突变检测抗体产生中国仓鼠卵巢细胞系通过有针对性的RNA测序

抽象

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞已在制药工业中广泛用于生产生物治疗包括单克隆抗体（MAB）的。感兴趣的基因的完整性和遗传信息影响产品质量和病人安全继电器的准确性。在这里，我们采用下一代测序，特别是RNA-SEQ，并开发了一种方法以系统地分析产生的mAb的CHO的mRNA的细胞系的突变率。还仔细研究延长培养期的，以在制造过程中的细胞扩增的模拟物的规模，并在细胞培养物中不同的选择压力的影响。

1.介绍

下一代测序(NGS)技术的发展极大地提高了测序效率，有助于理解基因表达的动态变化[1]。随着NGS的成熟，其在生物医学研究和药物发现中的应用极大地促进了疾病相关突变的识别和针对异常表达基因产物的分子开发[2- - - - - -6]。大规模并行测序的cDNA（RNA-SEQ）相比的微阵列技术[已经彻底改变了转录研究7]。RNA-seq可以在信使RNA (mRNA)水平上对表达的基因产物进行定性和定量分析，动态范围广，灵敏度高[8]。

哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已广泛用于生产重组治疗产品，包括单克隆抗体[9,10]。这些细胞系广泛繁殖，达到大规模生产容器。用表达感兴趣基因(GOI)的质粒载体和选择标记转染宿主细胞，然后进行药物治疗和克隆选择，产生细胞系。在大规模生产过程中，冷冻库中的细胞需要扩大多次，以达到20,000升的最终体积。在整个过程中，GOI的完整性和遗传信息的准确流动对产品质量至关重要。传统上，蛋白质测序和质谱用于表征最终产品在蛋白质水平上的一致性和均匀性[11]。基于Sanger法或焦磷酸测序法的DNA测序也被用于mRNA的序列分析(通过cDNA) [12]。虽然这些哺乳动物宿主细胞中稳定地生产高质量的产品有着良好的记录，一个潜在的威胁时到最终产品的通过药物选择过程的质量，克隆过程和环境压力在延长传代的条件[13]。产品变异包括点突变可能在生产细胞的生命周期中发展。然而，由于上述传统分子生物学工具的局限性，这种风险的程度还没有完全被了解。

在这项研究中，我们探索下广泛表达重组单克隆抗体（mAb）使用RNA-SEQ技术的用于在稳定转染的CHO细胞系中的突变率的表征在体外传代。我们的目标是在不同的培养条件下转录水平在细胞群中识别和量化突变。我们首先通过混合两种稍微不同的mAb以不同比率的轻链的cDNA进行了可行性研究，并进行该混合物样品的RNA-SEQ分析。突变率的检出限是由可行性研究确定。由于突变率可能与传代的长度和潜在促有丝分裂的选择试剂，如氨甲蝶呤（MTX）的存在下，我们接下来培养的CHO细胞系连续地达成在体外细胞年龄约150岁，群体倍增水平(PDLs)。同时，也评估了增加MTX剂量对突变率的影响。我们在本研究中开发的方法将有助于确定细胞培养参数，以确保一致和可靠的产品质量。

2.材料和方法

2.1。通过基因混合可行性研究

表达具有不同的轻链人IgG两个细胞克隆（A和B）（LC）序列是从冷冻的银行解冻并培养在的α-MEM（GIBCO，目录12561）在含有10％透析的胎牛血清（FBS，SAFC，猫。12015C）和0.45％葡萄糖（Sigma，目录G8769）。细胞传代和用于RNA提取扩大。使用RNeasy试剂盒（Qiagen，目录74104。）进行RNA提取，和RNA在50洗脱 μL RNase-free水。用NanoDrop分光光度计(ND-1000, Thermo Scientific)测定RNA浓度。

采用单步RT-PCR试剂盒(Qiagen, Cat. 210212)，每个样品RNA 200 ng建立IgG轻链的RT-PCRμL反应体积。RT-PCR在应用的生物系统2720热循环器上运行，50℃孵育30分钟，95℃孵育15分钟，94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延长2分钟，最后72℃孵育10分钟。cDNA用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Cat. 28106)纯化，30 min洗脱μL EB缓冲液(10mm Tris-Cl, pH 8.5)。在NanoDrop上测定cDNA浓度。将B克隆的cDNA与A克隆的cDNA按5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%混合。将A克隆和B克隆的纯cDNA各3份及各混合物送华大基因进行rna测序。

参见补充材料中的补充信息http://dx.doi.org/10.1155/2016/8356435对于轻链和引物序列。

2.2。不同培养条件下细胞系cDNA的制备(主要研究)

Clone A, derived from a single cell, was thawed from a frozen bank at about 14 PDLs since serum-free adaptation and cultured in Ex-cell ACF CHO medium C5467 (SAFC Cat. 86016C-1000 mL) with 4 mM L-glutamine (Gibco, Cat. 25030), 1x Trace Elements A (Cellgro Cat. 99-182-C1), and 1x Trace Elements B (Cellgro Cat. 99-175-C1). Cells after thawing were termed PDL 0 and around 1 million cells were pelleted and resuspended in 350 μL RLT缓冲液与1% -巯基乙醇提取RNA。在37℃和7.5% CO条件下，在0、20或80 nM MTX (Sigma Cat. 8407)存在条件下，每3-4天以50万/mL进一步传代细胞₂。

在PDLs为0、50、100和1.5亿时，将1500万个细胞颗粒化，裂解后分成3个aliquots(除PDL 0样本在RNA水平上分成重复)，按照Qiagen协议(Qiagen RNeasy kit, Cat. 74104)提取RNA。使用高忠诚度RT-PCR试剂盒(Agilent, Cat. 600180)，使用200 ng RNA进行逆转录。热程序包括在65℃下孵育5分钟，冷却到室温5分钟，然后添加1μL 100mm二硫苏糖醇(DTT)和1μ大号AccuScript逆转录酶。的reaction was further incubated at 42°C for 30 min and stored at 4°C. Three separate reverse transcription reactions were performed for PDL 0 RNA to create replicates. cDNAs of heavy chain (HC), light chain (LC), dihydrofolate reductase (DHFR), and GAPDH were amplified via PCR using PfuUltra HF DNA polymerase (Agilent, Cat. 600380) and the following thermal cycle program: 1 min at 95°C, 30 cycles of 30 seconds at 95°C, 30 seconds at 64°C (62°C annealing was used for DHFR), and 3 min at 68°C, followed by a final 10 min incubation at 68°C. PCR products were purified using Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen, Cat. 28104). For each sample, equal-molar ratios of HC, LC, DHFR, and GAPDH were mixed to a total cDNA mass of 2.5 μg在华大基因提交RNA-seq。实验过程如图所示1。

在可行性研究中，轻链扩增片段与目标序列精确对应。在主研究中，我们对每个靶点扩增了稍大的区域，以确保感兴趣的区域在PCR引物本身的范围之外。用于映射的引用被相应地修改。

2.3。RNA-Seq

At BGI, cDNA was fragmented to an average fragment size of 170–180 bp using Covaris. On Thermomixer, these fragments were subjected to end-repair and the 3′ end was adenylated. Adaptors were ligated to the 3′ ends. The ligation products were purified on TAE-agarose gel, and ~14 rounds of PCR amplification were performed to enrich the purified cDNA template. For quality control, the library was validated on the Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer and the ABI StepOnePlus Real-Time PCR System. Qualified libraries were sequenced on Illumina HiSeq2000 and 100 Mb clean sequence data were generated for each.

有关引物序列和扩增区域的详细信息，请参阅补充信息。剔除PCR引物对应的区域进行分析。

3.结果

3.1。可行性研究

将两个表达轻链、序列相近但略有差异的克隆的cDNAs按不同比例混合，以评估NGS定量检测混合群体中突变碱基比例的能力。每个序列有714个碱基长，46个位置不同。序列排列如图S1所示。

检测从这些克隆的混合物中读取的序列片段与检测细胞培养中出现的突变是根本不同的，因为人们不会期望同时发现这么多突变。在数据分析方面，主要影响是对地图阅读能力的影响。例如，在位置80和120之间的序列中，有十多个序列差异。默认情况下，大多数短读绘图器只能在错误率小于5%的情况下可靠地进行地图读取。如果序列包括从克隆A和克隆B读取的混合物被直接映射来克隆一个引用，那么从克隆B读取的一些序列根本不会映射来克隆一个引用。这在单一位置出现突变的实际情况中是不可能发生的。为了解决这个问题，为了进行可行性研究，我们使用BWA (https://github.com/lh3/bwa;版本0.7.0;Li H.和Durbin R.(2009)使用Burrows-Wheeler变换快速和准确的短读对齐。生物信息学,25岁,1754 - 1760。[PMID: 19451168])。BWA将为每个以SAM格式读取的数据输出最佳对齐。对于从克隆A和B不同的区域读取，比对将表明映射特定于引用A或引用B。对于从克隆A和B不不同的区域读取，读取将随机分配到一个引用或另一个引用。如果46个突变中的任何一个是单独发生的，为了得到与我们期望在真实研究中发现的一致的映射，我们修改了以这种方式获得的映射如下。我们用克隆A标识符替换sam格式的对齐文件中出现的所有克隆B序列标识符，并忽略尾随标记字段。由于两个克隆之间没有插入或删除差异，因此以这种方式获得的SAM文件与单独发生突变时所获得的完全一致。 This procedure is equivalent to mapping reads to each of the clone sequences separately, determining which reference was a better fit and then translating the clone B alignments to become clone A alignments. In this case, that translation step is trivial since the two sequences differ only by substitutions. The key advantage of this approach over any single-reference mapping approach is that it eliminates the possibility of any edge effects or incorrectly induced insertions or deletions in the alignments in regions where the clones A and B sequences are significantly different. Had we used a more exhaustive approach such as a Smith-Waterman alignment of all reads to the clone A sequence, for example, the resulting alignments of reads from clone B that included significantly differing sections would have had small errors in alignment that would have confounded the analysis. Also, it is important to note that this modified alignment procedure is only relevant for the initial validation portion of this study.

除了绘图差异之外，可行性研究的分析与主要研究的分析完全一致。序列数据以FASTQ格式从华大基因接收。使用SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep;0.4版本;未发布)，并使用BWA与参考序列对齐。所有样本的轻链序列覆盖情况如图S2所示。所有实验的总体映射率非常高，一般在99%左右，读取的不匹配率非常低，通常在每90 bp读取0.2个不匹配。这表明我们在实验中几乎没有受到污染。

SAMtools程序“mpileup”(https://github.com/samtools/samtools;版本0.1.19;李,Handsaker，Wysoker A.，芬内尔T.，阮J.，荷马N.，马斯G.，Abecasis G.，和德宾R.和1000基因组计划的数据处理分组（2009）的序列比对/图（SAM）格式和SAMtools。生物信息学，25，2078-9。[PMID：19505943]）与自定义脚本一起用于提取在所述目标区域中的每个位置A，C，G和T的每个碱基的计数，以及插入和缺失的数量。插入是根据紧接在插入前述无论是被插入什么序列的碱基计数。同样，缺失归因于基被删除，而不管有多少基地被整体删除跨越。这些计数进行分层根据是否从正向或反向的方向读取与发现。以质量分数小于15个碱基在这个分析中被忽略了。此截止被选择去除的数据（通常为2-5％的碱基）的最小量，同时消除了最低质量的碱，主要是那些具有两个报告基础质量，表示定序未能调用在基位置。在每个实验中，对于在每个靶序列中的每个位置，一个优选的取向是基于确定在其上取向产生了更高的整体覆盖。 Only data from reads in the preferred orientation at each position was used to generate final results. Overall, this step has the impact of removing a small portion of very-low-quality data, at the cost of ignoring just under half of the overall sequence data, which has little impact on most positions.

这个决定仅使用数据从在一个优选的取向是由这样的事实，一些序列上下文是用于测序问题驱动读取（在多种靶向测序实验中观察到;未公开的结果）。可以从在此过程中，以库准备任何步骤，从扩增与测序本身出现的问题。这个问题往往是在富含G-地区发现的。在富含G股的读取往往有错误，而从其他C丰富链读取没有。在这种情况下，我们发现，“更好”链通常具有较高的覆盖率，大概是因为序无法产生从那个方向接受读取和/或一些基本的呼叫有低于15的临界质量分数通过应用基于覆盖范围截止，我们能够确定的“更好”链不明确偏置分析，以较低频率的效果。为了保持一致性，股线选择是一次分析的每个单元，可行性研究，主要研究制成。

一旦数据被处理为A、C、G和T的计数，每个位置的indels和deletions，我们就可以确定每个位置上每个可能的替代等位基因的一致序列和发生率。如果我们考虑为克隆一个纯粹的样本的数据参考,和任何替代等位基因观察错误,我们发现出错率在所有可能的位置,测量最常见的不同等位基因的频率在每一个位置,范围从低于0.01%的高点0.27%,有99%的可能替代等位基因出现的速度小于0.2%。完整的分布如图所示2。

为了评估数据的重复性，我们看到了使用重复实验的每一个可能的突变的明显错误率。误差与误差的两个100％克隆的参考样品与第三中的图显示了S3重复。积具有用于在每个位置，包括参考基地每个可能的碱基的点。参考基本要求近1所有悬停时有共识的基础调用所有配合到双对数情节相同的像素。通过这种方式，剧情集中在错误的碱基关注。红色，绿色，和蓝色的曲线对应于在分别为10％，1％和0.1％，表观突变率的差。使用这些图，就可以快速识别可能对应于真实的突变，并获得实验的整体噪音水平的估计任何异常。

对于这些样本，有几个点非常接近蓝色的0。1%线，但是在两种比较中都没有越过它。相反，当数据集中有一个真实的信号时，数据点应该在这个区域之外。例如，如果我们取两个0.1%的增加对照和两个0.5%的增加对照，并将它们与0%的参考对照进行比较，我们得到图S4中的图形。对应于真正的尖突突变的点被涂成红色。

我们将以信号在每个突变各掺入-在样品是在每个三次重复穗在样品和在复制参考用于相应突变观察到的平均备用等位基因率的观察到的平均备用等位基因率之间的差样本。对于这些可能的突变，我们将使用-检验，评估两组均数之间是否有统计学差异。由于所涉及的复制数量很少，因此测试结果不会被积极地使用，而是作为一个过滤器，以淘汰虚假的结果(未纠正)的0.01值截止）。

可行性研究样本的主要结果如图所示3.。我们发现，混合比例的估计是非常准确的。在阳性对照部位为0.01％，0.05％，0.1％，0.5％，1％和5％的中值信号尖峰在实验是0.017％，0.057％，0.11％，0.57％，1.1％，和5.3％， 分别。信号的范围通常为高达±2倍，但是。某些位点具有在不同的一贯较低或较高的信号估计穗中的水平，这表明可变性可能是序列依赖性的，并且可以不通过额外的测序来校正。

所有46个真阳性突变在5%、1%和0.5%的插穗水平上观察到有统计学意义。在0.1%、0.05%和0.01%的插穗水平上，观察到45/46、42/46和10/46的突变。在所有对照点(真阴性)，观察到27个假阳性。多数情况下观测信号小于0.01%，最高观测信号为0.03%。相比之下，对于阳性对照位点，在0.1%的峰值水平，观察到的最低的过量信号为0.0599%。基于这些观察，我们在主要研究中设置了以下突变检测阈值:a大于0.05%时的过量突变信号值小于。01。在可行性研究中，这些标准将产生45/46的真实阳性，在0.1%的尖峰水平，没有假阳性。一个假阴性有0.12%的明显信号，但几乎错过值截断，值为.012。因此，设计这些设置足以检测(或排除)突变的真实信号超过0.1%。

值得注意的是，这里有我们一直感兴趣的只是在更高水平的突变，在此基础上的可行性研究自然阈值将始终是所需的突变检出率的一半左右。该阈值将仍然允许所有46个测试突变完美的灵敏度，同时最大限度地减少误报率。

3.2。主要研究

我们发现，主要研究的误差轮廓与可行性研究中观察到的误差轮廓略有不同。总的来说，主要研究的误差曲线更好，所有可能的替代和indels的平均错误率为。011%，而可行性研究的平均错误率为。017%。

然而，虽然没有突变与在可行性研究的超过0.3％的背景率，有四个这样的突变主要研究，其中包括两个在1％的水平的上方。误差率之间的对应整体仍然是相当不错的整体。See the error : error plot in Figure4。更重要的是，与该研究中的重复样本相比，主要研究样本的误差分布非常一致。参见图S5中参考样本的误差:误差图。

我们又进行了分析说明。Across all nine samples covering no MTX, 20 nM MTX, and 80 nM MTX at 50, 100, and 150 PDLs, 245 mutations met the criteria established in the feasibility study for the 0.1% level. These were unevenly distributed across the samples, biased strongly toward samples with larger PDLs. The distribution of mutations is shown in Figure5。在该图中还强调是那些将在0.5％的水平已经达到了突变检测的标准突变。总共有在这个水平检测十个信号。

用相同的设置在实验中其他三个指标进行同样的分析。突变的模式是在每种情况下非常相似。在图中的曲线6显示四个被研究目标中所有可能突变的表观突变率。在这种更定量的观点中，有可能看到整个研究中错误率的完整分布。而许多突变符合统计显著性的标准(-测试值< . 01;紫色的点)，绝大多数有非常低的明显突变率。由于我们只有三份数据，因此不可能使用更严格的统计截止。然而，从这个观点中也可以看到一些总体趋势。例如，在所有四个目标中，随着PDL的增加，表观突变率的分布均匀地升高。据推测，这反映了随着时间的推移，群体积累中微小而真实的变化，尽管很少有突变符合我们的检测标准。在0.5%水平满足检测标准的特异性突变中，轻链、重链、DHFR、GAPDH中观察到的信号分别为10、17、4、0。补充信息中包含了所有四个基因的信号表。

4.讨论

在这里，我们探索了使用RNA-seq的技术在长期培养过程中生产重组抗体的CHO细胞系的检测出现突变。在可行性研究中，我们建立了0.1％，这是显著比传统的分子生物学或蛋白质鉴定技术更敏感的高可信度的突变水平检测限。通过Sanger的DNA测序突变的检测极限是约15-20％[14]。在将可行性研究与主研究进行比较时，我们注意到，通过对同一生物样本的测序复制所揭示的背景误差分布可能因批次而异。在每一批中，在每个位置的错误轮廓(无论是来自扩增，库准备，或测序本身)是非常一致的。因此，应该在每个测序批次中包含一个参考运行，并用于评估每个批次的变化。通过考虑每个位置都有一个独立的误差轮廓，我们可以隐含地解释各种各样的误差来源，而不确切地知道每个来源的贡献。

在主研究中，我们分析了表达载体导入的三个外源基因，分别是单克隆抗体的重链和轻链，以及DHFR选择标记。我们还分析了管家基因GAPDH作为一种典型的宿主内源性基因。研究表明，突变率随培养延续呈明显增加趋势。在大多数情况下，在选择压力(MTX)存在的情况下，突变率也会增加。在实际的细胞培养生产过程中，细胞接种通常需要从冷冻细胞库开始传代至少30-40个PDLs，而且常常在MTX等选择压力的作用下进行。我们的实验设计是为了充分覆盖这两种工艺条件下的制造窗口。在图6从150个PDLs开始，显著突变的数量明显增加(超过0.1%)。与此同时，在100个PDLs中，只有80 nM MTX处理的样品出现了高于0.5%的可检测突变。在任何培养条件下，管家基因GAPDH均未观察到超过0.5%的突变。这说明增加选择压力和延长传代期主要影响转基因的稳定性，而对内源宿主基因的影响最小，可能是由于对宿主的有害影响。值得注意的是，突变率可以用两种方式来描述。第一个是整个基因片段中超过0.1%检测限的突变数量。第二个是携带特定点突变的人口的百分比。在我们的研究中，这两种表现都显示了相似的趋势。

在分子水平上，在基因鉴定的突变可以归因于DNA模板突变[15，转录错误[16,17，或转录后修饰[8]。了解个体突变背后的机制需要对所有这些可能的因素进行进一步的描述，包括插入到基因组中的表达载体的DNA序列分析。此外，RNA-seq检测到的突变需要通过蛋白序列分析进行确认，以评估其对产品质量的影响。

NGS技术在细胞培养生产过程的发展中发挥着越来越重要的作用，促进了对生产细胞系的了解。应用RNA测序系统分析生产CHO细胞延长传代的突变率尚未见报道。在序列完整性方面，生产细胞系的稳定性对生物制药行业至关重要，因为携带预期转基因序列的细胞系对产品质量和患者安全至关重要。在这里，我们证明了RNA-seq可以帮助确保基因组信息准确地流向最终产品。虽然本研究以DHFR作为选择系统开发的CHO细胞系作为表征基因稳定性的模型系统，但本研究开发的方法也适用于其他生产寄主细胞系和选择方法。产生的信息将进一步促进对mRNA序列变化背后的分子机制的研究。

相互竞争的利益

两位作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

张思炎、贾森·d·休斯和尼古拉斯·穆格罗对这项工作做出了同样的贡献。

补充材料

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