沉默几丁质酶基因易感性增加叶cinnabarinus(Boisduval)东莨菪亭

文摘

胭脂红的红蜘蛛叶cinnabarinus是一个主要的全球农作物和蔬菜植物的害虫。之前的研究表明,东莨菪亭是一个有前途的杀螨剂叶cinnabarinus。然而,东莨菪亭的杀螨机制仍不清楚。在目前的研究中,12全长cdna几丁质酶基因(芽)叶cinnabarinus(指定TcCHITs)是克隆和特征。虽然TcCHITs在所有生命阶段中都有表达,其表达水平有显著调节在幼虫和蛹的阶段。TcCHITs是表达下调24 h与东莨菪亭和调节治疗后24 h与二氟脲治疗后(足协,几丁质合成抑制剂)。双链RNA沉默TcCHIT转录的叶cinnabarinus,从而增加其对东莨菪亭但减少足协。与此同时,TcCHIT沉默在幼虫和成人导致极低的脱毛率(7.3%)和高死亡率(53.3%),分别与对照组相比。芽节肢动物生存密切相关的基因,蜕皮,和发展叶cinnabarinus,这表明杀螨东莨菪亭和德国足协的可能发生机制的抑制和激活芽基因表达,分别。TcCHIT构成了东莨菪亭和足协的一个可能的目标叶cinnabarinus。

1。介绍

食植物的螨属的叶螨和Panonychus全球主要害虫对植物(1,2]。胭脂红的红蜘蛛叶cinnabarinus是特别重要的,因为这种极端多面手物种已被记录在100多个植物物种,包括粮食和经济作物,观赏植物,杂草[3- - - - - -5]。朱砂红蜘蛛parthenogenic和展品强大的繁殖能力和适应性。这种螨虫也最难以控制的害虫之一,因为它很容易产生耐药性杀虫剂(6]。

的控制叶cinnabarinus在开放田地作物主要依赖于合成化学杀螨剂(2,7- - - - - -9]。化学杀螨剂被广泛用于控制螨害虫因其快速、高效杀螨效果(10]。然而,迅速害螨产生抗药性几乎所有的杀螨剂,呈现一个主要因素,威胁着农业害螨的有效控制(11,12]。此外,应用化学杀螨剂导致了环境和人类的健康问题13]。因此,控制螨传统化学杀螨剂已成为害虫的挑战性。有效的方法控制螨害虫和环保杀螨剂应开发。Phytogenous杀螨剂,对哺乳动物毒性低、可以迅速退化,适合螨虫综合管理。研究也表明,这些天然的产品可能会推迟害虫(杀虫剂抗性的发展14,15]。

东莨菪亭,香豆素化合物,是一种重要的次生代谢物和phytogenous杀螨剂的contact-killing,系统性,驱虫剂,产卵抑制活动叶cinnabarinus(16]。研究已经证实,东莨菪亭体现生长调节、杀虫和抗菌活性17,18]。生物功能受到东莨菪亭是归因于它的各种分子的目标,包括转录因子,生长因子,及其受体、细胞因子、酶、基因调节细胞增殖和细胞凋亡19]。因此,理解杀螨剂的作用方式是至关重要的识别分子目标(20.]。虽然东莨菪亭的杀螨活性及其可能的生化机制进行了调查,其分子机制或分子目标(s)叶cinnabarinus仍然是未知的。

甲壳素是一种聚合物β(4)有关N-acetylglucosamine,这是第二个最丰富的天然高分子纤维素之后。甲壳素广泛分布作为结构部件在节肢动物寄生虫和微生物(21,22]。甲壳素也节肢动物的外骨骼的主要结构部件和围食膜(PM)行肠道上皮和信封的内容(23]。新甲壳素沉积和合成在昆虫的生长和发育。然而,旧的角质层退化的一部分。当昆虫和螨虫处理几丁质合成抑制剂,如二氟脲(足协)和allosamidin,死亡的症状包括发展迟缓,dysecdysis和收缩24,25]。结果表明,螨虫处理东莨菪亭也表现出类似的死亡症状(图6 (c))[26]。

在节肢动物,几丁质降解途径的关键的一步是与几丁质酶(单据)。昆虫单据,这属于家族18的糖基水解酶,调节消化甲壳素通过endo-type乳沟由甲壳素水解低聚糖。单据在昆虫和螨虫的生长和发育是至关重要的,通过水解几丁质昆虫皮肤和中肠。总共16日22日20日和12芽和CHIT-like蛋白质基因已经被鉴定黑腹果蝇,冈比亚疟蚊,种有害castaneum,测定了分别为(27]。这些基因已经被分为5个或5个以上氨基酸序列相似性的基础上和系统发育分析。芽和相关蛋白质影响蜕皮,消化、细胞增殖、组织重构的螨虫和昆虫。研究表明几丁质是昆虫表皮的关键组件和点,每个时期的昆虫和螨虫的生长发育需要一定数量的几丁质(23]。芽是一种新型生物农药的安全目标,因为甲壳素缺席在动物和植物28]。芽抑制剂,如allosamidin、argifin argadin,通过抑制芽活动起到杀虫作用,干扰正常的昆虫和螨虫的生长和发育(25,29日,30.]。东莨菪亭已经报道了其杀虫和生长抑制作用小菜蛾,Spilarctia obliqua,Diabrotica甲虫(5,17,31日]。近年来,实验证据表明,东莨菪亭抑制的发展叶cinnabarinus,表明这种化合物可能影响降解甲壳素通过调节芽基因的表达(32]。

我们实验室的转录组研究叶cinnabarinus治疗后与东莨菪亭或控制溶剂(表S1和S2、职责)。有趣的是,我们观察到芽基因家族,可能参与东莨菪亭的杀螨机制叶cinnabarinus差异表达。因此,本研究旨在评估微分表达式的作用杀螨活性的芽mRNA转录东莨菪亭叶cinnabarinus利用RNA干扰(RNAi)。RNAi是一种常见的真核生物的基因沉默机制。近年来,这种技术已经显示出相当大的潜在控制害虫的基因沉默至关重要的。芽基因的功能角色种有害castaneum和Panonychus citri也使用RNAi评估,和几个芽基因被发现对昆虫的生存是必要的,蜕皮,和发展33,34),从而揭示功能专业化在芽中基因在蜕皮。因此,开发合成抑制剂,为害虫管理目标单据很重要。

在目前的研究中,12个芽基因的全长cdna叶cinnabarinus克隆和特征。基因表达模式的四个发展阶段在杀螨治疗进行了分析。我们采用了双链RNA(极)喂养基因降价策略调查单据的作用在东莨菪亭的杀螨作用和足协,几丁质合成抑制剂,反对叶cinnabarinus。这项研究表明,抑制TcCHIT转录易感性增加t . cinnabarinus向足协东莨菪亭,但可以减少。这项研究还阐明了单据的作用在东莨菪亭的杀螨机制叶cinnabarinus。

2。材料和方法

2.1。螨饲养

的叶cinnabarinus殖民地用于本研究收集的豇豆在贝贝,重庆,中国,已经维持了超过16年没有接触任何杀虫剂(35]。螨虫是盆栽豇豆幼苗长大(豇豆属unguiculata)在饲养的昆虫 °C, 50%±5% RH, 14: 10 h (L: D)光周期。

2.2。生物和RNA-seq数据

粮食及农业组织推荐slip-dip方法被用来测量东莨菪亭(纯度,95%;西南大学,贝贝,中国重庆)和足协(纯度,98.5%;Taitan、上海、中国)(图S1对成年女性)毒性叶cinnabarinus(36]。我们采用生物测定过程被叮et al。35]。总共30成年女性螨(3 - 5天)简要背上放在玻璃上双面胶带。螨虫被浸入5 s的每个测试解决方案。每个剂量进行了一式三份。使用无菌蒸馏水和0.1% (v / v)二层80和3% (v / v)丙酮被指定为控制治疗。螨虫是一个解剖显微镜下观察48 h后的控制生长条件下饲养中描述螨抚养。螨虫,表现出不动或不规则颤抖的腿被认为是死亡。致命和亚致死浓度为后续实验的基础上确定log-probit concentration-mortality数据的分析。RNA-seq转录组变化进行了分析叶cinnabarinus半数致死浓度(LC对待₅₀)的东莨菪亭和溶剂叶cinnabarinus分别为24和48 h。东莨菪亭治疗,超过300名成年女性被转移到三刚盆栽豇豆叶片,它被放置在一个小培养皿中含有水。树叶与上述浓度喷洒东莨菪亭的解决方案。无菌蒸馏水80二层的0.1%和3%丙酮作为溶剂对照组。三个培养皿中从一个独立的实验由一个复制,和两个生物复制RNA用于净化和测序。所有测序数据提交给地理网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)加入GSE92959数量(未公开的数据)。

2.3。总RNA提取,互补脱氧核糖核酸的合成,TcCHIT克隆

总RNA提取从300年成人(3 - 5天)叶cinnabarinus女性。萃取是由使用RNeasy®+微工具包(Tiangen,北京)。的吸光度来确定RNA数量、260 nm和OD的吸光度比值_260/280测量通过使用Nanovue紫外可见分光光度计(通用电气医疗集团、费尔菲尔德、CT)。RNA完整性1%琼脂糖凝胶电泳进一步得到证实。反转录是由使用PrimeScript®第一链cDNA合成装备(豆类,大连,中国)。合成cDNA储存在−20°C。获得完整的TcCHITs,具体设计并合成引物(表S3)的基础上完成从姊妹物种基因组序列测定了(http://bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/overview/Teur)。特定的聚合酶链反应(pcr)进行C1000™热循环(BIO-RAD、大力神、钙、美国)。pcr进行25μL反应体积为2.5μL 10 x PCR缓冲(毫克^{2 +}无),2.0μ2.5 L核苷酸(2.5毫米)μL MgCl₂(25毫米),1μL cDNA模板,1μ0.2 L每个引物(10毫米)μL rTaq™聚合酶(豆类)和14.8μL ddH₂o . PCR程序94°C 3分钟,其次是35周期94°C的30年代,48°C到60°C(基于引物退火温度)30年代,72°C扩展为1分钟2分钟(基于放大产品的预测长度),和最后一个扩展的10分钟72°C。放大PCR片段被使用凝胶萃取gel-purified迷你包(Tiangen,北京),结扎成pMD™19-T向量(豆类,大连,中国),然后转换成Trans5α主管细胞大肠杆菌(Tiangen,北京)。重组质粒测序的北京基因组研究所(中国,北京)。

2.4。基因鉴定和系统发育分析

的核苷酸序列TcCHITs被DNAMAN 5.2.2编辑。12芽蛋白质的推导的氨基酸序列与ClustalW程序(31日,37]。分子量和等电点的蛋白质计算通过使用ExPASy蛋白质组服务器(http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html)[38]。信号肽预测使用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalP/)[39,分析了跨膜区域使用TMHMM服务器(v.2.0) (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[40]。N糖基化位点预测使用NetNGlyc 1.0服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)[41]。系统发育树是由使用大型5.0与1000年通过neighbor-joining方法引导复制(42]。

2.5。dsRNA合成,dsRNA喂养,击倒TcCHIT表达式由RNAi

一组T7 RNA聚合酶启动子引物(表S3)是为了放大160 - 600个基点长度的目标基因生成PCR产品体外转录和dsRNA生产(表S3)。TcCHITs和绿色荧光蛋白(GFP)(ACY56286)基因被PCR扩增。PCR程序中描述的部分2。3。重组质粒被用作模板。的绿色荧光蛋白基因作为消极的控制。放大部分gel-purified和用于应用TranscriptAid T7高产转录工具包(热科学、立陶宛、欧盟)。dsrna进一步纯化用GeneJET RNA净化设备(热科学、立陶宛、欧盟)。dsRNA产品的大小是由1%的琼脂糖凝胶电泳。dsrna决心通过使用分光光度计的浓度。极是储存在−70°C。系统性的交付TcCHIT通过leaf-disc dsrna喂养击倒TcCHIT表达式。在这项研究中,调查是否击倒目标基因表达的影响通过leaf-disc喂养方法,不属预定目标的基因的转录水平相关的几丁质代谢途径两个几丁质合成酶基因(tetur03g08510 tetur08g00170,指定CHS)时发现12的混合物TcCHITdsrna应用。螨虫是用12种不同的混合物TcCHITdsrna 48 h。图S2显示了极的人工喂养的示意图。短暂,豇豆叶子被削减到喂养竞技场(直径2厘米)和脱水通过孵化60°C 3 - 5分钟。树叶被对待diethylpyrocarbonate——(DEPC)水,dsRNA -绿色荧光蛋白,或TcCHITdsrna (1000 ng /μ在室温下为3 - 4 h l)。液体完全吸收后,叶子被放置在湿滤纸。叶子光盘然后放在被水浸透的海绵。三十成年女性(3 - 5天,饥饿24 h)被放置在每个leaf-disc预处理。叶子光盘然后颠倒放在培养皿(直径7厘米)防止螨虫逃离。dsRNA-treated叶圆盘,出没叶cinnabarinus,被置于控制之下的增长条件中描述的部分2。1。螨虫终于收集了后续实验后48 h喂养。

2.6。实时定量PCR (qPCR)

检测TcCHIT表达在不同的生命阶段的螨虫,大约2000个鸡蛋,1500幼虫,800仙女,收集200名成年人每样一式三份。量化TcCHIT表达对东莨菪亭和足协曝光,我们收集了200成年女性每样一式三份。检查东莨菪亭和足协暴露的影响TcCHIT表情,成年女性服用东莨菪亭或足协,0.1% (v / v)二层80和3% (v / v)丙酮作为表面活性剂。在slip-dip化验,LC₁₀,信用证_30.,信用证₅₀东莨菪亭和信用证₅₀足协与0.099,0.374,0.938,和0.477毫克/毫升。对东莨菪亭和足协暴露实验中,我们采用了略微的修改版本leaf-disc浸渍方法所描述的米歇尔et al。43]。200多名成年女性(3 - 5天)被暂时转移到三个新盆栽豇豆叶子和水在一个小培养皿。每一个分离的豇豆叶片下降了5 s与上述浓度测试解决方案。当液体在螨干,在上述条件下他们又受到。无菌蒸馏水80二层的0.1%和3%丙酮被用作控制治疗(CK)。24小时的时间间隔后,仅存的成年女性螨治疗和控制组织收集和冻结在−RNA提取80°C。每个实验进行至少一式三份,利用独立的生物样本。检查的有效性RNAi,大约有200成年女性螨收集每个样本dsRNA喂养后48 h。样本准备一式三份。特定的引物用于qPCRTcCHITs设计通过使用引物3.0 (http://frodo.wi.mit.edu/)(表S3)[44]。RPS18(FJ608659)用作所有qPCR稳定参考基因化验(表S3)[45]。使用Mx3000P qPCR是由热循环(安捷伦科技有限公司、威明顿、数控、美国)20日μ包含1 L反应混合物μ(200 ng / L cDNA模板μL), 10μL智商™SYBR®绿色Supermix (BIO-RAD、大力神、钙、美国),1μL每个gene-specific底漆(0.2毫米),和7μL ddH₂o .优化qPCR协议用于放大2分钟95°C,紧随其后的是40变性的周期为15秒95°C, 30年代60°C, 72°C伸长30年代。融化曲线分析(从60°C到95°C)进行,以确保放大产品的一致性。分析了使用量化的表达水平方法(46]。

2.7。敏感性测试叶cinnabarinusRNAi后杀螨剂TcCHITs

亚致死剂量的东莨菪亭和足协(LC_30.和信用证₅₀东莨菪亭和足协resp)被应用于生物分析。我们也采用上述slip-dip方法和详细的生物测定过程被叮et al。35]。信用证_30.和信用证₅₀值两种杀螨剂被用作诊断剂量比较容易变化的杀螨剂叶cinnabarinus喂食后48 hTcCHIT极。

2.8。统计分析

所有实验包括至少三个生物复制。表达水平的差异TcCHITs在四个发展阶段和死亡率由单向方差分析进行了分析,其次是邓肯的多个测试在SPSS (v.16.0 SPSS Inc .,芝加哥,美国),α= 0.05。

3所示。结果

3.1。杀螨的毒性分析

表1介绍了信用证₅₀值计算对成人两种杀螨剂叶cinnabarinus。估计LC₅₀东莨菪亭和足协的值达到0.938和0.477毫克/毫升,分别。这些结果表明,足协与东莨菪亭相比表现出更显著的杀螨效率。然而,信用证₅₀东莨菪亭表示其优秀的毒性作用的植物杀螨剂。

3.2。cDNA克隆和表征TcCHITs

推导的氨基酸序列和全长cdna 12TcCHITs包含开放阅读框(orf),沉积在基因库加入数字显示表2。表2总结了推导氨基酸序列的长度,预测蛋白质分子量和理论上的等电点。发现一个信号肽的氨基端一端TcCHIT1,TcCHIT2,TcCHIT3,TcCHIT4,TcCHIT7,TcCHIT8,TcCHIT9,TcCHIT10,TcCHIT11,TcCHIT12(图1)。与此同时,TcCHIT1,TcCHIT2,TcCHIT3,TcCHIT6,TcCHIT7,TcCHIT8,TcCHIT9,TcCHIT10,TcCHIT11,TcCHIT12预测包含chitin-binding域(图1)。TcCHIT1,TcCHIT2,TcCHIT4,TcCHIT5,TcCHIT6,TcCHIT7,TcCHIT8,TcCHIT9预测包括一个催化域;TcCHIIT10由三个催化域;和TcCHIT3, TcCHIT11,TcCHIT12由两个催化领域。此外,TcCHT3,TcCHIT5,TcCHIT6都将包含一个跨膜域。这些基因,除了TcCHIT7同时也被观察到具有潜力N糖基化位点(图1)。

3.3。系统发育分析TcCHITs

系统发育分析是由使用大型5.0与最大似然法的基础上推导出的氨基酸序列TcCHITs和其他已知的芽蛋白质,包括直接同源的家庭测定了,冈比亚疟蚊,黑腹果蝇。所有芽序列,具有完整的羊痘疮,获得的测定了基因组和国家生物技术信息中心(马里兰州贝塞斯达)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)(表S4)。系统发育分析结果表明芽基因叶cinnabarinus可分为四组(图2):TcCHIT4,TcCHIT5、TcCHIT6 TcCHIT7 TcCHIT8,TcCHIT9在组我单据;TcCHT1,TcCHIT11在第二组单据;TcCHIT3, TcCHIT12在第三组单据;TcCHIT2, TcCHIT10在第四组单据。芽基因叶cinnabarinus和测定了聚集到家庭和共享一个进化枝芽(图2)。这个结果表明TcCHITs和TuCHITs进化过程相关联而可能分享相似的生理功能。

3.4。的表达模式TcCHITs在不同的发展阶段和杀螨剂治疗

qPCR进行评估TcCHIT基因表达水平在不同发展阶段(卵、幼虫、蛹和成人)和杀螨治疗。结果表明,12个芽的基因(TcCHIT1到-12)在所有生命阶段中都有表达,暗示的参与TcCHITs在生物过程在所有发展和增长阶段。具体地说,TcCHITs在幼虫和蛹的阶段中高度表达相比其他发育阶段;TcCHIT表达水平(图在鸡蛋中最低的阶段3)。统计分析表明,相对表达水平TcCHITs总计0.012,0.056,0.038,0.027,0.514,0.254,0.029,0.004,0.019,0.120,0.126,和0.004在蛋阶段;1.009,0.845,0.677,1.009,1.982,1.006,6.434,1.318,2.648,5.192,6.243,和0.650在幼虫阶段;0.745,2.130,1.583,1.024,0.834,0.672,1.730,0.078,14.873,2.902,0.981,和0.181在蛹的阶段;,0.029,0.006,0.175,0.002,0.275,0.416,1.504,0.057,0.051,1.000,1.000和0.129在成人阶段(图3)。

东莨菪亭治疗实验的结果表明,与对照组的基因相比,12个芽的基因(TcCHIT1到-12)24小时后被下调的东莨菪亭(图4)。统计分析表明,与控制(CK)的表达水平,相对表达水平TcCHITs分别为1.5,1.1,1.3,3.5,1.7,2.9,1.3,0.9,1.3,2.3,1.6,和1.7倍降低信用证₁₀剂量的东莨菪亭;1.8 - 4.8,- 2.3,- 6.0,- 1.3,12.4,2.3,7.7,5.2,6.7,3.7,和5.2倍降低LC_30.剂量的东莨菪亭;,1.4 - 1.8 - 1.1,1.7,1.2,3.2,1.1,1.0,1.7,2.9,0.9,和2.2倍降低LC₅₀剂量的东莨菪亭。然而,相对表达水平的所有12个芽基因调节和1.1,1.2,1.1,1.3,1.1,1.2,1.3,1.7,1.6 - 1.3,1.5,1.1倍高于对照(CK)与足协在LC治疗后₅₀。

3.5。通过dsRNA RNAi击倒

验证离线效应的存在,所有12芽基因的表达和2 CHS基因时发现12的混合物TcCHITdsrna应用(图)5)。信使rna的表达TcCHITs显著降低但不是的TcCHSs当TcCHITdsrna应用在螨(图在成人阶段5)。结果表明,转录水平的TcCHITs大幅下降到57.30%,53.87%,32.23%,60.37%,72.32%,61.78%,55.49%,70.14%,81.16%,51.02%,77.57%,和35.50%相比,文字记录的水平TcCHITsDEPC-water治疗后(图5)。无显著差异转录效率之间存在两个控件(水和dsGFP)(图5)。这些结果表明没有离线RNAi的影响实验研究中。在喂食后48 hTcCHITdsrna, 53.3%的螨死因为皮肤收缩或损坏(数字6 (b)和7)。相比之下,美联储螨dsGFP显示4.7%的死亡率。这些结果揭示成功击倒TcCHIT成绩单的RNAi叶cinnabarinus。

探索的生物功能TcCHITs,RNAi方法应用于击倒TcCHITs表达式在幼虫阶段。因此,在dsRNA喂养后48 h, 92.7%的螨死因为失败的脱皮或接受dysecdysis(数字8和9、职责)。相比之下,美联储螨与dsGFP展出死亡率仅为1.4%。在72 h dsRNA喂养后,剩余的螨仍未能脱毛治疗后TcCHITdsrna,而所有的螨虫对照组成功变成了仙女。在72 h dsRNA喂养后,在治疗脱毛率达到7.3%TcCHITsdsrna,总计98.6% dsGFP治疗(图9)。

3.6。敏感性测试叶cinnabarinusRNAi后杀螨剂TcCHITs

脆弱的感情在48 h后两种杀螨剂TcCHITsdsRNA喂养在成人阶段被slip-dip检测方法。TcCHITs成绩单的信用证₅₀和信用证_30.化验的东莨菪亭RNAi撞倒了叶cinnabarinus。16.92%和20.12%的死亡率显著增加美联储螨虫TcCHITs极而螨虫DEPC-water处理(图10)。矛盾的结果时生成TcCHITs成绩单的信用证₅₀和信用证_30.足协被撞倒了RNAi的化验叶cinnabarinus。死亡率大幅下降到18.43%和14.88%,美联储螨虫TcCHITs极与对待DEPC-water(图10)。死亡率无显著差异存在DEPC-water和dsRNA——之间的关系绿色荧光蛋白治疗(图10)。这些结果说明RNAi芽基因的易感性增加叶cinnabarinus东莨菪亭,但减少了足协。这些结果表明,芽基因可能起到至关重要的作用在东莨菪亭的杀螨效果和足协。

4所示。讨论

作为一种重要的植物中酚类植物抗毒素,东莨菪亭功能众多药理活性,如抗肿瘤活性。东莨菪亭会影响和破坏增长,扩散、转移,肿瘤细胞代谢和诱导细胞凋亡47,48]。然而,潜在的东莨菪亭杀螨机制作为植物的杀螨剂叶cinnabarinus仍然是未知的。

螨芽基因的识别和描述将帮助确定螨虫的单据参与反应到特定的杀螨剂。本研究的结果也将有助于我们更好地理解单据的生物功能。我们克隆和表征12长篇芽的互补叶cinnabarinus(TcCHIT1来6;王等人。26])。1993年,第一个昆虫芽基因的全长cDNA克隆和鉴定的烟草天蛾的幼虫Manduca sexta(49]。从那时起,芽各种昆虫的基因被克隆和鉴定了。的单据编码种有害castaneum被分成八组序列相似性和领域架构的基础上(50]。结构分析的TcCHITs表明这些基因具有多畴的结构组织,其中包括1 - 3催化域(GH-18域),0 - 1 cysteine-rich chitin-binding域(peritrophin-A域/ CBM-14域)和丝氨酸/ threonine-rich区域可以高度糖(图1)。TcCHITs预计将特征信号肽(TcCHT1、TcCHT2 TcCHT3、TcCHT4 TcCHT7, TcCHT8, TcCHT9, TcCHT10, TcCHT11,和TcCHT12)或跨膜(TcCHT3 TcCHT5,和TcCHT6)跨域的目标细胞外空间或排序到质膜,在这两种情况下面临碳水化合物的细胞外基质(图1)。差异在他们的领域体系结构为特定的单据显示独特的生物功能。例如,夏et al。34)报道,CHIT5,TcCHT7,TcCHT10发展阶段,这也表示,在消化旧蛹表皮扮演关键角色,翼/翅鞘扩展和蜕皮种有害castaneum,分别。

TcCHIT记录被发现在所有四个发育阶段的测试叶cinnabarinus,这表明芽基因家族中扮演一个重要的角色在整个生命周期的螨虫。然而,TcCHIT幼虫和蛹的阶段期间表达水平明显高于其他发育阶段叶cinnabarinus杨,他同意的结果et al。51]。我们目前的结果表明,芽基因家族展品的表达在不同的发展模式叶cinnabarinus。表达水平的TcCHIT9在幼虫和蛹的阶段期间大约250倍高于鸡蛋和成人阶段,而TcCHT3,TcCHT7,TcCHT10,TcCHT11约高10倍。表达水平的差异可能与芽基因的结构和功能。不同的发展模式的表达表明芽基因家族的功能专业化叶cinnabarinus在蜕皮。此外,RNAi研究种有害castaneum为不同的发展模式提供了强有力的实验证据不同芽基因的表达式,表达式(34]。

本研究的结果进一步表明,东莨菪亭曝光后24小时,TcCHIT表达水平下调,抑制的挑战TcCHIT1,TcCHT6,TcCHT7,TcCHT9,和TcCHT10表达式是更重要的比抑制剩余的芽基因叶cinnabarinus。具体来说,统计分析表明,TcCHIT表达水平下调与LC更重要_30.剂量的东莨菪亭,而不是信用证₁₀和信用证₅₀比的控制剂量的东莨菪亭。这一结果表明,使用适当的剂量的东莨菪亭可能带来的好处。这项研究还显示,TcCHITs表达水平明显下调在螨的成人阶段。以上结果表明,东莨菪亭的杀螨机制可能降解几丁质降解叶cinnabarinus通过减少芽基因表达。然而,相对表达水平TcCHIT8和TcCHT9足协治疗后显著调节(积极的控制)。多项研究表明,足协的作用机理可能发生通过直接抑制几丁质合酶活动;抑制发酵菌激活过程;激活的单据;干扰荷尔蒙平衡;干扰nerve-secreting大脑的细胞;和干扰核酸、蛋白质合成和代谢在几个不同的昆虫(52]。然而,足协的杀螨机制仍然未知。这些结果表明,TcCHITs发挥重要作用在东莨菪亭和足协的杀螨机制叶cinnabarinus。

在这项研究中,我们使用RNAi探讨螨芽基因的生物学作用叶cinnabarinus。RNAi已经成为越来越普遍的方法来降低基因表达的兴趣昆虫和螨。RNAi还包括潜在的应用在筛选和识别药品的目标。先前的研究已经表明,特定的芽基因的表达种有害castaneum可以用gene-specific RNAi显微镜下注射撞倒了化验(34]。例如,夏et al。34报道称,具体的可拆卸的CHT10成绩单的种有害castaneum,包含多个催化域、阻止胚胎孵化幼虫蜕皮,蛹化,成人的蜕变。在这项研究中,qPCR分析显示的结果TcCHIT转录水平显著下降到30% - -80%螨喂养后48 hTcCHITs极。在这项研究中,TcCHITs沉默在幼虫和成人样本导致高死亡率。这些结果不仅证明了成功dsRNA-mediated击倒TcCHITs记录还显示,适用性的RNAi通过leaf-disc dsRNA交付方法叶cinnabarinus。

多项研究表明,激活或抑制发芽杀死昆虫和螨。丁等。53报道称,死亡率m . sexta幼虫是当接受一次致死量高苏云金杆菌(Bt)毒素表达的转基因烟草行m . sexta芽(集团)。这一结果表明,过度的芽的易感性增加m .午时经一个Bt。此外,Sakuda et al。25]表明allosamidin强烈抑制昆虫单据和发挥杀虫效果通过防止蜕皮的昆虫幼虫和蛹。这些结果表明,抑制发芽会导致昆虫死亡。我们的结果表明,TcCHITs在杀螨发挥类似的作用机制的东莨菪亭和足协。的表情TcCHITs被下调后24 h东莨菪亭曝光。具体来说,当东莨菪亭易感性增加TcCHITs在信用证₅₀和信用证_30.通过RNAi化验被抑制。这些结果表明,东莨菪亭的杀螨机制可能发生的抑制芽的基因的表达。然而,TcCHIT表情是调节足协治疗后24小时。与此同时,足协敏感性下降时TcCHIT成绩单是RNAi撞倒了叶cinnabarinus。这些结果表明,足协的杀螨机制可能发生芽基因表达的激活。芽基因的功能叶cinnabarinus目前还没有报道。然而,Zhang et al。27)报道,单据是密切相关的昆虫蜕皮种有害castaneum,这表明东莨菪亭杀螨机制和足协可能防止螨虫经历破坏皮肤的正常生长和发展叶cinnabarinus。本文首次报告击倒的芽基因表达叶cinnabarinus增加对东莨菪亭,但降低足协。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

香港周和Yong-qiang张同样贡献了这个工作。香港周,Yong-qiang张,丹王,魏叮的构思和设计实验;香港周,Ting Lai Fu-you郭,Jin-lin刘翔进行了实验和分析数据;香港周、张Yong-qiang和魏丁写论文;香港周、魏丁和Yong-qiang张修改后的论文。

确认

这项研究部分的资金支持的美国国家科学基金会的中国(31272058,31272058,31601674)。

补充材料

表S1。东莨菪亭,solvent-treated螨之间的差异表达基因在RNA-seq治疗后24小时。表S2。东莨菪亭之间的差异表达基因,solvent-treated螨在RNA-seq治疗后48 h。表S3。引物用于克隆,qPCR, RNAi。表S4。系统发育分析TcCHITs序列和相关信息。图S1。化学结构的东莨菪亭(A)和二氟脲(足协)图S2。(B)。 A picture of leaf-disc mediated dsRNA feeding.(补充材料)

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