减少表达Semaphorin3A / Neuropilin-1信号在根尖牙周炎轴

文摘

根尖牙周炎(美联社)是一种慢性感染牙髓学的起源伴随着骨破坏顶端周围地区。Semaphorin3A (Sema3A)和neuropilin-1 (Nrp1)被视为一对免疫骨代谢的监管机构。在这项研究中,我们首先研究了表达式模式Sema3A / Nrp1根尖牙周炎和与骨破坏的相关性。使用大鼠动物模型,我们分析了下颌骨破坏和水平的表达Sema3A / Nrp1天0,7日,14日,21日,28日,果肉暴露后35。此外,从根尖牙周炎患者临床样本分析获得Sema3A / Nrp1的表达。这些结果表明,骨破坏水平扩展从7天到35。信使rna表达的阳性细胞的数量和水平Sema3A / Nrp1明显减少从7天到35岁,有负相关骨破坏。此外,表达Sema3A / Nrp1 AP组与对照组相比降低临床样本。总之,减少表达Sema3A / Nrp1观察根尖周的病变,可能是参与骨吸收的根尖周的区域,表明Sema3A / Nrp1可能导致根尖牙周炎的病理发展。

1。介绍

根尖牙周炎是一种牙科持久的微生物引起的炎症性疾病感染根管系统内受影响的牙齿和伴随着骨破坏顶端周围地区(1]。恢复丢失的根尖周的骨组织是牙髓学的治疗的主要挑战之一2]。牙髓学的治疗与美联社对牙齿保健的标准。然而,完整的骨愈合或减少顶端射线透射性的大小并不如预期结果发生后牙髓学的治疗。有人建议,这种不平衡的破骨细胞和成骨细胞的活性是骨质疏松的主要原因之一。先前的研究已经报道,可以抑制破骨细胞的活性,减少细胞因子参与骨质疏松的发生或发展3]。此外,还有因素有助于维护骨骼保护和促进骨形成通过刺激成骨细胞(4]。然而,研究已经证明,很难获得令人满意的结果只有抑制骨保护监测骨吸收或增加成骨细胞的骨形成(5- - - - - -7]。最初在2012年,哈亚希等人报道,Semaphorin3A (Sema3A),加上其受体neuropilin-1 (Nrp1),表现出一个重要的双重影响破骨细胞和成骨细胞8]。

Semaphorins分泌或膜结合糖蛋白家族,已经确定为关键分子在神经发生9),血管生成(10),肿瘤形成11),和免疫反应12]。Sema3A属于semaphorins八个子类之一。Sema3A的行动需要绑定到其跨膜受体,Nrp1和Plexin [13]。最近的研究表明,Sema3A会产生一个osteoprotective效应抑制监测骨吸收和增加成骨细胞的骨形成(8]。绑定的Sema3A Nrp1抑制受体激活核因子-κB配体- (RANKL)诱导破骨细胞分化的抑制immunoreceptor tyrosine-based激活主题(ITAM)和RhoA信号通路。此外,Sema3A和刺激成骨细胞通过规范化Wnt / Nrp1绑定β连环蛋白信号通路。这些报告还建议采用osteopenic表型Sema3A或Nrp1缺陷小鼠自Sema3A /轴Nrp1信号中断,所以他们不能抑制破骨细胞的分化8]。此外,减少表达成骨细胞的标记,如Runx2,发现Sema3A-deficient和Nrp1-deficient老鼠。因此,Sema3A / Nrp1信号轴是一种很有前途的骨吸收疾病新的治疗途径。此外,Sema3A / Nrp1也参与免疫反应(14已报告)和减少炎症(15,16]。然而,Sema3A / Nrp1信号的作用在炎症性骨吸收轴仍不完全清楚。

积累鼓励调查证据的潜在角色Sema3A / Nrp1在根尖牙周炎。在这项研究中,我们假设Sema3A / Nrp1信号轴将大大有助于在根尖牙周炎骨吸收。我们发现Sema3A / Nrp1的表达模式在不同的发展阶段及其与骨破坏的根尖牙周炎大鼠模型。根尖牙周炎患者临床样本也发现证实我们的动物模型结果。

2。材料和方法

2.1。诱导根尖牙周炎大鼠模型

七十二年已雄性Wistar鼠随机分为6组根据预期的疾病持续时间(0、7、14、21、28和35天),每组由12老鼠。牙科手术的腹腔麻醉下2% pelltobarbitalum钠(30毫克/公斤)进行所有的老鼠。具体地说,第一磨牙在双边下颚钻使用#牙科圆钻,直到纸浆被曝光(1/817),这被认为是第一天(0天)根尖牙周炎。十二大鼠在每组依次牺牲根据设定时间。完整的下颚脱离了老鼠。一半的样本准备microcomputed断层扫描分析和组织学评估,而其余样本存储在−80°C的定量实时聚合酶链反应分析。本研究通过中山大学动物伦理和福利委员会(批准文号IACUC - db - 15 - 1204)。

2.2。收藏的根尖周的临床患者的病变

根尖周的病变组织的顶端手术期间从根尖牙周炎患者(根尖牙周炎组、AP组)( )。根尖牙周炎患者的诊断是根据临床症状和锥形束计算机断层摄影(CBCT)考试。健康控制组织获得第三臼齿提取影响手术患者(对照组)( )。这些病人显示受影响的第三臼齿常规体检通过x光检查,但他们没有疼痛和肿胀。本研究通过光华口腔学的伦理审查委员会,中山大学(批准号erc - 2015 - 12)。书面知情同意了所有的患者参与了这项研究。样品被准备免疫组织化学和qPCR分析。

2.3。Microcomputed断层扫描(ct机)分析

下颚和4%多聚甲醛固定后的老鼠。48小时后,样品被转移到一个圆柱形试样夹(= 19毫米)ct机扫描(Scanco、Bassersdorf、瑞士)。关键参数设定在70 kV、114 mA, 20μm增量,3000毫秒积分时间。顶端病变的识别和标记根据图像的灰度值在每个部分然后重建三维图像通过图像分析软件(VGStudio MAX,海德堡,德国)。病灶体积计算评估根尖牙周炎骨破坏的程度[18]。

2.4。苏木精和伊红染色(他)

ct机扫描后,样本脱钙10%乙二胺四乙酸(EDTA)二钠盐至少2个月,然后修剪到8毫米×6毫米×4毫米块脱水,石蜡包埋。Four-micrometer-thickness串行部分被削减mesiodistal方向和沾他(19]。部分提出完整的第一选择下颌磨牙牙根组织学检查。病理评估25×以下执行放大(蔡司,大阪,日本)两个独立的调查。

2.5。Tartrate-Resistant酸性磷酸酶染色(陷阱)

陷阱染色进行估计的破骨细胞数量顶端病变使用陷阱工具包(σ,圣路易斯,密苏里州)根据制造商的指示20.]。选择五个随机领域顶端周围病变病理评估下×400放大。TRAP-positive细胞,多核(超过2核),被确认为破骨细胞。

2.6。免疫组织化学

分析的蛋白表达水平Sema3A / Nrp1和RANKL,免疫组织化学进行三个串行部分的每个样本根据先前描述的方法(21,22]。具体来说,部分在4°C孵化24小时与主要抗体:兔多克隆抗体Sema3A (Abcam 1: 500年,剑桥,英国),兔单克隆抗体Nrp1 (Abcam 1: 500年,剑桥,英国),和RANKL兔单克隆抗体(Servicebio 1: 100年,武汉,中国)。山羊anti-rabbit免疫球蛋白作为二级抗体。消极的控制是通过用磷酸盐代替主要抗体。陷阱染色病理描述评估方法也应用于免疫组织化学。

2.7。Double-Staining免疫荧光

确定特定的本地化Sema3A / Nrp1 double-staining免疫荧光进行如前所述的部分(21]。具体来说,我们使用兔子anti-Sema3A多克隆抗体(Abcam 1: 100年,剑桥,英国)作为主要的抗体,紧随其后的是第二个驴anti-rabbit免疫球蛋白G抗体(绿色)。由于没有适当的其他物种anti-Nrp1抗体可以与人体组织反应,部分是孵化兔anti-Nrp1单克隆抗体(Abcam 1: 100年,剑桥,英国)后足够的PBS洗涤。一只山羊anti-rabbit免疫球蛋白G抗体作为第二抗体(红色)。核使用试剂DAPI染色(蓝色)。分布Sema3A / Nrp1倒置荧光显微镜测定(蔡司、从、德国)×400放大。

2.8。定量实时聚合酶链反应(qPCR)

调查的表达式模式Sema3A / Nrp1根尖牙周炎在基因层面,根尖周的病变从老鼠模型,连同周围的牙槽骨的组织,在显微镜下解剖。虽然手术的临床样本分析(23]。样本之后在液氮磨成粉,和总RNA提取使用Minibest普遍RNA提取工具包(豆类生物、Ohtsu、日本)根据制造商的指示。RNA是然后reversed-transcribed cDNA使用Transcriptor第一链cDNA合成装备(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)。实时PCR进行使用光周期计480 SYBR绿色我主设备(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)。引物用于所需的序列如表所示1。Sema3A的相对mRNA表达水平和Nrp1量化而GAPDH使用方法。

2.9。统计分析

使用SPSS 13.0统计分析了Windows(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。单向方差分析分析和克鲁斯卡尔-沃利斯分析被用来测试组的差异,和Bonferroni分析应用于测试组之间的差异,其次是皮尔森和斯皮尔曼相关测试。 被认为是具有统计学意义。结果平均值±标准偏差。

3所示。结果

3.1。鼠根尖周的病变大小在不同的阶段

成功诱导大鼠根尖周的损伤,ct机的结果(如图所示的数据1(一)和3 (c))和染色(图1 (b))。根尖周的区域的面积和体积在0天是正常的类似根尖周的空间在远端第一磨牙牙根尖。0天,根尖周的地区是完好无损,没有骨吸收能被观察到。根据ct机的结果分析,病灶出现在天7(用红色标识),但未发现显著差异在0到7天( )。随着时间增加,顶端病变的体积了。病变在矢状面不断扩大,水平,日冕方向从35天14和在28天达到峰值。牙根尖周病变的膨胀率略微下降35天。然而,根尖周的病变在35天仍比那些在其他时间点( 除了28天)。数据如表所示2。

组织学分析他染色(图1 (b))显示,牙髓坏死和炎性细胞浸润与牙槽骨吸收逐渐发生在河鼠根尖周的区域。一些炎症细胞中观察到顶端组织。轻微的急性炎症细胞浸润和轻微的牙槽骨吸收是观察7天。发生严重的炎性细胞浸润在牙根尖周组织突出根尖周的骨吸收14天。慢性炎性浸润,不断扩大病变观察在21天、28天的评分。35天,大量炎症细胞渗透到牙根尖周组织,但根尖周的病变的面积有轻微下降。ct机的结果分析和他染色表明,骨的破坏是由于根尖周的炎症。

此外,使用陷阱染色观察破骨细胞在根尖周的病变(数字1 (c)和3 (c))。陷阱染色显示,几个破骨细胞在0天观察。逐渐增加破骨细胞数量的观察从7天到35 ( )。破骨细胞见顶,显示更大的细胞结构在21天。然而,没有明显差异在21天、28天的破骨细胞的数量( )。破骨细胞的数量明显减少35天( )。此外,破骨细胞RANKL提出类似的表达式模式(数据1 (d)和3 (c))。之间有显著的正相关关系RANKL-positive观察细胞和破骨细胞的数量在我们的研究( , )。数据如表所示2和3。

3.2。Sema3A / Nrp1表达减少鼠根尖周的病变

免疫组织化学染色分析显示,Sema3A-positive细胞的数量大幅减少从35天7天(数字2(一个)和3 (d))。Sema3A-positive细胞数量显著低于在其他时间点与天0 ( )。Sema3A-positive细胞的最低数量是21天。没有观察到显著差异从天14 - 35 ( )。数据如表所示2。此外,qPCR结果表明减少mRNA的表达Sema3A从7天到35(图3(一个))。有显著差异Sema3A mRNA表达第0天与其他时间点( )。Sema3A的最小可检测mRNA的表达是7天。从天14 - 35,Sema3A mRNA的表达相比略增加7天( ),但仍低于0(天 )。

结果免疫组织化学研究表明,Nrp1-positive细胞的数量显著下降在每天7比0(数据2 (b)和3 (d))。Nrp1-positive细胞数量显著低于在其他时间点与天0 ( )。与第七天相比,Nrp1-positive细胞的数量稍微增加14天、21天( )。此外,有一个28天的Nrp1-positive细胞数量减少。Nrp1-positive细胞的数量略有增加35天。数据如表所示2。此外,qPCR结果表明mRNA的表达Nrp1从天下降7 - 35(图3 (b))。有显著差异Nrp1 mRNA表达第0天与其他时间点( )。最低Nrp1 mRNA的表达在第14天。从天21到35,mRNA的表达Sema3A相比略增加14天( 一天0(相比),但仍在减少 )。

3.3。减少Sema3A / Nrp1表达与骨破坏大鼠根尖周的病变

结果表明,Sema3A-positive细胞的数量与病灶体积显著负相关(r= , ),破骨细胞的数量(r= , )和RANKL-positive细胞的数量(r= , )。关于Nrp1,有一个相对较弱的相关性Nrp1-positive细胞和病变体积,破骨细胞,RANKL-positive细胞。数据如表所示3。总的来说,这些发现表明,减少Sema3A / Nrp1表达式与破骨细胞形成和骨破坏鼠根尖周的病变。

3.4。Sema3A / Nrp1表达减少根尖牙周炎患者

评估炎症表明AP组样本显示更多的中性粒细胞,巨噬细胞,淋巴细胞浸润,血管生成的样本相比对照组(图4(一),第一个面板)。相比之下,减少数量的Sema3A / Nrp1-positive细胞中观察到AP组比对照组根据double-immunofluorescence染色(图4(一),第二个和第三个面板)。此外,qPCR结果表明mRNA的表达Sema3A / Nrp1显著减少在AP组相对于对照组( )(数据4(b)和4(c))。

4所示。讨论

根尖牙周炎是一种类型的疾病,其特征是炎症和骨破坏。骨质疏松在牙齿周围的顶端区域结果从破骨细胞的活性和抑制osteoblasts-an骨骼新陈代谢失衡。骨重塑的过程提出了包括三个阶段:骨吸收,转变,和骨形成24]。Sema3A已被确认为一种可溶性的分子能够产生双重影响成骨细胞和破骨细胞,从而导致增加骨矿物质在第三阶段的骨重塑。它也被报道,Sema3A抑制监测骨吸收,可以增加成骨细胞的骨形成8]。然而,在inflammation-derived Sema3A骨破坏的作用并不完全理解。

在我们的研究中,Sema3A的表达水平和Nrp1显著减少诱导鼠根尖牙周炎随着疾病的进展。从根尖牙周炎患者临床样本还演示了表达下调表达水平Sema3A和Nrp1根尖牙周炎相比健康控制。此外,本研究显示Sema3A / Nrp1表达与骨破坏有显著负相关。

最近的进步越来越明显,Sema3A主要产生关键影响骨内稳态通过抑制骨吸收,促进骨形成。Sema3A表达式提出了减少导致减少的趋势有效性在促进成骨细胞形成人类乳腺癌细胞的骨转移,表明减少Sema3A可能发挥重要作用在骨质疏松11]。此外,我们发现Sema3A / Nrp1表达式展品与破骨细胞的形成在根尖牙周炎显著负相关。Sema3A通常表现在骨骼组织,但RANKL偶尔等促炎细胞因子诱导的肿瘤坏死因子-α、il - 1和IL-17 [25]。研究表明,ITAM和RANKL RhoA信号通路可以被激活,导致吸收在骨骼组织8]。在根尖牙周炎,Sema3A的表达减少,随着Sema3A和Nrp1的绑定。因此,ITAM RhoA信号通路并不是有效地抑制Sema3A / Nrp1信号轴和病变将扩大随着时间的延伸。

因此,这些发现Sema3A / Nrp1差别表明,对这些可能导致增加破骨细胞活动。结合我们的研究结果,它极有可能减少Sema3A / Nrp1表达参与了骨质疏松的发生和发育过程在根尖牙周炎。

许多促炎细胞因子表达的根尖周的网站负责刺激骨吸收伴随着根尖周的炎症。最近的一项研究显示,Sema3A表达下调在类风湿性关节炎(15和炎症性肠病26),这是按照我们的结果。与此同时,研究表明,Sema3A绑定Nrp1减轻炎症和自身免疫性关节炎的进展通过减少anticollagen免疫球蛋白水平,抑制干扰素的释放γ和IL-1716),这被认为是关键在介导炎症疾病(14]。因此,我们建议Sema3A / Nrp1和炎症之间的关系是互动的。Sema3A / Nrp1表达式可以减少炎症和恶化的应用Sema3A / Nrp1可能减少顶端的炎症病变,在未来需要进一步调查。

Sema3A政府已经被证实可以防止骨质疏松,促进骨形成在几个动物模型的骨质流失条件(27]。进一步在体外研究需要确定的特定角色Sema3A Nrp1在不同类型的牙周细胞。此外,Sema3A失衡和Nrp1也可能影响根尖牙周炎的病因。进一步说明的作用Sema3A / Nrp1这种疾病可能解决生理和病理功能Sema3A / Nrp1和允许发展的根尖牙周炎的治疗的新策略。

5。结论

这项研究表明Sema3A / Nrp1表达显著减少鼠根尖牙周炎模型以及根尖牙周炎患者。减少Sema3A / Nrp1表达式可能会抑制对根尖牙周炎的病理严重程度的影响通过抑制成骨细胞,激活破骨细胞,增强炎症。

的利益冲突

作者声明没有经济利益与这篇文章的内容。

作者的贡献

应林和泉兴贡献同样这项工作。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(批准号。81300874、81470731和81602384)和中山大学青年教师培训计划(批准号15 ykpy40)。

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