

pesticide-degrading细菌产生的酶可以分解药物和其他外源性物质。C = C键断裂的药物特异性的乳沟导致抗力移转抗生素(15,16]。这可能是一个解释关于如何受到土壤细菌耐药。先前研究甲醛的阻力肠杆菌科表明高甲醛脱氢酶活性导致多药耐药性通过特异性的活动(17,18]。进行的一项研究甲醛脱氢酶enzyme-mediated多药耐药性提供抗力移转的概念通过特异性的降解是可能的。另一项研究证明了土壤农药污染土壤的细菌产生的酶可以降低其他外源性物质(19- - - - - -21]。评估的分解性质α- - - - - -βenzyme-degrading农药水解酶,这些酶将答案是否发挥作用的多药耐药性。土壤细菌中非常普遍,适应不断变化的环境条件。进化,细菌在压力环境中往往通过诱导突变产生的酶能降解多种外源性物质(22]。

因此,本研究旨在了解细菌分离株的染色体外的质粒携带害虫的基因也赋予多药耐药性的抗力移转。在硅片分析理解抗力移转机制通过α- - - - - -β水解酶酶。

2。材料和方法

2.1。样品收集

土壤样本收集到5厘米的上层不同农药应用于农业领域位于萨勒姆区(11.7794°N, 78.2034°E),印度泰米尔纳德邦,。收集到的样本被送到实验室和储存在4°C到进一步分析。

2.2。质粒隔离和DNA测序

由于增加使用的质粒,质粒富集的样品一直酝酿以1%的农药(久效磷)中补充了两天。丰富的菌株被分离样品,发现芽孢杆菌sp。MK-07 (KU510395.1)是主要的。质粒DNA (pMK-07)被孤立的碱裂解法分离(23]。质粒plasmid-safe对待,腺苷5-triphosphate——(ATP)依赖DNase删除任何基因组DNA污染。的质粒DNA处理图书馆准备使用一个Illumina公司Nextera XT DNA库准备装备。SnapGene版本4.0.2软件被用来创建一个质粒DNA地图(24]。图书馆是测序MiSeq使用2×300个基点产生大约1 GB的数据。草案短Illumina公司的组装顺序读取(2×300 MiSeq库)进行分析以4200 -磁带站系统、欧陆坊基因组学、印度班加罗尔(美国安捷伦科技)25]。

2.3。组装的质粒DNA序列

原始数据处理使用Trimmomatic v 0.35删除适配器序列,模棱两可的读取与未知的核苷酸(读“N”大于5%),和低质量的序列(读取超过10%质量阈值(QV) < 20 phr分数)。清楚序列与一个大小为1073566(2×300个基点)高质量的阅读被保留作进一步分析和用于新创大会(2,26]。

2.3.1。基因预测和功能注释

序列预测使用缺省参数的浪子。总共225个基因预测平均基因的大小816个基点,而基因的最大和最小尺寸是15033个基点和105个基点,分别为(27,28]。基因本体论注释的预测29日基因是由Blast2GO计划(https://www.Blast2GO.com)。基因本体论作业被用来预测基因的功能进行分类。基因的功能注释进行使用BLASTx NCBI-Blast-2.3.0独立的工具的一部分。BLASTx被用来发现基因的同源序列对NR (nonredundant蛋白质数据库)蜡样芽胞杆菌(MK-07)。

2.4。系统独特的演化支和克隆α- - - - - -β水解酶基因

质粒的支架样品(pMK-07)与质粒的一致芽孢杆菌使用BlastN物种。Newick文件被下载从爆炸树视图和策划进一步使用交互式生命之树(http://itol.embl.de/upload.cgi)。根据可视化需求不同的参数调整和出口29日]。的α- - - - - -β使用gene-specific水解酶基因扩增引物设计的净底漆(总理Biosoft):α- - - - - -β水解酶MK-FP: ATGGCTAAAGAAATGTTTGTGC和MK-RP: CGCACTAACTACTACTTCTGGT。聚合酶链反应混合物(50μl)包含10μ米每个引物的PCR英杰公司主混合(PCR缓冲5 U Taq 10μBSA和2 Mμl (DNA)。热循环条件包括变性步骤在94°C 3分钟,34放大周期为1分钟94°C, 57°C 30秒和72°C 1分钟,8分钟使用一个和最后一个扩展一步埃普多夫thermocycler(股份公司22331)。电泳是持续了30分钟在100 V (Tarson电泳装置)。片段的大小决定通过比较它与1 kb标记(内)。基因产物是插入到pXcm向量使用结扎(Fermentas)酶。

的α- - - - - -β水解酶基因被释放pXcm向量使用Bam H1和后三世。的表达α- - - - - -β水解酶在大肠杆菌DH5α是通过subcloning pET-20。DNA重组转型大肠杆菌/ DH5α:pET-20b是由标准方法(30.]。初步筛选进行基于蓝白色殖民地半乳糖苷中,PCR扩增的紧随其后α- - - - - -β水解酶基因。

重组菌株的培养过夜。细胞被离心收获,α- - - - - -β水解酶是由声波降解法恢复(10 - 15分钟)。粗酶被斜率电泳凝胶电泳以及标记蛋白质(美国赛瓦),然后分析。接下来,100年μl原油酶混合1毫升30μg / ml氯霉素,其次是孵化在37°C 48小时。孵化后,代谢产物纯化有双重的乙酸乙酯,在真空条件下蒸发。提取的残留物溶解在甲醇体积的2毫升,储存在4°C到GC-FID分析。安捷伦气相色谱仪的提取进行了分析(模型7820年一系列美国)配备火焰离子化检测器(31日]。

2.5。与配体对接

的晶体结构α- - - - - -β水解酶(i6w PDB ID: 1)从蛋白质数据库中检索,和配体从PubChem下载(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound(表)PubChem ID1)。配体从PubChem检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound根据文献调查)数据库。这些化合物受到配体制备由Ligprep向导应用9.2的大师。修正如氢、2 d到3 d转换,纠正键长和键角,低能量结构、立体化学、环形构造,其次是最小化和优化的优化潜力液体模拟力场(32- - - - - -34)进行。一个构象为每个生成配位体与其他参数作为默认在大师9.2。Protein-ligand结合位点被基于种核心的依恋感的预测方法(教练)(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COACH/使用meta-server方法)。辅助配体结合位点的预测是通过使用两种比较方法,TM-SITE S-SITE,识别配位体从BioLiP蛋白质功能数据库绑定模板由binding-specific子结构和序列比较。对接进行使用滑翔软件包(http://www.schrodinger.com/),寻找有利的一个或多个典型小分子配体之间的相互作用和一个更大的受体分子,通常一种蛋白质。检索结构受到水的去除5距离,分配使用蛋白质制备向导孤对电子的原子。受体电网成立和生成指定绑定口袋使用受体配体结合的网格生成面板。分子对接的准备蛋白质和配体进行了使用滑翔。

3所示。结果与讨论

连续使用和农药在农业领域的积累导致抗力移转抗生素在土壤中的细菌的发展。质粒DNA (pMK-07)芽孢杆菌sp.测序和分析了硅片使用工具,揭示的质粒DNA序列及其亲缘导致抗力移转农药和抗生素。人口triclosan-resistant细菌显示抗抗菌药物(35,36)由于self-transmissible基因质粒和染色体之间能跳37,38)和多药耐药性基因的积累在土壤中细菌群落通过水平基因转移常见农药降能器(39,40]。因此,这些研究证明了抗力移转的现象在细菌。

3.1。质粒DNA序列

质粒pMK-07的测序芽孢杆菌物种隔绝pesticide-exposed农业土壤透露,来自6个不同菌株的基因的质粒股票蜡样芽胞杆菌(NC7401 MSX-A12 AH187、MSX-D12 IS845/00,和H3081.97),b . weihenstephanensis和肺炎链球菌。系统和系统树图分析pMK-07表明质粒股票100%的序列相似性芽孢杆菌物种(图1),序列存入基因库(KY940428.1)。

总共有225从质粒基因注释,其中221个基因核苷酸数据库中发现支安打和四个基因没有匹配数据库中的序列。基于基因本体论注释、基因的质粒是分为三个领域:生物过程,细胞组件,和分子的功能。类似的分类进行了质粒(pNUC和p11601MD),包括细胞和分子组件临床多药耐药性的基因美国沙门氏菌感染和空肠弯曲杆菌菌株11601 md (2,3)(表2)。

3.2。生物和基因的分子功能

的基因负责细菌的生物过程,包括孢子形成的基因、萌芽、sporulation-specific N-acetylmuramoyl-L-alanine酰胺酶、酸溶性小孢子蛋白C₅发芽,蛋白质-蒙古包C (x)家族蛋白被发现。这些基因使细菌抵御不利条件。必不可少的DNA重组的基因也存在于质粒:位点专一,游离酶家族,Tn1546游离酶重组蛋白质U和整合酶(蜡样芽胞杆菌)(4]。因此,不同菌株的质粒进行了随机重组芽孢杆菌sp。基因的存在如thetraG /传统的家庭、隔爆纤毛组装蛋白质,注册会计师通过结合[B决定了水平基因转移41,42]。ars R监管元素的存在意义的细菌存在的金属离子在环境43宽容对金属离子)和发展。的基因代表X在质粒质粒DNA复制而闻名。IS3的存在和IS605转座酶的家庭允许DNA介导重组和插入细菌基因组的随机序列和染色体外的质粒DNA。rna介导的DNA聚合酶(逆转录酶)基因表示的历史的参与病毒转导途径的新创质粒的一代。

质粒(pMK-07) DNA的DNA序列分析揭示了小说中基因怀有新创质粒pMK-07(图2)。以前的研究已经表明α- - - - - -β水解酶可以水解各种杀虫剂44)、谷胱甘肽S-transferases(消费税)被发现水解DDT (45,46)、有机氯和有机磷杀虫剂(47,48]。水解酶和假想的蛋白质存在于质粒表明降解质粒,尤其是杀虫剂(49]。

3.3。蜂窝组件

观察到的,大约有10%的基因存在于质粒编码膜组件。细菌拥有LPXTG锚定域和sortase酶基因,其共存肯定这个pMK-07质粒携带的细菌也可能致病(50]。

3.4。进化的新角色

杀虫剂使用的增加在农业领域作为土壤微生物菌群的进化选择压力。土壤中的细菌倾向于开发宽容通过收购新基因或从其他细菌质粒通过垂直或水平基因转移来源。令人惊讶的是,质粒携带所需的所有必要的基因生存不利或者压力条件下,这一发现已被证实c .空肠和大肠杆菌(51]。类似的观察发现在植物致病革兰氏阴性细菌感染携带基因的植物(52]。从我们的研究结果同意先前的研究。

3.5。克隆的α- - - - - -β水解酶基因

的α- - - - - -β水解酶基因克隆到pXcm(700个基点),确认他们的存在通过运行在1.0%琼脂糖凝胶。的基因的表达α- - - - - -β水解酶酶也验证了sds - page,相对应的蛋白大小45 kDa(图3)。的α- - - - - -β水解酶基因从pXcm向量然后切除subcloned pET-20b。转换后,细菌细胞筛选在磅琼脂培养基补充与氨苄青霉素、IPTG,半乳糖苷。板显示白人殖民地(转化株;宠物,α- - - - - -β水解酶质粒)挑选和加工为进一步使用。

3.6。非特异性降解氯霉素

这是预言α- - - - - -β由非特异性水解酶能降解氯霉素乳沟和打破的C = C键环结构。类似的现象在我们的研究中,观察细胞溶解产物混合时30μ氯霉素的g / ml,溶解产物降解抗生素,观察,证明通过gc - ms分析(图4)。gc - ms分析显示分解的化合物存在于宠物α- - - - - -βhydrolase-treated样本(甲烷,oxybis二氯苯酚,indole-2-one)(图5)。根据以往工作的分解能力的表征α- - - - - -β水解酶,亲核氨基酸残基的侧链酶攻击阳性碳原子的衬底(53- - - - - -55]。本研究的结果表明,这种菌株,芽孢杆菌sp。MK-07幸存下来的亚致死浓度农药、抗力移转财产可能会降低抗生素氯霉素。抗力移转机制可能是由于核糖体基因改变进化抗力移转(7]。

3.7。Protein-Ligand结合位点预测

的α- - - - - -β水解酶配体结合位点被教练预测。模板的数量随着集群大小是69,信心得分(c分数)为0.96,和绑定残留VAL9, 10, 74年瓦尔,阿拉巴马州的75年,他76年,ASP 103、133 ASP, VAL 154(表3)。

3.7.1。Protein-Ligand交互

α- - - - - -β水解酶(PDB Id: 1 i6w)停靠用抗生素(氯霉素、链霉素、头孢噻肟、氨苄青霉素和四环素)和久效磷农药使用滑翔大师9.2。识别的最佳抗生素进行基于g值和氢键的数量。类似的研究表明,亚致死的除草剂的浓度会导致多药耐药性的发展土壤细菌中(56]。由于农药的毒性,细菌产生耐药性,使它们适应此类组件(57]。

的强相互作用α- - - - - -β水解酶与氯霉素显示滑翔得分−3.793千卡每摩尔。氯霉素与ILE 12、11 g和SER 77距离为2.214和2.176,2.255,和2.430,分别在酶的活性部位(图6。一、)。在表面看来的α- - - - - -βhydrolase-chloramphenicol复杂,氯霉素用绿色突出显示(图6。I.b)。在2 d的交互α- - - - - -βhydrolase-chloramphenicol复杂,紫色的虚线表示氢键与侧链(图6。我。c和表3)。

表面的看法α- - - - - -β水解酶与链霉素显示滑翔−2.865千卡/摩尔分数和交互的链霉素ILE 12 g 13岁,他76年在活性位点(图6。II.a)。在表面看来的α- - - - - -βhydrolase-streptomycin复杂,链霉素用绿色突出显示(图6。II.b)。在2 d的交互α- - - - - -βhydrolase-streptomycin复杂,紫色的虚线表示氢键与侧链(图6。二世。c和表3)。

之间形成的相互作用α- - - - - -β水解酶和头孢噻肟滑翔得分−5.885千卡每摩尔。这种交互头孢噻肟的酶的活性部位与ASN 18和SER 77显示距离的2.077和2.022,分别(图6。III.a)。在表面的相互作用α- - - - - -βhydrolase-cefotaxime复杂,头孢噻肟在绿色(图突出显示6。III.b)。在2 d的交互α- - - - - -βhydrolase-cefotaxime复杂,紫色的虚线表示氢键与侧链(图6。三世。c和表3)。

之间形成的相互作用α- - - - - -β水解酶和氨苄青霉素滑翔得分−4.316千卡每摩尔。这种交互涉及两个羟基氢原子之间的债券氨苄青霉素ASN 18和氧原子的氨苄青霉素与爵士77年的距离(图1.987和2.1816。IV.a)。在表面看来的α- - - - - -βhydrolase-ampicillin复杂,氨苄青霉素用绿色突出显示(图6。IV.b)。在2 d的交互α- - - - - -βhydrolase-ampicillin复杂,紫色的虚线表示氢键与侧链(图6。IV.c和表3)。

之间形成的相互作用α- - - - - -β水解酶和四环素显示滑翔得分−3.972千卡每摩尔。这种交互涉及ILE 12羟基之间的债券四环素和ILE 12(图1.826的距离6。V.a)。在表面看来的α- - - - - -βhydrolase-tetracycline复杂,四环素在绿色(图突出显示6。V.b)。在2 d的交互α- - - - - -βhydrolase-tetracycline复杂,紫色的虚线表示氢键与侧链(图6。V。c和表3)。

之间的相互作用α- - - - - -β与久效磷水解酶显示滑翔得分−4.464千卡每摩尔。久效磷与ILE 12和交互爵士77年距离1.865和2.210的酶的活性部位(图6。VI.a)。在表面看来的α- - - - - -βhydrolase-monocrotophos复杂,久效磷在绿色(图突出显示6。VI.b)。在2 d的交互α- - - - - -βhydrolase-monocrotophos复杂,粉色的虚线表示氢键与侧链(图6VI.c和表3)。在这些抗生素、对接分数的基础上,可以得出结论,所有五个抗生素可以退化通过特异性的乳沟α- - - - - -β水解酶。

类似的观察在目前的研究已经证明,水解酶酶可以绑定与氯霉素和水解成无毒物质(58,59]。过多的农药的使用导致了庄稼的农药残留积累,土壤,生物圈,创造生态环境压力(60,61年]。

4所示。结论

目前的工作重点是pesticide-degrading细菌隔离从农业领域发展抗力移转抗生素。这种抗力移转是通过分解代谢的基因簇存在于一个额外染色体质粒。它可以从当前的研究结论存在土壤害虫的质粒的细菌也可以赋予抗力移转对抗生素通过自然选择对农药在农业领域积累。降解农药的酶还可以使异化抗生素诱导基因或蛋白质结构的变化通过诱导突变。因此,另一种方式来控制害虫可能为限制多药耐药性的出现铺平道路。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认Periyar大学,萨勒姆,泰米尔纳德邦,印度为一所大学研究奖学金和DST-FIST批准号浮置板轨道/ SR / LSI-640/2015 (c)。作者还要感谢SERB-DST GoI见批准号)YSS / 2014/000590提供财政支持。作者还想扩展他们的真诚感谢院长以来在沙特国王大学科研资助这个研究小组(以序列- 271)。

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