自体血小板溶解产物滴眼液的影响:一个体内共焦显微镜研究

文摘

目的。确定的有效性自体血小板溶解产物(APL)眼药水在原发性干燥综合征(SS)患者干眼,耐火材料标准疗法,患者相比,人工泪液。我们专注于APL的影响角膜形态学与体内共焦显微镜(IVCM)。方法。病人分配到两组:A组使用自体血小板溶解产物QID,和B组用不含防腐剂的人工泪液QID,为90天。眼科评估包括眼部表面疾病指数(OSDI),最佳矫正视力(BCVA) Schirmer测试、荧光素的分数,分手的时间(但)。一亚组病人组接受IVCM:角膜基底上皮,基质浅神经、朗格汉斯细胞,前基质激活,可见,反射率进行了评估。结果。60的眼睛的30个病人登记;在A组(患者)意味着OSDI,荧光素得分,但有了明显的改善与B组相比病人)。IVCM显示显著增加基底上皮细胞密度和基质浅神经丛密度和数量和朗格汉斯细胞密度减少()。结论。APL被发现有效的党卫军干眼的治疗。IVCM似乎是一个有用的工具来可视化角膜形态学的修改。

1。介绍

干燥综合征(SS)是一种多系统的慢性自身免疫性疾病,其特征是功能不良的唾液和泪腺体1]。功能障碍的发病机理是由于早期介导的外分泌腺(2]。

immune-mediate渗透的结果的泪腺的发展严重干眼综合症(DES)。

传统治疗干眼的支柱是不含防腐剂的人工滴眼剂的应用,提供润滑表面的眼睛。基于这样的理念,即炎症干眼病的发病机制中具有关键作用,不同的治疗方案,如糖皮质激素、环孢霉素作为二线治疗更严重干眼[3,4]。

然而,没有一个商用人工眼泪准备和抗炎局部治疗人类眼泪的属性。它们不包含生长因子(GFs)、转化生长因子等β(TGF -β),和其他组件,包括维生素A,纤连蛋白,和其他细胞因子,为维护正常的角膜上皮是必要的(5]。特别是,GFs刺激由诱导间充质组织愈合和上皮细胞迁移和增殖的眼部表面损伤(6]。

从血清中发现其中一些组件,和其成分非常类似于自然的眼泪,自体血清()自1984年以来一直使用7作为二线治疗干眼病。然而,其潜在的好处已经被最近的一项荟萃分析(质疑8]。

血小板阿尔法颗粒GFs的主要来源和富含血小板衍生生长因子(PDGF)中扮演着很重要的角色在维护眼部表面泪膜的稳定性。PDGF促进成纤维细胞的趋化作用、单核细胞和巨噬细胞,刺激TGF -的表达β抑制metalloproteases和减少炎症9]。这些发现提示使用富血小板血浆(PRP),富血小板血浆在生长因子(PRGF)和自体血浆富含pdgf眼药水(PRGD);事实上,最近的研究对PRP (10],PRGF [11],PRGD [12]报道的改善DES患者的客观和主观的结果。

使用体内共焦显微镜(IVCM)提供了一个全新的方法研究眼部表面,用无创高分辨率分析(13,14),使角膜损伤的定量组织病理学评估和定性评价细胞和神经属性(15- - - - - -17]。

IVCM被用来分析角膜形态学的DES和研究与临床评价的关系。形态异常出现在SS患者首次展示了2003年由Tuominen et al。18),然后确认其他作者(19,20.]。突发的角膜上皮,激活前,可见,异常基质浅神经丛描述。一些研究报道,这些异常是可逆的局部治疗hemocomponents能够恢复上皮完整性(21,22]。

在这项研究中,我们评估的有效性自体血小板溶解产物(APL)眼药水主要党卫军耐火干眼患者相比,人工免费防腐剂的泪水。我们集中在组织学的影响,APL对角膜形态改变角膜层-层分析的样例APL患者的超微结构。

2。方法

这种前瞻性病例对照研究从2014年7月到2015年5月都灵大学眼科诊所。这项研究是进行符合赫尔辛基宣言》(1964)和我们的伦理委员会批准。

2.1。患者选择

我们包括诊断SS患者根据欧美共识的分类标准1],干眼严重水平≥2(干眼严重程度分级计划,车间2007),一种眼部表面疾病指数(OSDI)≥23日和角膜荧光素染色评分≥1牛津规模。所有患者耐火材料2个多月以前的传统疗法(人工泪液、类固醇、环孢霉素A,或自体血清)。

之前我们排除眼部感染,患者角膜屈光手术或角膜移植手术,为乙型肝炎病毒阳性,丙肝病毒,艾滋病毒,和发烧,或脓毒症。血小板计数必须高于100×10³/μL和Hb > 10 g / dL。

患者登记和分配给两个小组,根据随机化标准2:1。A组患者用眼药水治疗,B组用不含防腐剂的人工泪液(0.2%透明质酸和TS-polysaccharide 0.2%)。两组治疗90天,1下降4 QID。

双眼各科检查,统计分析,双眼被选如果应对入选标准,分别进行了分析。

2.2。自体血小板溶解产物眼药水准备

撤军和APL滴眼液制备进行了血库,AOU异食癖德拉敬礼e德拉Scienza di都灵。一卷250 - 350毫升的静脉外周血从每个病人样本,根据血小板计数,Hb价值,总血容量,和临床情况;自体红细胞分开包装的全血可以被患者有轻度贫血(Hb < 11 g / dL)。CompoFlow®T & B费森尤斯公司Kabi袋,包含CPD抗凝剂,用于收集血液。血液在室温下了60分钟然后在1580 rpm离心机×8分钟(离心机Cryofuge 6000 i)获取PRP(富血小板血浆)接受了第二个离心(4000 rpm×8分钟)。PPP(血小板可怜的等离子体)浮在表面的部分移除获得血小板浓度为1.000×10³/µL±10%。PRP在室温下了30分钟,然后它被添加0.9%氯化钠盐溶液稀释直到最终浓度为50%,血小板细胞溶解,连续三次热冲击。血小板溶解产物(PL)离心机(4000 rpm×8分钟)和上层的PL涌入一个收集袋。袋子是连接到一个COL.C30(生物医学设备)装备然后整除到30无菌瓶(在生物医学设备指令),冻结在−80°C。最后的样本制备用于细菌培养(BacT /警报®),以前是负交付病人。

APL患者指示继续冻结,解冻单一剂量的前一晚,和储存白天在4°C。30单剂量的血小板溶解产物被送到A组受试者每30天。使用的时间表是两滴QID为90天。

2.3。眼科评估

之前和之后的90天的治疗,患者接受眼科评估眼表面的主观症状评估疾病的综合指数(OSDI) Schirmer测试类型我,分手时间(但是),角膜荧光素染色(牛津规模)。此外,最佳矫正视力(BCVA)是评价Snellen线条和眼睑位置不正或鳞状上皮化生以及前部和后部睑缘炎(埃夫隆规模)23),结膜折叠(LIPCOF) [24),和眼部保护指数(OPI)检查。病人然后根据干眼严重程度分级分类方案,只有那些等级≥2的人参加这项研究。

病人的检查总是由同一观察者(AV)。

疑似结膜炎,治疗被停职和微生物文化进行开出一个适当的地方治疗,和病人承担再次决议后原来的治疗。

2.4。体内角膜共焦显微镜评估

体内共焦显微镜进行了90天的治疗前后与APL患者的样本(组2)随机从受试者接受APL (a组),与海德堡视网膜层析x射线摄影机(荷尔蒙替代疗法II)结合罗斯托克角膜模块(RCM, 63 x / 0.9 W。670海里,∞/ 0;蔡司,德国Jena)和CCD相机。

每个病人的显微镜进行双眼后局部麻醉的滴剂(0.4%盐酸奥布卡因)。一滴眼凝胶(2.0 g羟丙甲纤维素)是应用于眼部表面,作为耦合介质,提高附着力的限制目的角膜接触。头部的同轴度和定位的帮助下维持一个专门的目标移动红色固定侧光的眼睛。

考试后,角膜表面的完整性控制裂隙灯和患者用药与抗生素眼药水(妥布霉素眼科溶液0.3%)。

我们检查中央角膜地区,那里的图像中层和深层上皮细胞层和前基质获得和分析。

病人的检查总是由同一观察者(电视)。

综述了所有图片,三个中心突出每个角膜扫描显微图手动选择。显微图是由一位观察家蒙面的方式评估;一系列的三个读数的平均值为每个参数记录。

评价参数包括以下:(我)基底细胞上皮细胞密度(/毫米²):基底上皮细胞层被认为是10µ米鲍曼的膜。感兴趣的计算是一个地区内进行的标准化规模(感兴趣的区域(ROI) = 100×100µ米)使用软件提供的手动细胞计数系统。系统自动计算的密度函数“细胞计数”。(2)之间的神经纤维基质浅(肾小球膜上皮的基底层,在神经纤维的平行角膜表面):它被定义为在每一帧神经分支的总和;图像的可见神经纤维数量最大的选择为每个系列的收购。只有纤维超过50岁µ米被认为和算作独立的分支。(3)神经纤维密度(µ米/ 160000μ米²):它被定义为神经纤维长度的总和(> 50µ米),被认为是在该地区的400×400μ米(0.1589毫米²定义尽可能宽的区域);这是使用函数执行测量> J组测量NeuronJ插件软件ImageJ(可用http://rsb.info.nih.gov/ij/)(图1)。(iv)激活,可见前基质密度(数量的激活,可见/毫米²):基质的激活,可见中央前被定义为hyperreflective和细胞质扩展,20µ米在鲍曼层。使用人工细胞计数的计数进行了系统提供的软件感兴趣的区域(ROI)的400×400μ米(0.1589毫米²,定义为最广泛的地区可能)。(v)前基质平均灰度值:表示,称为灰度值从0(黑色)到255(白色)在光学单元(OU),与前基质反射率,ImageJ软件(25]。(vi)朗格汉斯细胞(LCs)密度(LCs /毫米²):树突状细胞数量是手动计算在每一个角膜基质浅神经层面的部分,选择图像的LCs的密度更大。使用人工细胞计数的计数进行了系统提供的软件感兴趣的区域(ROI)的400×400μ米(0.1589毫米²,定义为最广泛的地区可能)。

2.5。统计分析

得出了人口的描述性统计、临床和实验室变量。平均值和标准偏差计算定量变量正态分布;值和差了不是正态分布定量变量和序数变量。分类变量提出了频率和百分比。

50眼的样本量计算检测OSDI干预之间的差异50%,定义显著性水平为0.05和70%的力量。

Wilcoxon测试()是用于定量连续变量和序数变量为了评估基线显著变化。的非参数Mann-Whitney测试是选择比较连续两组之间的定量变量和序数变量;确切概率法是用来比较名义分类变量在适当的地方。测试执行双边和意义是在5%的水平。数据分析使用统计软件R。

3所示。结果

从2014年7月到2015年5月,我们招募了30例(平均年龄59.5±12.2年)原发性干燥综合征(选择从一个群164年开始主要SS患者随访的风湿病学部门的AOU异食癖德拉敬礼e德拉Scienza di都灵,都灵)。A组由20例(40眼)和10 B组患者(20眼);人口特征归纳在表格1。干眼持续时间被认为是诊断的党卫军。在基线组没有显著差异()。

3.1。眼科评估

眼科的参数评估报告在表2。

没有一个学科提出了眼睑畸形和鳞状上皮化生。

意味着OSDI分数统计减少从60 A组,56±17日和69 - 21,75±9,86 90天后与APL疗法(Δ= 38,82年,值= 0.00438)。在B组,它稍微减少从60,67±16日和19日至53岁60±14日和91(Δ= 7,07年)。90天后两组之间的差异具有统计学意义(值=)(图2)。

Schirmer测试值没有显著改变90天的治疗后两组(值:0.544);然而,在A组,治疗后有所增加,但价值,而B组(值< 0.001)(图3)。

关于荧光素得分,差异意味着眼部表面染色分数治疗后两组之间有统计学意义()。90天的治疗后,80%的眼睛检查显示一个牛津评分≤1(图4)。

年底OPI值明显高于治疗A组与B组()和显著减少后睑缘炎的平均值()在A组与B组相比。

BCVA显著增加在A组90天之后,但改善并不显著相比,治疗B组(值= 0.100)。

3.2。体内共焦显微镜

体内共焦显微镜进行基线和10日90天的治疗后患者组(20眼分析);这群(组2)从a组随机排除病人被定义为子群1。表3显示没有显著差异的两个子组在基线。

治疗后,基底上皮细胞密度显著增加(值= 0.005)检测;此外,增加基质浅神经纤维的数量(值= 0.005)以及神经支配的密度的增加(值= 0.003)被发现(图5)。

灰度值的评估前基质没有任何显著的变化在90天的治疗后(值= 0.222),没有发现差异激活,可见密度的治疗时期(值= 0.976)。

最后,朗格汉斯细胞密度显著降低(值= 0.024)检测。这些研究的结果发表在表4。

4所示。讨论

虽然知识方面增加了相关的病理生理学和治疗策略的干眼病,严重干眼构成主要的管理挑战。事实上,有一大群严重干眼患者有持续的症状和体征,尽管最大的常规疗法。

炎症的重要作用干眼病的发病机制建议除了人工泪液治疗方案。局部糖皮质激素已经报告给管理改善患者的症状和体征;(26),但这些疗法不能作为长期治疗和使用需要仔细监测,由于steroid-related并发症(增加眼内压和白内障)。临床试验表明局部环孢霉素中度到重度的干眼患者是有效的,因为它能够减少炎症和增加杯状细胞密度(27- - - - - -29日]。然而,局部环孢霉素与一些副作用,如无法忍受的刺激,限制它的使用(30.]。

已经证明,减少epitheliotropic因素会导致上皮完整性的丧失和延迟愈合过程;自标准治疗DES如人工泪液,皮质类固醇,和环孢霉素不能恢复人类眼泪的女朋友自然成分,使用hemoderivatives已经得到普及。

自体血清疗法是全球公认的31日- - - - - -33),但最近总结了实用性和发表的证据与证据表明,使用基于客观测量与效果无关。这个结果可能是由于存在高水平的血清中促炎细胞因子(34]。

基于这样的理念,即血小板α颗粒是GFs的主要来源,研究兴趣已经platelet-enriched等离子体(9,35]。维生素A,血管内皮生长因子(EGF)、纤连蛋白、TGF -β和神经生长因子(神经生长因子)是必要的维护的完整性结膜和角膜完整,它已经表明,LPA富含这些GFs。一个关键的角色似乎是由TGF -β,相对于平衡T监管(Treg) / Thelper 17 (Th17)。TGF -β是一种多效性的细胞因子,可以有赞成或抗炎作用取决于上下文。已经证明,正确的Treg / Th17比率通常有助于维持免疫耐受。炎症性白细胞介素,如il - 6或IL-27,可以改变赞成Th17平衡,促进生产interleukin-17 (IL-17) [36]。TGF -β在适当的浓度,抑制Th17的启动,将Treg幼稚T细胞的抑制(37,38]。

控制症状的临床研究提供了证据和客观参数改进,减少后,如印象细胞学和但PRP和APL治疗不同的疾病,不同的剂量学或时间(10- - - - - -12]。

据我们所知,这是第一个随机前瞻性研究评估APL的有效性。我们使用了标准化OSDI调查和客观的临床措施来评估其有效性。此外,第一次,我们评估了角膜形态由IVCM APL治疗后修改。

在我们的研究中,受试者没有一个令人满意的控制与传统局部疾病的治疗取得了APL治疗后症状改善。这个改善是显著提高患者相比,撕裂的替代品。

FBUT平均,结果的平均值OPI增加患者LPA,表明更大的稳定和泪膜质量的改善。角膜染色评分明显改善,90天的治疗后80%的病人显示一位牛津分数≤1。

BCVA没有显著增加与B组相比,但改善在A组的基线被发现。它必须考虑,这些患者的视力下降可能是由于其他原因(空调方案、局部和全身性类固醇,白内障)比泪膜不稳定,因此不可逆的血小板溶解产物。它已经证明了视力Snellen图表并不是一个好的指标衡量的视觉障碍患者患上干眼病。的Hartmann-Shack aberrometry和双向aberrometry定格(光学质量分析系统)被发现在量化这些患者的视觉干扰更敏感(39]。

关于副作用,只有一个报道结膜炎与LPA病例在治疗;病人被暂时排除后,A组恢复和适当的抗生素治疗。APL具有抑菌因子(β赖氨酸、乳铁蛋白、抗体免疫球蛋白和IgA,溶菌酶),使多余的添加防腐剂;然而,所有准备交付之前进行了细菌培养。

以前IVCM研究发现在党卫军角膜形态学异常。他们描述异常上皮和间质细胞,减少角膜厚度、改变的神经数量、密度、弯曲度以及增加LCs的密度(18,19,40- - - - - -42]。

与APL 3个月的治疗后,基底层的细胞密度的增加被发现;这些发现可能是由于干细胞的迁移在部门43),试图reepithelize角膜中央部门。我们观察到完整的解决角膜上皮缺损在40%的治疗眼睛和眼睛的90%的改善。

神经元的形态学分析的图像捕获与NeuronJ IVCM和处理显示的数量和密度增加基质浅神经后3个月。这种改善可能是由于神经生长因子的直接或间接作用(神经生长因子),出现在APL。神经生长因子的生成作用神经发芽,恢复受损的神经元。即使它的使用已经显示出令人鼓舞的结果在一些工作状态由神经细胞(神经突发芽的功效44- - - - - -46],APL的机会可以确定角膜神经的再生目前讨论了文献[47]。许多作者最近观察到自体血清有效恢复神经地形通过角膜神经病变患者的神经再生21,22]。我们的研究显示了类似的结果,但有限的样本和比较评价的本质不是不允许更深入的分析因素支持这种反应。然而,实际的神经再生的主要机制仍有待确定。有可能改善上皮愈合,炎症反应,泪膜的变化可以有一个主要角色。

人们普遍知道,朗格汉斯细胞迁移是影响细胞因子和趋化因子48),显著增加LCs密度一直在观察基质浅神经丛SS患者(41]。在A组患者中,朗格汉斯细胞的密度在角膜的中心区域进行了显著降低,表明血小板溶解产物的抗炎活性。支持这个证据,表明TGF -β在合适的浓度,可以抑制居民DC成熟(49]。

激活基质,可见前基质密度和灰值(光学单元),基质反射率相对应,治疗后没有明显变化;这一发现可能是由于血小板溶解产物的生物利用度在这个级别,这是未知的,但它可能是合理的预期非常低(低于5%)。

本研究的主要局限是缺乏可重复性的评价共焦显微镜参数。在文学,国际米兰和intraobserver方差差5%25,50据报道。基于这个数据显示IVCM重复性高,我们决定不接受这种类型的分析在我们的研究中。

血液提取所需APL的数量明显高于一个准备准备(51),为了获得所需的血小板浓度。然而,血液样本收集Transfusional中心是在安全的条件下进行的异食癖德拉敬礼e德拉Scienza由技术熟练的护士和Hb值严格评估之前和之后的过程排除贫血的潜在风险。一次血液样本是在研究的开始增加病人的安慰和遵从性。生长因子的最优浓度APL尚未建立。高interpatient可变性的生长因子可以负责这种治疗的疗效差异(12]。然而,任何血液衍生物的制备并不是标准化和生长因子的浓度在任何血液衍生物并不是完全清楚。事实上,即使是被用于研究不同浓度从20到100%。最小有效浓度的自体hemoderivatives仍然是未知的,进一步的研究应解决定义这个值。

5。结论

总之,这项研究支持了假设自体血小板溶解产物眼药水主观症状和客观结果是有效的,显著的干眼的治疗,原发性干燥综合征患者。IVCM图片添加的客观性评价表明APL可以有效地恢复角膜损伤通过促进上皮和神经再生和减少朗格汉斯细胞。我们的结果鼓励使用形态学评估作为一个有用的工具在干眼的诊断和管理。

附加分

协议数量是00098937,20/9/2013。

伦理批准

伦理委员会批准日期15/09/2014。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

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