Zoledronic酸调节自噬和凋亡在结肠癌细胞系CT26

文摘

Zoledronic酸(ZOL)是第三代磷酸盐,可以抑制许多肿瘤增长,特别是抑制结肠癌的发展。然而,分子机制仍然是非常神秘的。在这项研究中,我们观察到ZOL可以调节CT26结肠癌细胞自噬,促进CT26细胞凋亡,抑制CT26细胞增殖。蛋白质免疫印迹分析表明,proapoptosis caspase-3基本不变,而激活caspase-3的表达明显增加,CT26细胞后,每年服用不同剂量次唑来膦酸。免疫印迹还显示,ZOL可以显著影响p-p53的表达和autophagy-related beclin-1和p62的蛋白质。抗肿瘤效应的结论,ZOL CT26结肠癌细胞体外是通过诱导细胞凋亡和自噬调控,导致细胞增殖的抑制作用。

1。介绍

Colorectum是5全球最常见的癌症诊断的网站。结肠癌威胁着人们的健康和生活严重的发病率高达5.5%的男性和7.7%的女性在2012年在中国。作为目前治疗政权似乎不满意,探索新的治疗模式是必要的。

Zoledronic酸(ZOL)是第三代二磷酸盐(BP)分子类和一个重要的武器与骨质疏松和骨疾病(1- - - - - -4]。据报道,zoledronic酸antitumoral活动在许多人类癌症的帮助下生长因子释放,细胞粘附、细胞凋亡和自噬5- - - - - -9]。研究调查,结肠癌的发生和发展不仅是细胞的恶性转化和overproliferation有关,而且还与减少细胞凋亡和自噬10- - - - - -12]。然而,ZOL抑制结肠癌细胞生长的分子机制还不清楚。

在这项研究中,结肠癌细胞系CT26选择调查ZOL其体外增殖的影响。我们发现ZOL抑制CT26细胞生长,诱导细胞凋亡,调节自噬。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

结肠癌细胞系CT26最初来自美国类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),由本实验室保存和培养。细胞在DMEM培养基培养(Hyclone),补充10%胎牛血清(Hyclone) 5%的股份有限公司₂在37°C。

2.2。细胞生存能力分析

细胞增长指数(对数)阶段与0.25%胰蛋白酶消化和单个细胞悬液制备的解决方案。总共8×10³每口井的细胞被播种在96 -孔板24 h,然后处理,每年各种浓度次唑来膦酸(美国σ)24 h。细胞的生存能力是衡量使用商业CCK-8工具包(Dojindo、熊本、日本)通过比色法根据制造商的指示。

2.3。细胞凋亡分析

Annexin-V FITC和PI双染色设备(美国纽约表达载体,大岛)是用于分析ZOL-induced细胞凋亡。用培养基培养后包含ZOL在0μM, 1μ10米,μ米、100μ米、200μ米,300μ米24 h, CT26细胞收集和resuspended 1毫升1 x绑定缓冲溶液。以4%的多聚甲醛固定后,5μL (annexin-V FITC和500年μLπ被添加到每个管、混合,在黑暗和孵化了15分钟。细胞终于resuspended 400μL 1 x绑定缓冲。与流式细胞术检测凋亡细胞(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。

2.4。免疫印迹分析

CT26细胞处理,分别为12 h, 24小时,36小时,48 h最终浓度为200μM ZOL。然后,单独CT26细胞和胞液蛋白质提取的总。20微克(20μg)通过与polyacrylamide-SDS 12% sds - page凝胶溶解的蛋白质转移到PVDF膜紧随其后。与5%脱脂奶粉被屏蔽后的解决方案1 h,膜与Tris-buffered孵化隔夜盐水(TBS)包含anti-caspase-3 anti-c-caspase-3, anti-p-p53, anti-p62, anti-beclin-1抗体或anti-GAPDH抗体在1:1000稀释(圣克鲁斯生物技术,圣克鲁斯、钙、美国),分别然后孵化goat-anti鼠标IgG-horseradish过氧化物酶在1:1000年二次抗体(Beyotime,南通,中国)。膜是孵化与发射极耦合逻辑解决方案和开发X-ay电影。抗体带强度的anti-caspase-3、anti-c-caspase-3 anti-p-p53, anti-p62, anti-beclin-1以及anti-GAPDH各种治疗后使用灰度扫描软件进行扫描。

2.5。统计分析

实验数据统计与SAS9.0软件进行。细胞凋亡的变化进行了分析和方差分析。

3所示。结果

3.1。,每年的抑制性影响次唑来膦酸对结肠癌细胞的增殖

,每年的抑制性影响次唑来膦酸对结肠癌细胞的增殖检测到使用CCK-8工具包。结果如图1。Zoledronic酸在不同浓度造成对CT26细胞的增殖抑制作用,抑制效果与ZOL剂量的增加变得越来越明显,显示明显的剂量依赖性。结果表明,zoledronic酸体外具有明显的抗癌作用,表现出明显的剂量依赖性关系。,每年增加剂量次唑来膦酸,其抑制效果更加显著。

3.2。,每年影响次唑来膦酸对结肠癌细胞的凋亡

Annexin-V方法申请ZOL-induced凋亡的进一步调查。结果如图2;与zoledronic酸治疗CT26细胞24小时以剂量依赖性的方式诱导细胞凋亡。,每年增加剂量次唑来膦酸,细胞经历细胞凋亡的比例明显增加。

3.3。微分表达式Zoledronic Apoptosis-Related蛋白在结肠癌细胞诱导的酸

与免疫印迹检测显示,zoledronic酸造成重大影响apoptosis-related蛋白质的表达。如图3200年后,处理μM ZOL 36 h和48 h, c-caspase-3和p-p53的相对表达显著增加,表明ZOL-induced细胞凋亡是通过控制调节的激活程度caspase-3 p-p53。这是正相关的。

3.4。微分表达式Zoledronic Autophagy-Related蛋白在结肠癌细胞诱导的酸

与免疫印迹检测显示,zoledronic酸造成重大影响autophagy-related蛋白质的表达。如图4200年后,处理μ36 M ZOL 24 h, h, 48 h, p62的相对表达明显增加,而beclin-1显然是减少的表达显著增加,表明ZOL调节自噬。

4所示。讨论

Zoledronic酸具有许多药理作用包括预防溶骨的病变引起的肿瘤,减少肿瘤引起的高钙血症和直接抗肿瘤作用在体外和体内13,14]。然而,它详细的抗癌机制仍不清楚。这项研究的结果表明,在适当的剂量ZOL可以直接抑制生长和增殖,调节自噬,诱导结肠癌细胞凋亡。

肿瘤发生和转移相关的overproliferation细胞和细胞凋亡的减少,和肿瘤细胞增殖而不限制是主要特征。细胞凋亡是一个主动在基因调控的细胞死亡。深化肿瘤分子生物学的研究,人们可以了解肿瘤发生和转移也与细胞凋亡有关。因此,诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗的新方向。细胞凋亡信号通路,到目前为止,已确定,包括Fas和FasL通路、半胱天冬酶家族途径,细胞色素C信号途径和线粒体途径。半胱天冬酶家族途径是一个非常重要的凋亡信号通路。一旦激活半胱天冬酶家族的蛋白质,不可逆的蛋白质降解启动导致基质的降解蛋白质诱导细胞凋亡。Caspase-3是其中一个最重要的凋亡家族的成员,因为它是细胞凋亡的核心,可以与许多不同的底物反应。Caspase-3也是一个常见的效应细胞凋亡通路,下游调节器半胱天冬酶级联的唯一方式。Caspase-3存在于许多组织和细胞活性的发酵菌,将切成活跃的半胱天冬酶和细胞凋亡中发挥作用被不同的凋亡信号刺激后15]。P53基因起着重要的作用在防止细胞增殖和维持基因组DNA的完整性受损。的表达增加,将导致细胞凋亡直接或间接导致细胞凋亡的调节其他凋亡基因(16- - - - - -18]。因此,p53也是一个关键的分子在细胞凋亡途径。研究人员发现,caspase-3和p53在发生中发挥作用,发展和转移的结直肠癌(19]。

期间的活动caspase-3凋亡的检测是通过免疫印迹。实验证明,裂解caspase-3在细胞凋亡增加。它表明caspase-3参与结肠癌细胞凋亡的调节。可见,提高裂解caspase-3表达中发挥着重要作用ZOL诱导结肠癌细胞凋亡的过程。我们发现caspase-3蛋白质水平的增加活跃,ZOL引起的,是时间。的变化裂解caspase-3蛋白质水平促进结肠癌细胞在体外的细胞凋亡。此外,激活caspase-3作为下游蛋白质主要在细胞凋亡。我们发现CT26晚期结肠癌细胞的凋亡率与ZOL浓度呈正相关。因此,推测caspase-3表达式的增加也是吸毒者。同时,通过检测相对p53的表达,我们发现的表达显著增加曝光时间ZOL。 It shows that p53 was also involved in the regulation of cell apoptosis in colon cancer. ZOL, therefore, is likely to cause apoptosis of colon cancer cell through activating p53/caspase-3 signaling pathways. However, there are also a series of the intermediate links, which need further verification from animal.

自噬发生中发挥着重要作用,发展和转移的肿瘤。在癌症的早期阶段,自噬可以维持细胞内稳态通过移除受损的线粒体,过氧化物酶体,在正常细胞和其他细胞毒性物质,抑制致癌基因的激活和防止肿瘤的发生。先进的肿瘤中,自噬是一种重要的肿瘤细胞耐药性的原因,导致肿瘤细胞生存和在不利情况下肿瘤细胞生长促进作用,并能促进增殖和恶性肿瘤的浸润和转移。据报道,治疗结肠癌细胞的击倒autophagy-related基因或自噬抑制剂的使用将通过激活p53基因的诱导细胞凋亡和内质网压力以达到抗肿瘤效应(20.]。因此,抑制自噬可能是癌症治疗的一种有效策略。我们的实验数据表明,ZOL可以显著调节autophagy-related蛋白质的表达,和p62显然是调节的表达,而表达的beclin-1显著改变。我们的研究显示,ZOL结肠癌细胞可以调节自噬而抑制细胞增殖,表明ZOL诱发异常自噬和促进肿瘤细胞凋亡,导致抗肿瘤生物功能,这需要进一步的研究。

这些结果说明ZOL CT26结肠癌细胞是一种有效的抑制剂。其抗癌活动是由诱导细胞凋亡和自噬的调节。在这项研究中,我们只进行了体外实验,但更需要进行体内实验动物。血药浓度的进一步观察ZOL在病人的身体也需要做调查是否ZOL在这血药浓度能产生同样的影响结肠癌组织和相关的有毒副作用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了江苏省卫生部门的医学研究项目(H201430)。

引用

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