文摘

调查的机制使用共焦显微镜表面发达圆锥形角膜基质瘢痕,角膜细胞密度,分布、微观形态学的角膜基质,SNP在三组被观察到。八个先进圆锥形角膜的角膜按钮被免疫组织化学检查。角膜细胞密度sub-Bowman的基质,基质前、后基质和均值SNP密度明显不同的三组中。轻度到中度的圆锥形角膜,角膜细胞激活核和相对高度反光的ECM sub-Bowman的基质,而纤维结构相对高反射在先进的圆锥形角膜前基质中可见。交替的黑暗与光明乐队的前基质轻度到中度宽圆锥形角膜组织表现出极大的可变性和方向。宽波段的本地化主要在后基质与沃格特细沟的圆锥形角膜和涉及前只在先进的圆锥形角膜基质。组织病理学、免疫原性高αsma、波形蛋白和FAP是肤浅的基质瘢痕表示在该地区。体内共焦显微镜显示keratoconic锥显微结构的变化。表面可见的激活和ECM重塑异常可能发挥关键作用的表面的基质在先进的圆锥形角膜疤痕形成。

1。介绍

圆锥角膜是一种扩张的角膜疾病特点是进步的,中央,或近中心角膜变薄,导致顶端角膜突出,不规则散光,表面疤痕形成,明显视力下降1,2]。以前的病理研究得出的结论是,潜在的异常基质修复和活性species-linked活动和这些现象之间的交互与圆锥形角膜的发展(3,4]。

角膜瘢痕是一种常见的几种形式的创伤,结果伤口,化学烧伤,感染,和屈光手术;然而,keratoconic病人没有角膜创伤,上皮缺陷,或任何炎性疾病。相反,伤口愈合和压力相关蛋白的表达改变被发现在keratoconic眼角膜5]。先前的报道表明,区域基质瘢痕和纤维化的存款laminin-5较高表达,蛋白聚糖,fibrillin-1, tenascin-C,和类型IV,七、八世胶原蛋白(5- - - - - -7]。信息几乎没有关于这个肤浅的疤痕形成,尽管有一些共焦显微镜或组织病理学研究3,8,9]。先进的圆锥形角膜患者的组织病理学检查表明,圆锥形角膜后基质保持着原状,但组织(薄片)碎片中检测出前基质(3]。此外,共焦显微镜显示重要的微观结构改变和减少在前部和后部,可见基质先进的圆锥形角膜患者(9,10]。

对圆锥形角膜表面基质瘢痕形成体外的研究受到一定的限制。轻度到中度的圆锥形角膜的管理层包括硬性透氧性隐形眼镜配件、角膜胶原蛋白交联,intrastromal角膜环段(11,12]。不认为角膜成形术作为治疗选择轻度到中度圆锥形角膜,很难收集轻度到中度圆锥形角膜体外按钮调查。共焦显微镜允许非侵入性的人类角膜在放大800倍。我们假设微观结构异常可能发生在基质和薄片在轻度到中度的圆锥形角膜角膜突出,从而导致圆锥形角膜的恶化和表面的疤痕形成。本研究的目的是探讨角膜微观结构和圆锥形角膜组织病理学变化,这可能是机械故障的重要证据,并与这些肤浅的圆锥形角膜基质瘢痕。

2。材料和方法

2.1。主题和设计

这种前瞻性和横向比较研究伦理委员会批准的山东省眼科研究所和遵循赫尔辛基宣言的原则。从每个参与者书面知情同意了。

所有患者被诊断为圆锥形角膜通过临床检查,包括裂隙灯活组织镜检查、角膜散光计,a扫描超声,角膜地形,体内激光扫描共焦显微镜。积极的圆锥形角膜的诊断是基于至少一个keratoconic特性的存在(中心或古怪的角膜基质变薄,沃格特细沟,弗莱舍戒指,或曼森的标志)和地形的发现(角膜力量包围的区域增加同心减少权力领域,inferior-superior权力不对称,一个inferior-superior折光不对称差异大于1.4度,和扭曲的最大径向轴上方和下方水平子午线)。Keratoconic眼睛分为两组基于圆锥形角膜严重程度评分(KSS)和修改Krumeich圆锥形角膜(表的分类1)[12,13]。对照组由健康个体没有圆锥形角膜的危险因素。圆锥形角膜的诊断是由彭歌曲和华高,和两个医生的一致率为100%。

排除标准如下:眼外伤的历史,以往任何眼部手术,全身或局部药物,使用任何共存角膜病理,keratoconic眼睛急性角膜水肿或穿孔,佩戴隐形眼镜,或系统性疾病的存在可能会影响角膜。

2.2。体内共焦显微镜

体内的主要激光扫描共焦显微镜是海德堡视网膜层析x射线摄影机HRT-2(海德堡工程公司、海德堡、德国);罗斯托克的角膜模块(RCM)转换成体内共焦显微镜眼睛的表面。在测量之前,1滴局部麻醉(0.5% proparacaine,爱尔康,沃思堡,TX)和1滴卡波姆眼胶(博士伦,罗切斯特,纽约,纽约)是应用。无菌和一次性有机玻璃盖上的目标。病人的下巴放在相关设备的一部分。目的是使用操纵杆放大到中央角膜。确保只有测量中央角膜被病人指导注意到一个小红灯与对侧的眼睛。集中的一点压力接触与角膜HRT-2监控使用旋转颜色光学相机。完整的中央角膜厚度或keratoconic锥的中心(在中央2毫米直径)扫描使用设备的“部分模式”。这种模式使瞬时成像的一个区域的角膜需要的深度。 All the confocal microscopic examinations were performed by the same investigator (Shuting Wang).

下面的角膜层受到体内共焦显微镜:(1)基质浅神经丛(SNP);(2)sub-Bowman基质(下面的层基质肾小球膜);(3)前基质(包括三分之一的基质层);和(4)后基质(包括三分之二的基质层)。可见的被一个半自动的细胞计数器计数。的集中层前后的可见记录。三个随机选择的图片3所需的基质层/主题进行分析,统计相比,平均。在计算框架,截断左边和底部边缘的细胞被认为是。结果外推到1毫米的一个领域²。苏格兰民族党密度使用NeuronJ评估,一个免费的半自动图像分析程序,和一个插件程序,ImageJ (http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/;2012年11月)访问。三个随机选择的图像SNP /主题进行分析,统计相比,平均。测量角膜细胞密度和SNP密度是由两个蒙面审查员(彭歌曲和Peicheng张)。

2.3。免疫组织化学

FAP的意义和波形蛋白是主要的成纤维细胞的形态特征,和波形蛋白的表达与FAP的表达。至少有三个4毫米部分被从石蜡包埋获得角膜按钮。15分钟的抗原被放进微波炉里恢复一个EDTA的解决方案。内源性过氧化物酶活动就熄了孵化的部分3%过氧化氢为5分钟。正常山羊血清用于阻止非特异性染色。随后被孵化的部分用鼠标antifibroblast激活蛋白(Abcam,香港,中国),鼠标anti-Vimentin (Abcam),和鼠标反α平滑肌肉肌动蛋白(箴言,福建,中国)60分钟37°C,一个补强剂(格言)15分钟在37°C,和HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白为30分钟37°C。过氧化物酶活性被孵化的部分在一个可视化diaminobenzidine (DAB)解决方案(格言)。消极的控制主要表现在缺乏抗体。最后,样本安装和检查用显微镜(Eclipse E800尼康,尼康,东京,日本)。

2.4。统计分析

使用SPSS 19.0统计分析(IBM)。Kolmogorov-Smirnov测试是用来评估变量的分布特征。单向方差分析测试和克鲁斯卡尔-沃利斯测试被用于比较变量之间的组。Bonferroni方法用于调整使多重比较。被认为具有统计显著性差异值小于0.05。

3所示。结果

3.1。人口资料和基线临床特点

七十的44圆锥形角膜患者从确诊病人选择圆锥形角膜在山东省眼科研究所从2012年3月至2014年10月,分为轻度到中度组(35眼)圆锥角膜和先进的圆锥形角膜(35眼)。对照组由20位志愿者招募20名健康的眼睛从医院工作人员和他们的亲属。的人口和地形特征三组如表所示2。没有统计上的显著差异在三组之间的年龄和性别分布。

使用裂隙灯显微镜,沃格特35条纹在6(17.1%)被发现眼睛有轻度到中度的圆锥形角膜和29 35(82.9%)的眼睛和先进的圆锥形角膜。弗莱舍环在13眼(37.1%)被发现有轻度到中度的圆锥形角膜和先进的圆锥形角膜33眼(94.3%)。表面的基质瘢痕中检测出与先进的圆锥形角膜(图8眼(22.9%)1),但不是在任何眼睛有轻度到中度的圆锥形角膜。以上是观察到的控件。

3.2。临床检查与体内扫描共焦显微镜

共焦显微镜结果如表所示3。的平均密度sub-Bowman基质,可见,前基质,可见,后基质,可见,基质浅神经丛有显著不同的三组中(,,,、职责)。意思是sub-Bowman基质角膜细胞密度显著低于先进的圆锥形角膜组织而不是轻度到中度圆锥形角膜组与对照组相比(和职责。)(图2(一个))。平均前基质角膜细胞密度显著低于轻度到中度的圆锥形角膜组织和先进的圆锥形角膜组与对照组相比(和职责。)(图2 (b))。平均后基质角膜细胞密度显著低于轻度到中度的圆锥形角膜组织和先进的圆锥形角膜组与对照组相比(和职责。)(图2 (c))。基质浅神经丛密度均值显著低于先进的圆锥形角膜组织而不是轻度到中度圆锥形角膜组与对照组相比(和职责。)(图2 (d))。

共焦显微镜图像显示的程度,可见的密度和微观形态学变化和SNP在三组(图3)。sub-Bowman角膜细胞密度的基质是高于前部和后部基质在所有的组。没有显著差异sub-Bowman基质的角膜细胞密度之间的控制和轻度到中度圆锥形角膜组织,但是一个明显的减少,可见的先进的圆锥形角膜组织(图3可见(C1))与其他群体相比(数字3(A1)和3(B1))。高度反光的,边界清晰,紧密排列,可见细胞核的可视化在sub-Bowman基质的控制,和纤维母细胞的细胞质族群,他们生产的胶原纤维(图无法察觉3(A1))。轻度到中度的圆锥形角膜组织,可见与激活核和胞质过程产生了网络出现在sub-Bowman基质。激活核支单独和不容易识别,和细胞质过程也超过正常,可见(图3(B1))。此外,可见细胞质较少流程和激活核降低了先进的圆锥形角膜组织(图中的分支3(C1))。

前基质中,可以看到一个明显的降低,可见轻度到中度和先进的圆锥形角膜组与控件(数据相比3(A2),3(B2),3(C2))。前,可见轻度到中度的圆锥形角膜组织sub-Bowman一样的外观,可见,和较低的角膜细胞密度和高度反光的细胞质和细胞外基质(ECM)检测与控制(图3(B2))。先进的圆锥形角膜的前基质组有hyperreflective存款,与表面的角膜瘢痕。在这个区域,角膜细胞细胞核清晰可见(图3(C2))。

在基质后,发现角膜细胞密度的下降趋势(数据3(A3),3(B3),3(C3))。交替黑暗与光明乐队是可见的前部和后部与圆锥形角膜基质的眼睛。前基质,更广泛和更常规的乐队提出了先进的圆锥形角膜组比轻度到中度圆锥形角膜组织(数字3(B2)和3(C2))。条纹的数量和变化后基质中先进的圆锥形角膜组大于轻度到中度圆锥形角膜组织(数字3(B3)和3(C3))。乐队的方向是变量之间的患者,主要是在一个大约垂直方向后基质。

共焦显微镜图像的例子SNP的控制,轻度到中度圆锥形角膜,和先进的圆锥形角膜组织如图4。正常的神经纤维的控制主要有厚,通常拉长,高度反光的结构,和一些神经纵横交错成几个小枝(图4(一))。轻度到中度圆锥角膜患者,神经纤维增厚,突出的外观,如过度的分支,卷曲,甚至封闭循环,但没有显著差异在SNP密度与控制(图4 (b))。苏格兰民族党密度在先进的圆锥形角膜组明显低于控制和轻度到中度的圆锥形角膜组织。神经纤维短,出现中断,并剪断(图4 (c))。

3.3。免疫组织化学

八keratoconic角膜按钮从8先进圆锥形角膜表面基质瘢痕患者进行免疫组织化学染色,和疤痕区域表示高免疫原性的成纤维细胞激活蛋白(FAP)、波形蛋白,α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)(数据5和6)。可见分散FAP和波形蛋白的表达在圆锥形角膜患者的角膜,表面的基质,观察FAP和波形蛋白的过度表达(图5)。的意义αsma表达是myofibroblasts的主要形态特征;然而,有高表达αsma只在表面的基质(数字5和6)。

4所示。讨论

表面发达圆锥形角膜基质瘢痕通常被观察到,它严重影响视力,不规则散光增加,甚至导致治疗的失败硬性透氧性隐形眼镜(14]。根据先前的病理研究,tenascin、laminin-5 perlecan, VII型胶原蛋白表达在更大程度上在临床和组织学上伤痕累累圆锥形角膜(6),但很少有调查关于表面基质瘢痕的机制(5,7]。体内共焦显微镜的帮助下,我们进行了本研究探讨连续显微结构的变化圆锥形角膜表面和潜在机制基质瘢痕患者健康的眼角膜,轻度到中度圆锥形角膜,和先进的圆锥形角膜。

随着圆锥形角膜的发展,可见经历重大的改变。角膜细胞是一种扁平细胞位于缺口平行排列的片晶的合成和维护,负责胶原原纤维和细胞外基质。通常作为一个不活跃的间充质细胞,可见粗加工的静止表型没有异常刺激,反射和清晰可见的细胞核与体内共焦扫描显微镜可见。共焦显微镜的一些研究中,患者的角膜细胞密度圆锥形角膜被发现明显低于正常对照组,并减少在前基质,可见与疾病严重程度的指标(8,10,15]。我们的研究有不同的研究结果与之前的研究相比。sub-Bowman我们没有发现不同密度的基质,可见轻度到中度圆锥角膜患者和对照组之间有显著差异的形态学变化sub-Bowman基质,可见,支细胞核、细胞质和增加的过程,表明这些可见被激活。与静止,可见相反,单独活动角膜细胞核不太容易确定。的激活外观可见暗示一个待定的损害可能刺激纤维细胞转化为成纤维细胞和诱导成纤维细胞的有丝分裂。

先前的研究表明,减少,可见在圆锥形角膜和角膜细胞合成的不平衡导致的损失基质和减少角膜生物力学8- - - - - -10,16]。Keratoconic锥可能与一个待定异常角膜力学性能(17),如角膜变薄和扩张,造成的损失基质片晶(3,18]。通过粘性抗拉强度测试,道森等人发现,前40%的中央角膜基质是最强的地区的一个正常的角膜,后20%是最弱的地区19]。因此,我们得出这样的结论:后角膜最薄弱的地区,可能比前角膜忍受小得多的张力。临床上,温和的圆锥形角膜的杰出表现后角膜表面经常向前突出显著超过使用角膜地形[观看前角膜表面时20.]。在我们的研究中,广泛交流黑暗与光明乐队首次发现患者有轻度到中度的圆锥形角膜后基质的利用共焦显微镜和终于发现在前和后基质的先进的圆锥形角膜患者。这些发现可能与角膜生物力学分布和显著减少在先进的圆锥形角膜角膜生物力学。此前报道,交替黑暗与光明乐队代表折叠基质片晶的21),因此改变乐队的分布的位置和阶段支持断言异常的生物力学属性首先发生在后基质。

温顺的et al。22),通过同步x射线散射,纤维的检测系统的调整。这可能表示高度的国际米兰,intralamellar位移和滑移,这可能是由凝聚力量的丧失和机械故障,导致中央角膜变薄和角膜曲率的变化有关。一起后角膜表面,突出前胶原经受越来越紧张,这可能导致异常紧张滑移,折叠,甚至破裂前胶原蛋白片晶。我们假设这个损坏前胶原蛋白片晶可能导致可见的激活,这是与表面的基质瘢痕的形成密切相关。产生的胶原纤维与体内共焦显微镜,可见是不可见的,所以我们无法检测的直接证据的滑移或破裂前胶原蛋白片晶。然而,一个重要的发现对SNP的改变在我们的研究中间接支持我们的假设。我们发现神经纤维增厚,突出的外观,如过度的分支和卷曲,甚至中断,这可能是由于在圆锥形角膜的角膜生物力学改变,基质片晶的褶皱和断裂等。Parissi et al。23)报道,圆锥形角膜的特点是逐步减少神经密度和神经形态学改变,尽管CXL治疗。此外,据报道,前胶原蛋白片晶被干扰所观察到的组织病理学和x射线散射技术(4,17,24]。薄片的滑移,特别是前基质片晶,可能刺激静止,可见变化和激活成纤维细胞,因此相应的高反射图像sub-Bowman圆锥形角膜,可见。在这个过程,机械故障刺激可能是一个角膜细胞激活的关键调节器。

胶原纤维和片晶的变化可以促进静止的变换,可见成纤维母细胞和myofibroblasts,修复,可见的表型(25]。来验证是否按照我们的假设,可见被激活,我们评估肝纤维化的属性在伤痕累累圆锥形角膜使用免疫组织化学。波形蛋白和FAP提供角膜细胞激活的迹象αsma是疤痕形成的标志。我们发现αsma、波形蛋白和FAP突出表达了,αsma只是表面的基质中高度表达。这些发现表明,可见在圆锥形角膜活性广泛,和纤维化的形成来源于myofibroblasts在表面的基质。激活,可见异常可能会导致重构在圆锥形角膜,导致表面发达圆锥形角膜基质瘢痕的形成。

目前的研究涉及到圆锥形角膜的不同阶段,所以我们有一个近似地平线圆锥形角膜的微观结构变化的发展,除了病人戴隐形眼镜。半自动的细胞和神经计数器可能有未指明的测量错误,这可能是减少重复和单盲测量。我们观察到在圆锥形角膜角膜细胞激活,通过组织病理学检查证实它,但我们不知道角膜细胞起始因子的激活。一项研究[7)报道,从上皮生长因子可能诱导纤维断裂后的伤口愈合反应肾小球层。排除epithelial-stromal交互的扰动,纵向调查在圆锥形角膜角膜细胞功能受到机械刺激是必须的,而这些可能揭示更多洞察这个假定的协会。

5。结论

微观结构异常中发现keratoconic锥显示滑脱,折叠,甚至前片晶的断裂和减少圆锥形角膜生物力学强度的发展。所有这些异常改变进一步鼓励角膜细胞活化和转化为成纤维细胞,甚至myofibroblasts,导致ECM重塑异常和肤浅的基质瘢痕的存在。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81370989和81370989),中国国家基础研究计划(2013 cb967004),青岛科技项目(13 - 1 - 4 - 169 - jch),泰山学者计划,和山东省优秀创新团队项目。作者感谢林萍她编辑援助。